广西禽流感H5N1亚型病毒HA基因序列分析

目的了解广西禽流感H5N1亚型病毒的基因特性.方法2011年在广西农贸市场采集污水、笼具涂抹、粪便标本,经H5亚型特异实时荧光定量PCR方法(Real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测,阳性样本进行病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因扩增后对产物直接测序,测序结果与已知参考毒株进行序列比对及系统进化分析.结果对阳性样本病毒HA基因测序获得6份HA序列,均分布在进化分支2.3.2的Ⅱ-1分支下.广西的6序列无论是氨基酸还是核苷酸的都是高度同源的,其核苷酸同源性在99.5%~100%,氨基酸同源性在99.5%~99.8%;序列测定的结果同时表明无论是受体特异性还是连接肽都是禽源的.结论2011年广西农贸市场流行的禽流感H5N1亚型病毒主要以进化分支2.3.2Ⅱ-1为主,均为禽源性的病毒.     

云南省边境地区禽流感H5N1亚型病毒基质蛋白2基因进化分析

目的 了解2008-2012年云南省边境地区禽流感H5NI亚型病毒基质蛋白2(M2)和离子通道蛋白基因变异特征及遗传进化关系.方法 于2008-2012年采集云南省边境地区(越南、老挝、缅甸与云南省交界处)家禽和野生鸟类棉拭子样品1240份,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品病毒M基因进行扩增,克隆至pMD18-T载体测序,获得M2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析.结果 自1240份样品中检出H5N1亚型阳性样品71份,阳性率为5.72％;选择其中的30份阳性样品进行病毒M2基因测序,共获得14种不同序列,存在3个不同进化分支:1.2.1、1.2.2、2,各有5、7、2份.通过基因系统发育分析发现,M2基因与HA基因呈现不同进化关系;M2蛋白涉及表位、金刚烷胺抗性和禽源、人源毒株的关键性氨基酸位点存在替代或突变.结论 2008-2012年期间云南边境H5N1亚型病毒M2基因具有遗传差异,M2基因进化分支1.2.2毒株已成为当地流行的优势毒株.     

禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达

目的研究H5 I151F和H5 I151F＋A134V＋E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白（HA）亲人受体结合的影响,并获得该HA。方法构建载体pRB21’,共感染／转染vp37^-牛痘病毒vRB12和pRB21’,基因同源重组牛痘病毒表达HA,Western免疫印迹法鉴定。结果获得了克隆有H5HA全长基因片段的载体pRB21’,构建了2种重组牛痘病毒re-VV H5 I151F和re-VV H5 I151F＋A134V＋E186D,且能在被感染细胞膜表达这两种HA。结论首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5HA,为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础。     

泛太平洋西岸地区部分H5N1亚型禽流感病毒毒株血凝素基因特性的研究

目的了解泛太平洋西岸各个国家H5N1亚型人禽流感病毒血凝素(HA)基因分子特征,寻求HA基因变异规律。方法从Genebank中下载泛太平洋西岸国家或地区(包括泰国、越南、香港、印度尼西亚、中国大陆、蒙古、俄罗斯)50株H5N1亚型高致病性流感病毒(HAPI)毒株血凝素基因序列,利用生物信息学软件DNASTAR5.0进行核酸同源性分析,用MEGA3.1进行核酸和氨基酸序列比对和进化树分析。结果50株高致病性H5N1亚型流感病毒毒株可以分成3个相对独立的进化簇。第1簇为泰国越南簇;第2簇为中国印尼北亚簇(包含中国、印度尼西亚、蒙古以及俄罗斯);第3簇主要为1996~2001年期间分离的毒株,该簇毒株HA基因与Gs/Gdlike毒株核酸同源性更为接近,其基因亚型更多表现为Gs/Gdlike或其他基因亚型。HA基因分子特征分析表明在HA蛋白抗原性上,泰国越南分离株表现基本一致,而其他地域分离株存在表现各异,但也存在地域的一致性。结论泛太平洋西岸地区分离的H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白在分子特征上表现出一定的地域特异性,在一定地域范围内保持一致性。     

