毛细管电泳与微流控芯片电泳快速检测粪便中腺病毒的方法建立

目的 建立粪便中腺病毒的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光快速检测方法。方法 采用试剂盒法提取粪便中腺病毒DNA,选择腺病毒六邻体基因保守区域进行PCR扩增反应。PCR产物分别用高灵敏度的SYBR Gold和SYBR Orange核酸荧光染料进行标记,在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下分离,采用激光诱导荧光检测特异性PCR扩增产物。结果 腺病毒扩增产物在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下可分别于9 min和6 min内完成检测。将PCR扩增产物测序,并与NCBI基因库中核酸序列比对,结果表明所选用的扩增序列特异性良好。商品化DNA Marker毛细管电泳和微流控芯片电泳对目标DNA片段bp值求得的日内精密度分别为1.14%～1.34%和1.18%～1.48%,日间精密度分别为1.27%～2.76%和2.85%～4.06%。毛细管电泳-激光诱导荧光法和微流控芯片电泳-激光诱导荧光法检测腺病毒的灵敏度分别为2.33×10² copies/mL和2.33×10³ copies/mL。两种方法用于实际粪便样品测定,准确度高。结论 本研究建立的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光检测方法能够快速、灵敏、准确地检测出粪便中的腺病毒。     

双重PCR-毛细管电泳法快速检测大豆中转基因成分

目的　建立抗草甘膦转基因大豆的快速检测方法。方法　针对转基因大豆基因组中被导入的 35 S启动子、NOS终止子和 CP4 - EPSPS抗草甘膦基因等外源基因 ,自行设计了两对引物 ,采用双重 PCR同时扩增上述基因 ,用 8g/L羟丙基甲基纤维素为筛分介质 ,在 5 0 cm× 10 0μm i.d.涂壁毛细管中 ,于 - 10 k V电压下用激光诱导荧光 -毛细管电泳检测转基因大豆的 PCR扩增产物。结果　在优化的 PCR反应和毛细管电泳条件下 ,本法可以同时检测出转基因大豆样品中三种外源基因 ,双重 PCR扩增产物经测序证实与原基因序列完全一致 ,表明本研究设计的引物合理 ,扩增结果可靠。毛细管电泳进样量仅需 5 nl,分析时间为 2 4 min,迁移时间的相对标准偏差≤ 3.2 %。结论　本方法较常规琼脂糖凝胶电泳特异性高 ,分析时间短 ,重现性好 ,检测灵敏 ,适合于大豆中转基因成分的快速检测     

毛细管电泳-激光诱导荧光检测大鼠脑组织多巴胺含量

目的: 采用毛细管电泳-激光诱导荧光法建立检测大鼠脑组织多巴胺含量的方法。方法: 低温匀浆大鼠脑组织离心后,取上清用pH11.010mmol/L硼砂缓冲液,在室温下衍生反应10h连接上FITC荧光基团;毛细管电泳分离条件为pH10.3100mmol/L硼酸-Tris缓冲液。结果: 在选定的实验条件下,方法检测限(S/N=3)达2.1nmol/L水平,批内相对标准差(RSD)为3.4%,回收率达96.05%,在10-8~10-10mol/L范围内呈良好线性关系。结论: 应用毛细管电泳-激光诱导荧光法可检测鼠脑组织多巴胺含量。     

尿中多胺的毛细管电泳激光诱导荧光测定法

目的：建立高效毛细管区带电泳(CZE)激光诱导荧光(LIF)测定人尿中多胺(POL)的新方法。方法：样品用5mmoL／L的HClO4分离蛋白，样品中多胺与异硫氰酸荧光素(FITC)完成衍生反应后，用四甲基乙二胺(TEMED)作内标，在15mmol／L的硼酸盐缓冲液(pH8．5)中，运用毛细管区带电泳进行色谱分离，以激光诱导荧光测定法测定多胺。结果：多胺测定在10-200μg／L范围内具有良好的线性关系(r=0．996)，最低检测限为16μg/L，日内变异系数(CV)3.51％-4．61％，日间变异系数(CV)3．74％-4．83％，方法平均回收率为96.00％-99．33％．结论：本方法简便、快速、定量可靠，可用于临床实验室测定人尿中多胺水平。     

