种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

利用核糖体基因进行申克孢子丝菌基因分型

目的 利用探针与DNA印迹法对申克孢子丝菌进行种内分型,探讨其基因型特征与菌种来源及临床表现的关系.方法 CTAB法提取来源于不同地区31株孢子丝菌临床分离株及1株标准株的基因组DNA,以真菌通用引物ITS4、NS5扩增标准株的rDNA序列作为探针,与经限制性内切酶ApaI酶切后的基因组DNA进行印迹杂交.结果 杂交后形成多种清晰而稳定的带型,根据带型将31株孢子丝菌分为15种基因型(A-O型),其中A、B、C三型占51.61%.结论 探针与DNA印迹法是孢子丝菌种内分型较为敏感而可靠的方法,该方法所分基因型的不同与菌种的地区来源及临床表现有一定的相关性.     

12株马内菲青霉随机扩增DNA多态性研究

目的 了解马内菲青霉的基因学特征,为该菌的DNA分型提供依据。方法 采用氯化苄提取法提取基因组DNA.用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对12株临床分离的马内菲青霉菌株进行DNA指纹图谱分析。结果 ①共选用40个随机引物进行扩增,筛选出4个具有稳定、清晰DNA扩增带型的引物。即引物P₂₃:5'-AGTCAGCCAC-3',P₁₀₃:5'-AGACGTCCAC-3',P₁₀₅:5'-AGTCGTCCCC-3',P₁₂₀:5'-GGGAGACATC-3'.②12株菌株DNA图谱主要带型相同,扩增片段呈多态性。相似率44.4%～97.3%.③12株菌可分5个不同的组群。结论 RAPD技术可以用于马内菲青霉的基因分型。     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

艾滋病合并马尔尼菲青霉病11例临床分析

目的 探讨11例艾滋病合并马尔尼菲青霉病患者的临床特征.方法 对2002-2004年来我院住院和门诊就诊的11例艾滋病合并马尔尼菲青霉病患者的一般资料、临床表现、体征、实验室检查进行分析.结果 11例患者中男9例,女2例,临床症状除非特征性的表现如发热、消瘦、贫血、肝脾淋巴结肿大外,8例合并有皮疹;3例有消化道症状,其中2例腹痛,1例腹泻、排红色湖状便:1例吞咽困难,进食梗阻感;5例有呼吸系统症状;1例关节痛;2例合并口腔念珠菌感染、4例骨髓、1例痰、1例血涂片、8例皮疹刮片或分泌物涂片、2例淋巴结和皮肤病理活检切片中可见成堆的PAS染色阳性的圆形或腊肠形分隔孢子.11株分离株经形态学、培养皆证实为马尔尼菲青霉,其中4株分离株经DNA分析证实为马尔尼菲青霉.结论 艾滋病患者机会性感染中马尔尼菲青霉病的临床表现多样,且多伴有皮疹.     

应用PCR技术快速诊断马尔尼菲青霉

采用特异性引物和聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，检测６株临床分离的马尔尼菲青霉、２株竹鼠体内分主了的马尔尼菲青霉，及其它致病真菌、细菌、人白细胞系ＤＮＡ。结果（１）８株马尔尼菲青霉的２５℃菌丝相、３７℃酵母相ＤＮＡ均可扩增３４７ｂｐ的特性片段，而其它致病真菌、细菌、人白细胞ＤＮＡ无特性片段扩增。（２）５株马尔尼菲青霉２５℃连续传１０代，其中一株发生变异，５０株马尔尼青霉均可扩增出特性片段。（３）敏感性     

广东省15例马尔尼菲青霉病临床分析

目的 分析广东省马尔尼菲青霉病的发病情况、临床特征、诊断要点、治疗及预后。方法 对1988-2003年发生于广东的15例马尔尼菲青霉病患者的一般资料、临床表现、体征、实验室检查特点及治疗反应和预后进行分析。结果 15例患者中男10例,女5例;发病者没有一定的职业区别,但并发艾滋病患者多为司机和无业人员。13例伴发有各种免疫缺陷的基础病,如艾滋病、结缔组织病、肾移植等。临床症状多种多样,主要为发热、消瘦、皮疹、呼吸系统症状等。皮损组织切片可见成堆的PAS染色阳性的圆形或腊肠形孢子。15例患者中4例为皮肤限局性感染,11例为系统性感染;9例死亡,5例治愈,1例放弃治疗。分离于不同部位的15株病原菌经形态学、培养的双相性皆证实为马尔尼菲青霉,其中11株经DNA测序也得到进一步证实。结论 广东近年马尔尼菲青霉病患者增多,且伴发艾滋病者增多,应引起重视。     

真菌病

20 0 4 2 0 89　聚合酶链反应结合尿嘧啶糖基化酶鉴定临床常见念珠菌 /李少平 (天津市长征医院 )… //中华皮肤科杂志 .- 2 0 0 4 ,37(4 ) .- 2 33～ 2 34选取真菌界高度保守内转录间隔区 ITS1- ITS4 做外引物及据此外引物设计白念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌内引物序列 ;据 ITS1- ITS3设计光滑念珠菌内引物序列 ,采用套式 PCR及酶学防污措施进行念珠菌种间鉴定。结果显示该法具有良好的临床应用价值。图 2表 1参 3　 (贾泰元 )2 0 0 4 2 0 90　马尔尼菲青霉临床分离株的序列分析 /韦高(北京大学第一医院皮肤科 )… /…     