云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NS基因进化分析

目的 阐明云南边境地区禽流感H5N1亚型病毒NSl、NS2基因变异特征及遗传进化关系。方法 在云南边境地区采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品,经H5N1亚型特异性多重RT-PCR检测,阳性样品对病毒NS基因进行扩增,克隆Z至pMDl8一T载体测序,获得NSl、NS2基因序列,并与已知参考毒株序列进行序列比对及系统发育分析。结果 自1240份样品中检出H5N]亚型阳性样品71份,阳性率为5．72％;30份代表性阳性样品病毒NS基因测序获得17种序列,存在3个不同进化(亚)分支(I一1、I一2、Ⅱ);NSl／NS2基因与病毒血凝素(HA)基因呈现不同进化关系;NSl蛋白涉及核定位信号区、RNA结合区、效应区及其他致病性相关的关键性氨基酸位点存在替代或突变。结论 云南边境地区H5N1亚型病毒NSl／NS2基因具有遗传差异,2010年以来NS基因进化分支I一2、Ⅱ已成为当地流行的优势毒株。     

WHO确认的人感染H5N1亚型禽流感病毒病例的流行病学分析报告

中国香港特别行政区在1997年首次报告人感染H5N1亚型禽流感病毒疫情,共有18例病例,其中6例死亡。当时香港有农场及活禽市场爆发了禽间高致病性禽流感疫情,在采取了快速扑杀全港鸡只的措施后,人间病例再没有出现。2003年2月,来自同一香港家庭的2名成员(其中1名死亡)被证实为人禽     

H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速诊断试剂的改进与初步评价

H5N1病毒高度变异,为确保本中心研制的H5N1禽流感病毒抗原快速诊断试剂对不同变异分支的H5N1病毒,特别是实时流行株的高度检测准确性,本研究根据抗原活性变异情况对中心开发的第一代H5抗原快速诊断试剂进行了改进。改进后的第二代H5抗原快速诊断试剂(H5-Dot-2nd)对25株代表亚洲地区流行的不同进化分支的H5N1禽流感病毒检测均为阳性,其中12株检测下限达到0.01HA;而对20株32HA滴度的非H5亚型流感病毒株检测均为阴性;不同机构的评价结果显示,H5-Dot-2nd的灵敏度比国外同类试剂高出10～1000倍,对非H5现场标本特异性达到99.0%(399/403)。上述结果提示,H5-Dot-2nd对历年来特别是当前流行株均具有很好的检测灵敏度,能更好地满足流感疫情监控的需要。     

香港H5N1型禽流感病毒的由来

H5N1原是感染鸟类的流感病毒,但1997年在香港直接感染人类,造成18人感染6人死亡,病死率超过30％,超出想象。流行性感冒大都发生在冬季,但此型病毒感染却发生在流感的非流行期,引起大众的恐慌,担心此型流感的发展会大流行,造成人类的浩劫。幸好香港特区政府处理得宜,随即实施鸡只扑杀政策,终于成功遏制了H5N1流感病毒的流行。1999年香港有2位儿童感染H9N2型流感病毒,这种病毒在国内大陆、欧洲、中东、南非及美国的家禽间也曾经造成流行,香港的H5N1型禽流感病毒流行期间,从鹌鹑中分离到的H9N2非常接近从人类分离到的H9N2型流感病毒,H9N2与     

禽流感病毒H5N1抗原基因克隆及体外转录

目的通过基因克隆和体外转录,获得H5N1禽流感病毒抗原基因的RNA全长片段,为病原学检测提供阳性定量标准品。方法设计H5N1禽流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)及基质蛋白M(M)的基因克隆引物,RT-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物用DNase酶处理、纯化后测定浓度,RT-PCR验证。结果获得含H5N1禽流感病毒HA、NA、M全长基因序列的RNA片段,并可准确定量其拷贝数,质量浓度HA为503.9 ng/μL、NA为379.2 ng/μL、M为437.8 ng/μL。结论获得的RNA片段可作为H5N1禽流感病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

