制备源自HBsAg基因修饰树突状细胞的外切体

目的:制备一种新型负载HBsAg基因的外切体(exosome)瘤苗,并探讨其生物学特性、免疫学功能。方法:运用分子克隆和病毒载体转染HBsAg基因构建AdVHBsAg-DC肝癌瘤苗,采用流式细胞术鉴定转染基因表达;提取exosome;以透射电镜观察、Western blot法鉴定exosome。结果:构建的重组AdVHBsAg腺病毒载体,经PCR和酶切鉴定,结果显示HBsAg基因片段已正确插入腺病毒载体中。包装的腺病毒载体具有良好的感染性,可以在293细胞中形成病毒颗粒。提取的exosome在透射电镜下可观察到直径为50-100nm的膜性微囊,圆形或椭圆形,有完整包膜。Western blot检测结果表明,exosome含有DC的特征分子和HBsAg基因。结论:成功制备并获得HBsAg基因修饰树突状细胞为来源的exosome瘤苗,为治疗乙肝相关肝癌提供新的思路。     

Dexosome的生物学特性和临床研究进展

exosome最初用于描述网织红细胞向成熟红细胞分化过程中脱落的小囊泡。由于网织红细胞缺乏溶酶体,因此脱落的蛋白不能在细胞内降解,仅能排出细胞外。近几年来,对于exosome的来源、功能及其作用机制有了较为深入的认识[1]。研究表明DC(树突状细胞)产生的exosome(Dexo-some,Dex)可以诱导T细胞依赖的抗肿瘤效应。目前Dex的成分、生物学活性、GMP(药品生产质量管理规范)级制备已基本确定,它作为亚细胞成分疫苗的临床应用前景引起了人们极大的关注[2]。本文就临床前研究结果及其在转移性恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)临床试验中的研究…     

膀胱移行细胞癌来源的exosome诱导体外细胞毒性T细胞杀伤效应

目的 观察膀胱移行细胞癌T24细胞来源的exosome体外诱导细胞毒性特异性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞的杀伤效应.方法 采用超滤和蔗糖密度梯度离心法分离T24细胞释放的exosome,电镜、Western blot观察exosome的特征.将exosome和肿瘤细胞负载到人外周血分离培养的树突状细胞(Dc)上,并与T细胞体外共同培养,分为exosome致敏DC组、未致敏DC组和对照组,Alamar blue检测CTL对T24细胞的细胞毒活性.结果 T24细胞分泌的exosome为直径约30～90nm的类圆碟形小囊泡.Western blot证实,exosome表达热休克蛋白70(HSP70)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和人细胞角蛋白20(CK20)分子.与未致敏DC组和对照组比较,exosome致敏DC组活化的T细胞对T24细胞有更强的细胞毒活性(P＜0.01).结论 T24细胞来源的exosome负载了HSP70、ICAM-1等免疫相关蛋白;exosome经DC负载后活化CTL产生抗肿瘤活性.     

膀胱移行细胞癌来源exosome的制备及相关蛋白分子的鉴定

目的分离纯化膀胱移行细胞癌T24细胞来源的exosome,对其形态学和蛋白组成进行初步分析,为进一步利用exosome治疗膀胱移行细胞癌奠定基础。方法采用超滤和蔗糖密度梯度离心法分离T24细胞释放的exosome,电镜观察形态大小,SDS-PAGE分离蛋白并用软件分析,Western blot检测热休克蛋白70（HSP70）、细胞黏附分子（ICAM-1）、细胞角蛋白20（CK20）的表达。结果成功的分离出了exosome,其大小为30～90 nm,类圆碟形小囊泡,Western blot证实exosome 表达HSP70、 ICAM-1和CK20分子。结论T24细胞可以分泌exosome,并负载了HSP70、ICAM-1等免疫相关蛋白,为肿瘤免疫治疗提供了理论基础。     