四种分枝杆菌快速检测方法的研究

目的 建立敏感、特异的快速检测4种分枝杆菌的方法。方法 用特异性引物对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌菌悬液DNA进行PCR扩增,验证其敏感性和特异性。将上述4种分枝杆菌的特异性引物同时放入PCR扩增反应体系中,以此反应体系分别对该4种分枝杆菌菌悬液DNA、及其两两组合或特定的三重组合进行扩增,同时验证其敏感性。结果 4种分枝杆菌的特异性引物分别放入各自的PCR扩增反应体系中,可分别特异性地扩增出该4种分枝杆菌对应的DNA片段,敏感性达1×10¹～1×10²个菌细胞/mL。4种分枝杆菌的特异性引物同时放入同一PCR扩增反应体系中可分别特异性地扩增出对应的4种分枝杆菌单菌及其两两组合或三种分枝杆菌组合的DNA片段,敏感性达1×10²～1×10³个菌细胞/mL;4种分枝杆菌的特异性引物对其他分枝杆菌进行扩增,结果均为阴性。结论 多重PCR方法能敏感、特异地快速检测4种分枝杆菌。     

应用PCR-RFLP进行申克孢子丝菌的分子生物学鉴定

目的　探索一种简单、快速的申克孢子丝菌的鉴定方法。方法　应用真菌通用引物ITS1和ITS4对来源于不同地区及不同临床型别孢子丝菌病的 2 8株申克孢子丝菌以及 9种其他临床上重要的真菌进行PCR扩增 ,利用限制性内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切分析鉴定。结果　所有 2 8株申克孢子丝菌和其他 9种真菌均扩增出一条约 3 5 0bp的片段 ,其中 2 8株申克孢子丝菌RFLP带型一致 ,与 9种其他临床上重要的真菌RFLP带型差异较明显。 结论　PCR RFLP可以为建立一种简单、快速鉴定申克孢子丝菌的方法提供依据。     

简并PCR结合RACE技术克隆马尔尼菲青霉未知基因

目的寻找高效克隆马尔尼菲青霉新基因的方法。方法从生物信息库中找出已知的酿酒酵母、白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉、构巢曲霉SKN7氨基酸保守序列,设计简并引物,PCR扩增获得部分马尔尼菲青霉SKN7 cDNA片段,随后应用RACE技术分别扩增其5′端和3′端未知序列。结果简并PCR扩增可产生多个条带,以预期大小1100bp处条带最清晰。5-′RACE得一约900bp大小产物,无非特异性扩增。3-′RACE扩增产物为多条片段,其中以700bp,400bp和200bp条带相对较清晰,纯化、克隆、测序、比对分析后证实700bp大小产物为目的片段。将上述产物序列进行对位拼接,获得一全长约为2.5kb的序列,它编码的蛋白与其他物种Skn7蛋白高度同源,为马尔尼菲青霉SKN7 cDNA。结论简并PCR结合RACE技术是一种高效、简单、有效的克隆马尔尼菲青霉新基因的方法。     

马尔尼菲青霉基因功能研究工具载体pSilent-GFP的构建

目的 建立一种基于载体pSilent-1介导的对马尔尼菲青霉基因进行功能研究的工具。方法 将绿色荧光蛋白（GFP）基因整合于丝状真菌表达质粒pSilent-1中,构建pSilent-GFP载体,将构建成功的pSilent-GFP载体通过电转化方法转化马尔尼菲青霉酵母细胞,经潮霉素阳性筛选及PCR方法鉴定阳性克隆子,并在荧光显微镜下观察GFP在马尔尼菲青霉中的表达。结果 成功构建了pSilent-GFP表达载体,该载体能转化马尔尼菲青霉酵母细胞并在菌体内稳定表达GFP。结论 pSilent-GFP载体在马尔尼菲青霉中稳定表达GFP,pSilent-1载体可应用于马尔尼菲青霉基因的功能研究。     