华东地区高致病性H5N6禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

目的分析2017年以来中国华东地区高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因分子特征。方法 H5N6核酸阳性标本采用9～11日龄鸡胚进行病毒分离,病毒基因测序采用下一代测序技术,相关的参考序列下载自GISAID或NCBI网站,序列比对和进化树构建采用ClustalX、Blasts及Mega 6.1等生物信息学软件。结果 2017年以来,在江苏省活禽市场和禽流感患者的标本中,成功分离出43株H5N6禽流感病毒,对33株病毒进行了基因组测序。选择其中的27株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析,clade 2.3.4.4h有20株,clade 2.3.4.4e有3株,另外4株归类于clade 2.3.4.4b;多个碱性氨基酸出现在病毒HA蛋白的裂解位点,是高致病性禽流感病毒的典型分子特征;HA蛋白受体结合位点的222和224位氨基酸分别是Q和G,具有结合禽类受体α2-3半乳糖苷唾液酸(SAα2-3Gal)的特性,158位点糖基化位点丢失,但新的糖基化位点出现在124位点上。结论 2017年HA基因clade 2.3.4.4h是我国华东地区H5N6病毒优势基因型,病毒处于持续动态进化中,需要继续对病毒进化进行监测。     

湖南省2006--2009年人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)分子特征研究

目的 分析湖南省2006-2009年4例人感染高致病性禽流感病例感染病毒的可能来源、基因重配情况以及分子特征.方法 鸡胚分离核酸检测H5N1病毒阳性标本,获得高致病性H5N1病毒,对病毒进行全基因组序列测定,采用BLAST和MEGA4.0进行同源性比对、基因进化分析和各基因分子特征分析.结果 4株病毒的基因片段均为禽源,并未发现与人季节性流感病毒之间发生重配,且与当地禽类中分离的病毒高度同源.全基因组进化树分析显示,4株病毒在分支2.3.4中,2株为基因型V、2株为新的基因型.分子特征分析显示,4株病毒的血凝素(HA)分子裂解位点均为PLRERRKR/G,均出现A160T位点突变,神经氨酸酶(NA)分子49～68位均出现20个氨基酸(aa)缺失,非结构蛋白1(NSI)分子80～84位均出现5个aa的缺失.在HA分子大部分位点,4株病毒仍然表现出与禽类受体的亲和性,HN/1/09和HN/2/09出现可能使病毒对α-2,6连接的唾液酸人类受体的亲和性增强的T192I突变.HN/1/08的PB2基因出现增加小鼠致病力的D701N改变.耐药性基因片段分析显示,4株病毒对金刚烷胺和奥司他韦均敏感.结论 2006-2009年湖南省4株人感染高致病性禽流感病毒(H5N1)为禽源,但存在多种基因型,而且发生了部分位点的突变.

Abstract：

Objective To understand the possible origins,genetic re-assortment and molecular characterization of 4 highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses isolated from humans in Hunan province,between 2006 and 2009,Methods H5N1 PCR test-positive specimens were inoculated in embryonated eggs while H5N1 virus was isolated and genomes sequenced.Genome homology and genetic molecular characterization were analyzed by BLAST and MEGA 4.0.Results All gene segments of the 4 viruses were avian in origin.No re-assortment was found between avian influenza A(H5N1)viruses and human seasonal influenza viruses.Virnses that isolated from domestic poultry shared high similarity with the 4 human viruses in gene homology.Data from the whole genome phylogenetic analysis showed that the 4 viruses were in clade 2.3.4,while 2 viruses belonged to genotype V,and another 2 were new genotypes.Results from molecular characterization showed that amino acid sequences of HA cleavage site of the 4 viruses were PLRERRKR/G.All 4 viruses had A160T mutation in HA,a 20 amino acid deletion in the neuraminidase(NA)stalk at position 49-68,and a 5 amino acid deletion in the non-structural protein 1(NS1).Most sites in the HA molecules showed that the viruses preferentially bound to avian influenza virus receptor.However,T192I mutation that might enhance the α2,6-linked sialic acid human influenza receptor binding had emerged in HN/1/09 and HN/2/09.D701N mutation of PB2 that increased the virulence in mice was found in HN/1/08.Analysis on drug resistance gene amino acid showed that all 4 viruses were sensitive to amantadine and oseltamivir.Conclusion Highly pathogenic avian influenza A(H5N1)viruses isolated from humans in Hunan province from 2006 to 2009 were avian in origin,and the 4 viruses belonged to different genotypes.Some mutations that related to virulence and receptor binding positions had emerged in some of the strains.     