树突状细胞-肝癌细胞株HepG2融合细胞来源的exosome抗肝癌效应的实验研究

目的:以肝癌(HCC)患者树突状细胞(DC)与肝癌细胞HepG2之融合细胞为来源制备exosome,检测其体外诱导同源T细胞产生特异性抗HepG2的免疫效应。方法:以HCC患者外周血单个核细胞(PBMC)为来源,应用重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、白细胞介素-4(rhlL-4)体外诱导培养DC;聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HepG2,免疫磁珠分选DC-HepG2融合细胞,以纯化的融合细胞上清为来源,超滤及超高速密度梯度离心法制备exosome;透射电镜观察exosome形态,流式细胞术、ELISA等方法检测exo-some蛋白分子表达;以融合细胞来源的exosome直接刺激效应淋巴细胞,MTT法检测效应淋巴细胞对靶细胞HepG2的杀伤活性;ELISA法检测该效应淋巴细胞分泌IFN-γ水平。结果:DC-HepG2融合细胞可分泌ex-osome,该exosome同时含有DC的特征分子CD86(94.6%)和肝癌细胞HepG2的AFP抗原(40.7%),ELISA法亦证实exosome提取物中含有AFP蛋白;DC-HepG2来源的exosome活化的淋巴细胞(Exo-L)对靶细胞HepG2的杀伤率明显高于单纯淋巴细胞组(L)(P<0.05),Exo-L组对HepG2的杀伤率亦显著高于对其他两种靶细胞(肝癌细胞SMMC7721、白血病细胞K562)的杀伤率(P<0.05)。靶细胞为HepG2时,Exo-L组IFN-γ分泌量明显高于L组(P<0.05)。结论:以肝癌患者DC与肝癌细胞HepG2之融合细胞为来源可制备获得exosome瘤苗,该瘤苗无须DC存在,可直接激活自体淋巴细胞,产生HepG2抗原特异CTL,显示了比传统制备的exosome更强的功能,有望成为HCC免疫治疗的有效途径。     

成纤维细胞系3T3细胞来源exosome对小鼠乳腺癌细胞增殖能力的影响

目的 观察小鼠成纤维细胞系3T3来源的外泌小体（exosome）对小鼠乳腺癌细胞4T1增殖能力的影响,并探索其中可能的机制。方法 PureExo Exosome提取试剂盒提取3T3细胞上清液中的exosome,按照不同浓度及时间作用于4T1细胞,CCK8法检测4T1细胞的增殖能力,BrdU/PI双掺入法测定细胞DNA合成及细胞周期;免疫印迹法（Western blot）及荧光定量实时PCR（qPCR）检测人表皮生长因子受体2（epidermal growth factor receptor-2, EGFR2,也称HER2）及下游PI3K/AKT信号转导通路相关蛋白的变化。利用HER2单克隆抗体靶向药物赫赛汀（Herceptin）,观察exosome是否影响4T1细胞对于Herceptin敏感度。结果 exosome处理组OD450吸光度值显著高于对照组（P<0.05）,细胞增殖及细胞周期进程加快。Western blot及qPCR实验提示随着exosome浓度的增加,HER2表达逐渐升高, AKT磷酸化水平增加。而同时给予exosome可明显增加4T1细胞对Herceptin的敏感度。结论 小鼠成纤维细胞系3T3来源exosome可促进小鼠乳腺癌细胞4T1增殖及周期进程,并且可能通过HER2激活其下游PI3K/AKT信号通路发挥上述作用。     

肺癌中细胞外囊泡的研究进展

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成分,主要分为外泌体(exosome)、微囊泡(microvesicle)两种类型,正常细胞和肿瘤细胞均可分泌EVs。肺癌细胞分泌的EVs参与肺癌生物学功能和肿瘤微环境调节,对肺癌的发生发展发挥重要作用。由于EVs包含的物质及特殊的分子结构决定其在肺癌的早期诊断、作为免疫调节剂、化疗药物载体等方面具有独特的临床应用价值,因此本篇综述主要介绍肺癌中EVs 研究的进展,为肺癌的早期诊断、治疗及预后提供重要的依据。     

外泌体在肿瘤负向免疫调控中的作用

外泌体(exosome)是一类直径30～100 nm的囊泡样小体,其含有蛋白质、mRNA、微小RNA(miRNA)、DNA片段等,是细胞间物质和信息转导的重要媒介.外泌体参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移等各个过程,其在肿瘤免疫中发挥双向调控功能.本文重点阐述外泌体在肿瘤负向免疫调控中的作用,如肿瘤来源外泌体(tumor-derived exosome,TEX)能够阻碍DC的分化和成熟,促进巨噬细胞极化,减弱B细胞功能及诱导调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)产生,促骨髓前体细胞分化为髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC),减弱NK及T淋巴细胞的杀伤功能,诱导调节性T细胞(regulatoryT cell,Treg)等;又如免疫细胞来源外泌体(immunocyte-derived exosome,IEX),主要为Treg、CD8+T细胞来源的外泌体,同样具有免疫抑制功能.     