尿中多胺的毛细管电泳激光诱导荧光测定法

目的 :建立高效毛细管区带电泳 (CZE)激光诱导荧光 (LIF)测定人尿中多胺 (POL)的新方法。方法 :样品用 5mmol/L的HClO4分离蛋白 ,样品中多胺与异硫氰酸荧光素 (FITC)完成衍生反应后 ,用四甲基乙二胺(TEMED)作内标 ,在 15mmol/L的硼酸盐缓冲液 (pH 8.5 )中 ,运用毛细管区带电泳进行色谱分离 ,以激光诱导荧光测定法测定多胺。结果 :多胺测定在 10～ 2 0 0 μg/L范围内具有良好的线性关系 (r =0 .996 ) ,最低检测限为 16μg/L ,日内变异系数 (CV) 3.5 1%～ 4 .6 1% ,日间变异系数 (CV) 3.74 %～ 4 .83% ,方法平均回收率为 96 .0 0 %～ 99.33%。结论 :本方法简便、快速、定量可靠 ,可用于临床实验室测定人尿中多胺水平     

儿茶酚胺和二羟苯乙酸的区带毛细管电泳测定法

目的　建立儿茶酚胺和二羟苯乙酸 (Dopac)的毛细管电泳检测方法。　方法　区带毛细管电泳测定儿茶酚胺和 Dopac分离缓冲液为含 5 7mm ol/ L Na H2 PO4,0 .2 m mol/ L EDTA,1.2 mmol/ L HSA和 8%甲醇的缓冲溶液 p H =3.2 ,紫外检测波长为 2 0 0 nm。　结果　儿茶酚胺和 Dopac的分离效果和重现性良好 ,灵敏度可达 5× 10 - 9g/ ml,在 0 .0 1～ 0 .32 μg/ m l浓度范围线性关系好。　结论　本方法用于儿茶酚胺和 Dopac的分析具有快速、简便、耗材少的优点。     

芸香苷诱导K562细胞凋亡机制

目的研究芸香苷诱导白血病K 562细胞凋亡过程中caspase-3基因及细胞色素C的表达。方法体外培养白血病K 562细胞,M TT法观察细胞毒作用,测定IC50,Hoechst 33342/P I双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞周期,TR IZOL试剂提取K 562细胞RNA,核酸定量仪检测纯度,RT-PCR扩增,紫外透射检测扩增产物,扩增产物测序,观察caspase-3的表达,4×1-0 5m o l/L药物处理细胞后,分离细胞线粒体和胞浆,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,W estern b lotting检测线粒体、细胞浆细胞色素C表达。结果芸香苷浓度为2×1-0 5、4×10-5、8×10-5m o l/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;不同浓度芸香苷处理K 562细胞44h后,应用M TT比色法计算IC50为4×1-0 5m o l/L;4×10-5m o l/L芸香苷处理细胞24 h后,Hoechest 33342/P I双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现;流式细胞仪检测芸香苷处理后G2期细胞显著增多(64.7%),DNA合成受抑,凋亡率增加;PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳,紫外透射仪下明显观察到500 bp条带,产物经过序列测定证实芸香苷处理细胞诱导caspase-3基因的表达;W estern B lotting检测线粒体细胞色素C表达水平下调,细胞浆出现明显细胞色素C蛋白条带。结论芸香苷诱导K 562细胞caspase-3基因表达,细胞色素C通过线粒体膜进入胞浆,导致细胞线粒体功能异常,细胞发生凋亡,线粒体途径诱导白血病细胞凋亡是其作用机制之一。     

