神经生长因子对瘢痕成纤维细胞生物学特征的影响

背景：神经生长因子由多种细胞分泌合成,如炎性细胞、修复细胞等,其生物学作用呈多样性,与创伤修复过程密切相关,但其作用机制尚不明了。 目的：观察神经生长因子对瘢痕成纤维细胞生物学特征的影响。 方法：8份临床手术切除标本,其中5份为面颈部增生性瘢痕或瘢痕疙瘩标本,未接受过任何治疗;3份为包皮环切术切除的包皮标本(正常组织)。采用组织块法培养瘢痕及正常皮肤成纤维细胞,消化法传代。取3~6代对数生长期瘢痕组织及正常组织成纤维细胞,接种于96孔培养板中,设置实验组(瘢痕成纤维细胞组)和对照组(正常皮肤成纤维细胞组),每组设两个平行孔,分别加入3.33,0.33 mg/L神经生长因子各50 µL。采用倒置显微镜观察成纤维细胞形态。培养24,48,72 h后, MTT测定各孔的吸光度。流式细胞术分析成纤维细胞DNA含量及细胞凋亡情况。 结果与结论：成纤维细胞为贴壁生长型细胞,瘢痕和正常皮肤组织块在接种后4~6 d可见细胞从组织块中游出,逐渐向周围扩展开。与正常皮肤成纤维细胞相比,病理性瘢痕成纤维细胞体积较大,形态和排列不规则。MTT结果显示,神经生长因子可促进正常及瘢痕成纤维细胞的增长,后者更为明显。流式细胞术测定结果显示,加入神经生长因子后,瘢痕成纤维细胞增殖期S-G2-M细胞百分数高于对照组,且凋亡水平降低。提示神经生长因子对正常及瘢痕皮肤成纤维细胞的生长趋势与增殖活性有明显的促进作用,对瘢痕皮肤的作用更明显。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。 目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。 方法：取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。 结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

分离培养方法及冻存技术对犬骨髓间充质干细胞生长和增殖的影响

背景：骨髓间充质干细胞在体外长期培养易发生自发分化,而失去多分化潜能,因此必须对培养的细胞及时冻存,需要时再进行复苏。 目的：建立犬骨髓间充质干细胞体外分离、培养、增殖、冻存的方法。 设计、时间及地点：对照观察细胞学实验，于2005-06/2008-06在浙江中医药大学附属第一医院骨伤研究所完成。 材料：健康成年雄性Beagle犬用于骨髓间充质干细胞的提取。 方法:采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞,并进行传代扩增培养。将第2代骨髓间充质干细胞与12.5% DMSO混匀置于冻存管中，采用慢冻快融法进行冻存和复苏：将冻存管置于-4 ℃冰箱2 h,然后移入-30 ℃冰箱2 h，再置于厚壁塑料泡沫盒中,扎紧密封,置-80 ℃冰箱过夜后,取出冻存管直接放入液氮中保存,或放入-80 ℃冰箱保存。复苏时将冻存管从液氮或- 80 ℃冰箱中取出,立即置37 ℃ 水浴并轻轻摇动, 1~2 min内迅速解冻。 主要观察指标：复苏前后细胞成生长活性及形态变化。 结果：分离的骨髓间充质干细胞为以均一的梭形的成纤维细胞样贴壁生长,贴壁及增殖能力强，传代细胞贴壁较快。经过液氮长期冻存后, 将复苏后的骨髓间充质干细胞再培养,细胞形态及生长状态与冻存前无差异,均呈长梭形均匀分布生长,细胞生长增殖旺盛。 结论：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法可获得犬骨髓间充质干细胞，应用慢冻快融技术进行冻存和复苏，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的：建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法，探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性。方法：采用10％BSA＋7．5％DMSO作冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力，形态及分化能力作鉴定。结果：不同的冻存时间，细胞代数，组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异（P＞0．05）。冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并能分化成神经元，星形胶质细胞细胞和少突胶质细胞。结论：大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的，增殖能力和多向分化能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞向组织工程化韧带种子细胞诱导的比较

背景：关节病中韧带损伤难以治愈，且传统的韧带替代物有很多不足。利用组织工程方法治疗关节病，需要选择适合的种子细胞。 目的：观察诱导分化SD大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞作为韧带组织工程种子细胞的可行性。 方法：胰酶-去垢剂法制备去细胞韧带组织；密度梯度离心和贴壁细胞培养相结合的方法体外分离扩增大鼠骨髓间充质干细胞，成纤维细胞生长因子诱导其分化为成纤维细胞，设大隐静脉间质细胞为对照，比较2种细胞形态学、增殖能力、胶原合成以及在韧带上的生长情况方面的异同。 结果与结论: 大鼠骨髓间充质干细胞及大隐静脉来源细胞均为贴壁生长，形态为梭形或多角型，两者的冻存和复苏率、合成胶原能力方面无显著差异，都能种植在韧带组织上并在其上面生长。骨髓间充质干细胞诱导分化的成纤维细胞与静脉来源的间质细胞之间无显著差异。 关键词：大隐静脉；骨髓间充质干细胞；种子细胞；组织工程；诱导分化；韧带；大鼠     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及冻存

目的体外培养、冻存大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点及复苏后的活性。方法取孕15d的大鼠海马区细胞,体外培养。以20%牛血清白蛋白(BSA)加10%二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护剂,于液氮中冻存。复苏后计数活细胞数,免疫细胞化学鉴定其分化状态。结果第1~4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40%~63%之间,差异无统计学意义。冻存复苏后的NSCs能够存活、传代,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外增殖、分化,并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