Modified Newcastle disease virus vectors expressing the H5 hemagglutinin induce enhanced protection against highly pathogenic H5N1 avian influenza virus in chickens

Naturally-occurring attenuated strains of Newcastle disease virus (NDV) are being developed as vaccine vectors for use in poultry and humans. However, some NDV strains, such as Beaudette C (BC), may retain too much virulence in poultry for safe use, and more highly attenuated strains may be suboptimally immunogenic. We therefore modified the BC strain by changing the multibasic cleavage site sequence of the F protein to the dibasic sequence of avirulent strain LaSota. Additionally, the BC, F, and HN proteins were modified in several ways to enhance virus replication. These modified BC-derived vectors and the LaSota strain were engineered to express the hemagglutin (HA) protein of H5N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV). In general, the modified BC-based vectors expressing HA replicated better than LaSota/HA, and expressed higher levels of HA protein. Pathogenicity tests indicated that all the modified viruses were highly attenuated in chickens. Based on in vitro characterization, two of the modified BC vectors were chosen for evaluation in chickens as vaccine vectors against H5N1 HPAIV A/Vietnam/1203/04. Immunization of chickens with rNDV vector vaccines followed by challenge with HPAIV demonstrated high levels of protection against clinical disease and mortality. However, only those chickens immunized with modified BC/HA in which residues 271–330 from the F protein had been replaced with the corresponding sequence from the NDV AKO strain conferred complete protection against challenge virus shedding. Our findings suggest that this modified rNDV can be used safely as a vaccine vector with enhanced replication, expression, and protective efficacy in avian species, and potentially in humans.     

安徽省2013-2018年活禽市场H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因遗传特征

目的  分析2013年-2018年安徽省外环境中H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus, AIVs)血凝素(hemagglutinin, HA)基因变异特征。 方法  将所有安徽省禽流感外环境监测点搜集的H9N2亚型核酸阳性样本接种鸡胚分离病毒,病毒RNA逆转录为cDNA后用特异性引物进行扩增,聚合酶链式反应产物通过基因测序后获得HA基因序列,应用分子生物学软件进行分析;使用DATAMONKEY在线服务器进行基因选择压力分析,并使用SWISS-MODLE软件构建分子突变三维构象。 结果  获得33株H9N2 AIVs属于h9.4.2.5进化分支,受体结合位点183、226和227位置分别突变为N、L和M,189和190位置存在多样性;2015年以后分离的毒株均携带6个糖基化位点;选择压力分析得出160位置承受较大的正向选择压力,至少呈现7种空间构象。 结论  安徽省外环境中存在的H9N2亚型AIVs具有感染哺乳动物的分子特征并具备抗原漂移能力,需密切关注该病毒的分子变异特征。     

Continuing threat of influenza (H5N1) virus circulation in Egypt

Reservoirs for the continuing influenza (H5N1) outbreaks in Egypt are ill-defined. Through active surveillance, we detected highly pathogenic influenza subtype H5 viruses in all poultry sectors; incidence was 5%. No other subtypes were found. Continued circulation of influenza (H5N1) viruses in various regions and poultry sectors perpetuates human exposure in Egypt.     

Atypical avian influenza (H5N1)

We report the first case of avian influenza in a patient with fever and diarrhea but no respiratory symptoms. Avian influenza should be included in the differential diagnosis for patients with predominantly gastrointestinal symptoms, particularly if they have a history of exposure to poultry.