人黑皮素4受体F261S突变基因的克隆和功能验证

目的　研究黑皮素 4受体(MC_4R)基因的新突变F261S是否造成了MC4R蛋白功能改变。方法　用携带F261S纯合突变的先证者及正常人的基因组DNA,PCR扩增突变型及野生型MC4R基因全长,克隆到topo -TA真核表达质粒载体,测序鉴定后转染人胚肾 293细胞。用浓度为 1×10-11 ~1×10-5 mmol/L的α -黑色素细胞刺激素(α- MSH)与表达的MC4R蛋白结合后,用双荧光素酶报告基因测试系统检测胞内cAMP,萤火虫荧光 /海洋腔肠荧光二者强度之比体现了cAMP浓度。结果　α- MSH浓度在 1×10-9 ~1×10-8 mmol/L时野生型胞内双荧光强度比值显著高于突变型细胞(P<0 .05),在 1×10-7 ~1×10-5 mmol/L时差异更为显著 (P<0 .01)。结论　F261S突变使MC_4R介导的信号转导能力下降,此突变与中国人早发性肥胖有关。     

DHCC受体检测方法的研究

本文采用葡聚糖包裹的活性炭石(DCC)法、羟基磷灰石(HAP)法及等电聚焦电泳(IEF)法,在各种条件下检测了1.25(OH)_2D_3(DHCC)受体的含量。这3种方法得到的表现解离常数(Kd)分别等于4.2×10~(-9)mol/L、2.3×10~(-9)mol/L和6.4×10~(-9)mol/L;该受体蛋白分别在10nmol/L、8nmol/L和30nmol/L浓度的〔~3H〕DHCC处被饱和。该受体对D_3类似物的结合能力依次为1,25(OH)_2D_3>>25(OH)D_3>D_3≈E_2。我们所测佝偻病鸡3种组织中该受体含量依次为肠>输卵管壳腺>>肝。用DCC法,在4℃孵育2～5h,结合最稳定。用KTED缓冲液测得的胞液DHCC受体含量比用TED缓冲液高(P<0.05)。     

芯片毛细管电泳法测定盐酸阿霉素注射剂中盐酸阿霉素含量

目的 建立用微流控芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测盐酸阿霉素注射剂中盐酸阿霉素含量的方法.方法 以荧光素钠为内标物,20 mmol/L的Na2B4O7 -NaOH缓冲溶液(pH 10.0)作为电泳缓冲液,采用夹流进样和分离方式,进样电压500 v,分离电压1800 V.结果1.5 min内即可完成进样和分离,盐酸阿霉...     

抗氧化剂An7845对K562白血病细胞的增殖抑制和凋亡诱导活性

目的：观察抗氧化剂An7845在体外对K562白血病细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察抗氧化剂An7845对K562细胞增殖的影响,采用细胞形态学及DNA片段凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果：不同浓度的An7845（5×10-8～5×10-5 mol/L）对K562细胞具有抑制增殖的作用,并呈剂量依赖关系。经An7845（5×10-7 mol/L）处理后,K562细胞在形态学上可见明显凋亡细胞,DNA琼脂糖凝胶电泳谱可见DNA梯形带。结论：抗氧化剂An7845能抑制K562白血病细胞增殖和诱导其凋亡。     

组胺对人角质形成细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的探讨组胺对体外培养人角质形成细胞（HKC）增殖、凋亡和分化的影响及其机制.方法采用MTT法和蓝染色法检测组胺对HKC体外生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期和细胞早期凋亡,细胞DNA梯度降解法检测凋亡,激光扫描共聚焦显微镜结合钙荧光探针技术检测HKC胞内游离Ca^2＋浓度（[Ca^2＋]i）,SABC免疫细胞化学法检测HKC分化标志物角蛋白10（K10）及内披蛋白表达.结果高浓度组胺抑制HKC生长,以10^-4 mol/L抑制率最大（细胞存活率65.6%）;低浓度组胺则促进HKC生长,以10^-8mol/L作用显著（细胞存活率130.7%）.10^-4mol/L组胺致HKCG0/G1期比例增高30.97%,S期比例减少73.81%,抑制G1/S期转换,并明显促进细胞凋亡,早期凋亡率18.64%明显高于对照组（5.60%,P＜0.05）.10^-4mol/L组胺使HKC[Ca^2＋]i上升58.9%,H2组胺受体拮抗剂西咪替丁则使[Ca^2＋]i下降24.5%.10^-4mol/L组胺下调HKC K10及内披蛋白表达,但与对照组无显著性差异（P＞0.05）.结论高浓度组胺阻抑HKC细胞周期进程、诱导[Ca^2＋]i增加及其显著的促凋亡作用可能是使HKC体外生长受抑的部分机制.在生理条件下,组胺可能具有调节表皮组织更新的作用;在炎症、损伤等病理条件下,大量的组胺可能抑制表皮的再生和KC的分化.     