外泌体lncRNA在肿瘤中的研究进展

外泌体（exosome）是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中的一种直径为30~100 nm 的膜性囊泡,广泛分布于各种体液中。其含有蛋白质、核酸（mRNA、miRNA、lncRNA、DNA等）和脂质等物质,是细胞间通讯的重要介质。大量研究表明,外泌体lncRNA在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程中扮演重要角色。本文就外泌体lncRNA在肿瘤发生发展、诊断、治疗及预后中的研究进展进行综述。     

外泌体在卵巢癌诊治中应用的研究进展

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,由于早期患者自身无不适症状且对其缺乏可靠的诊断方法,加之目前对晚期卵巢癌患者缺乏有效的监测及治疗方法,故卵巢癌患者的病死率较高。肿瘤患者血液中的肿瘤源性外泌体（tumor-derived exosome,TEX）携带有与原肿瘤细胞一致的生物信息学特性,通过检测TEX可以无创、连续、实时监测肿瘤的发生发展情况,是卵巢癌早期诊断、治疗评估、预后随访潜在的有益指标。本文就TEX来源性质、在肿瘤微环境中的作用机制、目前分离鉴定技术及其在卵巢癌诊断治疗中应用的研究进展作一综述。     

The cancer exosomes: Clinical implications,applications and challenges

The exosome is a small functional vesicle enriched in selected proteins, lipids and nucleic acids, displaying distinct molecular heterogeneity. Exosomes released can transform the extracellular matrix microenvironments, transmit signals and molecules to recipient cells and trigger changes in their pathophysiological functions. Tumor-derived exosomes mediate the interactions of tumor cells and microenvironment significantly, and they stimulate tumor growth and development through specific signaling pathways related to metastasis, therapeutic resistance and immunosuppression. Exosome biogenesis from tumors often represents abundant biological information, and novel and efficient isolation and detection methods of exosomes provide a promising approach for tumor diagnosis and prognosis estimation. Moreover, exosome can even be developed as therapeutic agents for multiple disease models based on effective material transport characteristics and biofilm specificity. This review reports the clinical implications and challenges of exosomes in cancer progression, therapy resistance, metastasis and immune escape, and underlying cancerogenic pathological phenotypes including fibrosis and viral infection.     

Exosomes in cancer development and clinical applications

Exosomes participate in cancer progression and metastasis by transferring bioactive molecules between cancer and various cells in the local and distant microenvironments. Such intercellular cross‐talk results in changes in multiple cellular and biological functions in recipient cells. Several hallmarks of cancer have reportedly been impacted by this exosome‐mediated cell‐to‐cell communication, including modulating immune responses, reprogramming stromal cells, remodeling the architecture of the extracellular matrix, or even endowing cancer cells with characteristics of drug resistance. Selectively, loading specific oncogenic molecules into exosomes highlights exosomes as potential diagnostic biomarkers as well as therapeutic targets. In addition, exosome‐based drug delivery strategies in preclinical and clinical trials have been shown to dramatically decrease cancer development. In the present review, we summarize the significant aspects of exosomes in cancer development that can provide novel strategies for potential clinical applications.     