补体受体3在小鼠巨噬细胞识别马尔尼菲青霉中的作用

【摘要】 目的 探讨补体受体3（CR3）在小鼠巨噬细胞识别马尔尼菲青霉中的作用。方法 以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为靶细胞,分别与马尔尼菲青霉灭活分生孢子、灭活酵母细胞、活分生孢子、活酵母细胞在37 ℃,5% CO2培养箱中共同培养1 h后,逆转录PCR检测CR3 mRNA的表达,Western印迹检测CR3蛋白的表达,流式细胞仪检测吞噬率,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养上清中细胞因子水平。siRNA靶向下调巨噬细胞CR3的表达后与马尔尼菲青霉灭活分生孢子共培养,按照前述方法检测吞噬率及各细胞因子水平。采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析（ANOVA）检测各组间指标差异。结果 RAW264.7细胞与马尔尼菲青霉灭活分生孢子、灭活酵母细胞、活分生孢子、活酵母细胞共培养后, 四组之间比较,CR3 mRNA、蛋白表达差异均无统计学意义（P > 0.05）,吞噬率分别为95.14%、89.56%、91.03%、90.78%,各组之间差异无统计学意义（P > 0.05）;共培养后,白介素（IL）2、干扰素（IFN）γ等Th1型,IL-4、IL-10等Th2型细胞因子均呈不同程度升高,但四个共培养组之间差异无统计学意义（P > 0.05）。siRNA靶向下调CR3表达后,RAW264.7细胞与马尔尼菲青霉共培养,其对马尔尼菲青霉的吞噬率下降为10.89%,与未干扰组比较,差异有统计学意义（P < 0.05）;同时,巨噬细胞分泌细胞因子的水平与未干扰组比较下降。结论 CR3为巨噬细胞识别、介导吞噬马尔尼菲青霉的模式识别受体之一;IL-2、IFN-γ Th1型,IL-4、IL-10 Th2型细胞因子可能均参与巨噬细胞抗马尔尼菲青霉感染免疫。 【关键词】 巨噬细胞; 马尔尼菲青霉; 受体,补体; 疾病模型,动物     

Arthroderma Vanbreuseghemii所致脓癣的病原菌鉴定及药敏分析

目的：利用rDNAITS序列分析结合真菌形态学对1例脓癣的病原菌进行鉴定,并研究其体外对抗真菌药物的敏感性,为临床脓癣病原菌的快速、准确鉴定及治疗提供思路。方法：取患者病发及皮损处脓液进行真菌镜检和培养。提取菌株DNA,利用引物ITS4和ITS5进行PCR扩增,扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对。按照CLSI制定的M38-A方案对此临床分离株进行体外药敏分析。结果：临床分离株的菌落形态为白色粉末状,尿素酶试验阳性,玉米培养基培养无色素产生,毛发穿孔试验可见毛发劈裂。小培养可见大量葡萄状小分生孢子,螺旋菌丝及棒状大分生孢子,rDNA序列比对结果显示此临床分离菌株与Arthroderma vanbreuseghemii有99%同源性,该菌株鉴定为Arthroderma vanbreuseghemii。体外药敏试验显示：特比萘芬MIC〈0.0313μg/mL、伊曲康唑MIC1.000μg/mL,伏立康唑的MIC为0.0625μg/mL。以特比萘芬口服250mg/d治疗6周后痊愈。结论：利用rDNA-ITS序列分析结合真菌形态学可快速准确的将脓癣的病原菌鉴定到种;此株Arthroderma van-breuseghemii在体外对特比萘芬最敏感。     

红色毛癣菌基因型稳定性的研究

目的探讨红色毛癣菌基因型的稳定性。方法采用随机引物PCR法和探针与DNA印迹杂交法。以CTAB法提取DNA。随机引物为OPAA11[5-′ACCCGACCTG-3′],印迹法以NS5和ITS4(真菌的特异性引物)为引物,以红色毛癣菌的标准株为模板,扩增出rDNA的部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针,并用随机引物法将探针用P32标记,与EcoRⅠ酶切的基因组DNA杂交。结果①AP-PCR法:红色毛癣菌扩增的主要带型是2.2,1.7,1.3,0.9,0.7 kb,所试红色毛癣菌传代前后扩增带型均无变化。②探针与DNA印迹杂交法:原代(1代)与传代后的(2,3,4代)杂交带型一致,11株红色毛癣菌均表现为3条带,分两型(分子量分别为2.4,3.9,5.9 kb和2.4,4.4,6.5 kb)。结论红色毛癣菌基因型稳定。     

须癣毛癣菌基因分型的研究

目的探讨ITS区域的探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌的基因分型,并分析基因型与来源地区的相关性。方法用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)法提取DNA,以皮肤癣菌的特异性引物NS5[5-′AACTTAAAGGAATT-GACGGAAG-3′]与ITS4[5-′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′]为引物,以须癣毛癣菌的标准菌株为模板,用PCR法扩增rD-NA部分18S区、ITSⅠ区、5.8 s区和ITSⅡ区为探针,随机引物法将探针标记,EcoR1酶切基因组DNA,按ECL试剂盒标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交;根据杂交的不同带型而分型。结果所试35株须癣毛癣菌分为14型(A~N型),A,B,C,D四型占62.86%。南方株以A和C型为主,北方株以B和D型为主。结论用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对须癣毛癣菌基因组分型敏感性强、分辨力较高;南北方须癣毛癣菌DNA分型存在一定差异;DNA分型对须癣毛癣菌病的流行病学调查和菌学的生物学研究具有重要价值。     

Penicillium marneffei infection diagnosed by polymerase chain reaction from the skin specimen

We describe a case of Penicillium marneffei infection in a patient with AIDS who had skin eruptions disseminated over the entire surface of his skin. We identified P marneffei from the skin biopsy specimen by polymerase chain reaction using a set of primers specific for this pathogen.