二苯胺法定量检测细胞凋亡

目的 :建立二苯胺定量检测细胞凋亡的实验方法。方法 :以地塞米松体外作用 5h的小鼠胸腺细胞作为凋亡阳性细胞 ,应用二苯胺法测定细胞片段化DNA和总DNA的含量 ,二者的比值定义为细胞凋亡率。结果 :地塞米松 (1× 10 - 5mol L)处理 5h后 ,细胞凋亡率为 30 .2 4 %。此与流式细胞仪分析结果 (2 7.10 % )基本一致。结论 :建立了一种简单、经济、快速的细胞凋亡定量检测方法     

新型氨基甾体对WEHI-3B白血病细胞作用的研究

目的 :观察新型氨基甾体 (KH)对小鼠粒单系白血病细胞系WEHI 3B细胞增殖、分化和凋亡的影响 ,并初步探讨其作用机制。方法 :采用集落培养及细胞毒性实验检测KH对WEHI 3B细胞增殖的影响 ;用NBT还原实验及NSE染色检测KH对WEHI 3B细胞分化的影响 ;用形态学观察和DNA片段凝胶电泳检测KH对WEHI 3B细胞凋亡的影响 ;用RT PCR检测癌基因c mycmRNA在WEHI 3B细胞中表达水平的变化。结果 :KH(10 -8～ 10 -4 mol·L-1)能抑制WEHI 3B细胞增殖 ;其较低浓度 (10 -8～ 10 -6mol·L-1)即可诱导WEHI 3B细胞向单核巨噬样细胞分化 ,较高浓度 (10 -6～ 10 -4 mol·L-1)诱导WEHI 3B细胞的凋亡作用增强 ;KH在抑制WEHI 3B细胞增殖 ,诱导其分化和凋亡过程中癌基因c mycmRNA表达水平明显降低。结论 :KH能抑制WEHI 3B细胞增殖 ,诱导其分化和凋亡。上述作用与癌基因c myc的表达有关。     

10-23 DNA enzyme对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的切割活性

目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的底物RNA,观察D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9对其的体外切割效应。以D rzBC-9为例,观察不同浓度的M gC l2对体外切割效率的影响,根据L inew eaver Burk作图法,计算相关的酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km。结果:通过体外转录获得用于切割反应的底物RNA,其大小为300 nt。在特定的切割条件下,D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9均能对相应的底物RNA进行有效的切割,切割产物分别为109 nt和191 n。t以D rzBC-9为例,在切割反应体系中缺乏M gC l2时,未见有切割反应。M gC l2浓度在150 mm o.lL-1时达到最高切割效率,再提高M gC l2的浓度,切割效率未见明显增大。酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km分别为1.4×10-9m o.lL-1,1.6 m in-1和1.1×109m o.lL-1.m in-1。结论:针对乙型肝炎病毒C基因的10-23 DNA enzym e在体外对相应的转录产物有特异切割作用。     

Additive potentiation by co application of propofol and sevoflurane on GABA induced chloride current in cultured neurons from rat dorsal root ganglia