外泌体源性细胞外microRNAs 在泌尿系统恶性肿瘤中的研究进展*

microRNAs（miRNAs）是一种内源性单链非编码微小RNAs分子,可通过碱基互补方式与靶mRNA 的3’非翻译区（3’UTR ）特异性结合诱导其降解或抑制其翻译,从而在转录后水平有效地沉默靶基因的蛋白表达。miRNAs因可以上述方式调节癌基因或抑癌基因表达,故其广泛参与了肿瘤的发生发展过程。本文概括了miRNAs的起源、功能及生物体液中外泌体（exosome）源性细胞外miRNAs的稳定性。同时对从尿液外泌体中寻找泌尿系统恶性肿瘤潜在miRNA 标记物的现实可行性以及尿液中外泌体源性miRNAs在前列腺癌、膀胱癌及肾癌中作为生物标记物的潜能进行综述。      

外泌体作为靶向治疗载体的研究进展

外泌体是来源于细胞内膜的纳米级的囊泡,包含有核酸、蛋白和脂质等生命物质,作为一种细胞间交流的机制,在生命活动中发挥着重要作用。相对于脂质体载体,外泌体更稳定,生物相容性好,免疫原性低,而且可以渗透生物屏障,例如血脑屏障、胎盘屏障等。重点介绍外泌体载体靶向性的基础、外泌体载体装载负荷的方法及外泌体载体目前的应用进展和前景。     

外泌体在乳腺癌发病中的作用机制

研究表明外泌体可通过介导细胞间通讯参与乳腺癌的发生发展过程,促进肿瘤转移和耐药,影响肿瘤患者的治疗效果.外泌体与乳腺癌临床分期及预后的关系密切,在乳腺癌早期诊断和生物治疗中具有潜在的临床应用价值,可为乳腺癌的治疗提供新的希望.     

外泌体miRNA作为肿瘤标志物在消化系肿瘤的研究进展

外泌体是由活细胞分泌,普遍存在于唾液、血浆和乳汁等体液中的纳米级囊泡。外泌体中含有诸多功能性的DNA、蛋白质以及非编码RNA等活性物质,外泌体可以在细胞间穿梭广泛参与细胞间信息传递和物质交换。研究发现肿瘤外泌体中一些特定miRNA具有生物学特性和靶向特异性,可以调节机体在代谢紊乱中的生物活动,从多方面参与肿瘤发生发展,具有成为肿瘤治疗和预后标志物的潜力。因此,探寻外泌体中特定miRNA在消化系统肿瘤中的作用及其作为生物标志物的可能性,从而为消化系统肿瘤的预防和诊疗提供新思路具有重要意义。全文针对外泌体miRNA在消化系统肿瘤的研究进展作一综述。     

Exosomes and anti-tumour immunotherapy

Exosomes are 60 to 90 nm membrane vesicles originating from late endosomes and secreted from most hematopoietic and epithelial cells in vitro. B cell derived-exosome antigenicity was first reported in 1996 in MHC class II restricted CD4+ T lymphocytes. In 1998, we reported that dendritic cell derived-exosomes are immunogenic in mice leading to tumor rejection. These findings have renewed the interest in exosomes. The current challenge consists in understanding the mechanisms and the physiological relevance of exosomes that could contribute to the design of the optimal exosome based-vaccination. Here, we will focus on the biological features pertaining to dendritic cell- and tumor cell derived-exosomes and will discuss their potential clinical implementation.     

肿瘤免疫学的热点与潜在方向--第98届美国免疫学年会相关报道之启示

第98届美国免疫学年会于2011年5月13-17日在美国旧金山市成功召开,年会在抗体、B细胞免疫、疫苗、肿瘤免疫学、免疫细胞代谢学等方面进行了重点研讨。聚焦年会上肿瘤免疫学相关的报道,其热点集中在肿瘤免疫抑制、肿瘤免疫治疗新的理念及exosome在肿瘤免疫中的两面性等方面。综观年会众多热门话题,免疫细胞代谢学极有可能成为今后免疫学发展的重要方向;与之相呼应,肿瘤细胞的代谢改变被认为是肿瘤的第8大特征,可能是未来肿瘤免疫学研究的潜在方向。     

外泌体源性非编码RNA在消化系统恶性肿瘤中的研究进展及展望

外泌体是纳米级、双层膜的囊泡,由多种细胞分泌,广泛存在于多种体液中.外泌体中含有RNA和蛋白质等多种活性物质,在细胞物质间和信号转导中起重要作用.非编码RNA具有重要的基因表达调控功能,在多种肿瘤的发生、发展过程中起重要作用.外泌体源性非编码RNA的研究是目前新的研究热点,现就外泌体及外泌体源性非编码RNA在消化系统恶性肿瘤中的研究进展进行综述.