Ａｌｔｈｏｕｇｈｍａｎｙｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓｏｆａｎｅｓｔｈｅｓｉａｈａｖｅｂｅｅｎｐｒｏｐｏｓｅｄ,ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｎｄａｌｓｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｃｉｔａｔｏｒｙｓｙｎａｐｔｉｃｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ,ｔｈｅｅｘａｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｒａｌａｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓｏｎｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍｒｅｍａｉｎｓｕｎｄｅｆｉｎｅｄ1　Ｈｏｗｅｖｅｒ,ｓｐｅｃｉｆｉｅｄｔａｒｇｅｔｓｉｔｅｓｏｆａ…     

辛伐他汀对鼠心脏成纤维细胞DNA合成的影响

目的探讨辛伐他汀(Sim)对新生SD大鼠心脏成纤维细胞(CFs)DNA合成的影响及甲羟戊酸(MVA)的干预效应。方法采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠CFs,以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定DNA合成,观察不同浓度Sim及MVA分别作用不同时间对CFsDNA合成功能的影响。结果 (1)CFs的3H-TdR掺入率随着Sim干预浓度的增加而降低,其中10-6和10-5mol／L Sim组的3H-TdR掺入率分别为(1175±202．66)、(771±164．86)cpm／2000细胞, 显著低于对照组的(1608±204．32)cpm／2000细胞(均P<0．01);(2)10-5mol／L Sim作用CFs 6、12、18、24、30、36、42、48 h, 随着Sim作用时间的延长,CFs的3H-TdR掺入率呈递减趋势,与时间呈明显的负相关(r=-919,P<0．01);(3)CFs的3H-TdR 掺入率随着MVA干预浓度的增加呈进行性上升,其中10-4、10-3 mol／L MVA 10-5 mol／LSim组3H-TdR掺入率分别为 (1612±308．57)、(1995±353．83)cpm／2000细胞,显著高于对照10-5mol/L Sim组的(771±164．86)cpm／2000细胞(P<0．01); (4)10-3 mol／L MVA分别作用CFs 6-48 h,CFs的3H-TdR掺入率随着MVA作用时间的延长而逐渐增加,呈明显的正相关(r=0．968,P<0．01)。结论 Sim呈浓度-时间依赖方式抑制CFs DNA的合成且可被MVA拮抗,提示Sim可抑制CFs 增殖,延缓心肌纤维化,其作用可能通过MVA途径实现。     

葛根素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察葛根素对凝血酶诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响,对原癌基因c-fos和bc l-2蛋白质以及凝血酶受体(TR)mRNA表达的作用。方法以细胞计数法,流式细胞仪测定DNA含量,细胞周期分析法观察凝血酶及葛根素对VSMC增殖和DNA合成的影响。在凝血酶及葛根素作用24 h后,用W estern印迹法检测c-fos和bc l-2蛋白表达,以半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TR mRNA的表达。结果凝血酶对VSMC有明显促增殖作用,促增殖效应在24 h末达峰值(细胞计数凝血酶组8.64×104/m l±0.12×104/m l,对照组4.20×104/m l±0.11×104/m l,P<0.05),且凝血酶浓度在0.1~1.0 U/L之间呈剂量依赖关系;葛根素呈剂量依赖性地抑制凝血酶诱导的细胞增殖、DNA合成以及VSMC c-fos和bc l-2蛋白的表达(葛根素浓度为1.5×10-3mol/L时,抑制率分别为42.6%±5.2%、58.2%±7.9%、44.5%±7.5%和39.6%±6.4%,均P<0.05);高浓度(1.5×10-3mol/L)的葛根素可显著抑制凝血酶诱导的TR mRNA上调(抑制率为17.6%±1.7%,P<0.05)。结论葛根素能抑制凝血酶诱导的VSMC增殖,这可能与其抑制c-fos和bc l-2蛋白有关,并部分与其抑制TR mRNA表达有关。     

缺氧对P物质、降钙素基因相关肽舒血管作用的影响

本文采用兔离体动脉(肾动脉,股动脉和基底动脉)浸浴实验。结果表明,缺氧可抑制P物质和降钙素基因相关肽的舒血管作用,并且缺氧对降钙素基因相关肽舒血管作用的影响较大。三种动脉比较,缺氧对基底动脉反应性的影响最为显著。