姜黄素对瘢痕疙瘩成纤维细胞周期及其核转录因子κB信号转导通路的影响

背景：有研究表明姜黄素具有抗器官纤维化的作用,具抑制增殖及诱导G0/G1期细胞累积的作用,但姜黄素可否影响瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞周期,活化核转录因子κB通路,从而抑制瘢痕增生至今少有报道。 目的：观察姜黄素对体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞周期的影响及其核转录因子κ B信号转导通路的变化。 方法：瘢痕疙瘩成纤维细胞进行体外原代培养,待细胞融合后传代,取第6~8代对数生长期的成纤维细胞用于实验。将不同浓度姜黄素(10,20,30,40,50,60 µmol/L)分别对瘢痕疙瘩成纤维细胞干预。用流式细胞仪测定细胞周期;免疫组织化学法检测核转录因子κ B的表达。 结果与结论：姜黄素呈剂量和时间依赖性抑制成纤维细胞的增生(P < 0.05),使细胞周期停滞在G1期,核转录因子κB表达随姜黄素剂量的增大而减小(P < 0.05)。结果显示,姜黄素能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并使细胞周期停滞在G1期,姜黄素可能通过抑制核转录因子κB信号转导通路的活化,从而发挥其抗纤维化的作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的:建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法,探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性.方法:采用10%BSA+7.5%DMSO作冷冻保护剂,于液氮中冻存;采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力、形态及分化能力作鉴定.结果:不同的冻存时间、细胞代数、组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异(P＞0.05).冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活,能在体外多次传代,并能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.结论:大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的形态、增殖能力和多向分化能力.     

人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养与生物学特性

背景：胚胎骨来源成骨细胞因其低免疫原性和高增殖与成骨活性有可能成为适用于骨组织工程方法异体骨组织缺损修复的种子细胞。冻存复苏后的生物学特点是否能进行进一步临床应用研究有待证实。 目的：建立人胚胎骨骨膜来源成骨细胞的分离培养、保存方法,观察骨膜来源成骨细胞生物学特点。 设计、时间及地点：细胞形态学与生物学特性实验研究,于2005-04/2006-05在天津市口腔医院细胞与组织工程实验室完成。 材料：细胞来源为5月龄自然流产胎儿,产妇及家属知情同意,无菌条件下取长骨骨膜组织。 方法：采用组织块法对成骨细胞进行原代培养,传代培养细胞液氮冻存3~6个月后,选择不同代次细胞复苏培养。 主要观察指标：通过形态学、超微结构,细胞增殖曲线,钙结节Von kossa法染色以及细胞内碱性磷酸酶定量检测与钙钴法染色确定其增殖与成骨活性。 结果：组织块法培养骨膜来源成骨细胞第6天即可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。苏木精-伊红染色密集融合的成骨细胞与细胞外基质显示转化为脊样骨组织结构排列。经统计学分析定量检测成骨细胞碱性磷酸酶活性与细胞密度有线性正相关关系。液氮冷冻保存后复苏培养复层成骨细胞钙钴法碱性磷酸酶染色阳性率在45%以上,超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞。 结论：胚胎骨骨膜来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性。深低温液氮冻存成骨细胞复苏后仍能连续传代增殖并具有良好的成骨代谢活性,能够体外借助细胞外基质形成骨样结构。     

羟基喜树碱与人病理性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景：课题组前期实验表明病理性瘢痕成纤维细胞中拓扑异构酶Ⅰ存在高表达,实验以此设想作为拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的羟基喜树碱能否抑制体外培养的人病理性瘢痕成纤维细胞的增殖？ 目的：探讨羟基喜树碱对人病理性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。 方法：体外培养人病理性瘢痕成纤维细胞。选取羟基喜树碱2~1 000 μg/L共10个药物质量浓度梯度,分别选取给药后24,48和72 h时间点,采用MTT法检测羟基喜树碱对成纤维细胞生长的抑制作用。 结果与结论：低质量浓度(2~8 μg/L)下羟基喜树碱对成纤维细胞的增殖有抑制作用,质量浓度8~125 μg/L时出现平台期,质量浓度125~500 μg/L时抑制作用进一步增强,说明羟基喜树碱对成纤维细胞的增殖的抑制作用具有明显的剂量依赖性。药物作用质量浓度和成纤维细胞抑制率呈正相关(r=0.87,P < 0.05)。随着作用时间延长,细胞抑制率无明显增加,药物作用24,48和72 h后,半数抑制率(IC50)分别为233,176及103 μg/L。因此实验推论羟基喜树碱能够抑制体外培养的人病理性瘢痕成纤维细胞的增殖。     

己酮可可碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响

背景：近年来发现己酮可可碱有广泛的抗纤维化作用,但己酮可可碱对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制作用却少见报道,且其最大抑制剂量尚无定论。 目的：观察己酮可可碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的作用,并筛选己酮可可碱的最大抑制浓度。 方法：以人瘢痕疙瘩组织作成纤维细胞原代培养,传至第5~8代后将细胞分为实验组和对照组,实验组加入质量浓度为0.1,0.25,0.5,1.0,2.0,3.0 g/L的己酮可可碱,利用MTT比色法检测成纤维细胞的增殖活性。 结果与结论：与对照组相比,实验组成纤维细胞增殖抑制率较高(P < 0.05),质量浓度在0.1~2.0 g/L范围内呈明显的量效、时效关系,96 h处于较高水平。实验组最大抑制率为53.37%,最大抑制质量浓度为2.0 g/L。结果表明己酮可可碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖有明显的抑制作用,最适抑制质量浓度为2.0 g/L,发挥抑制作用最强的时间为给药后96 h。     

昆明鼠胚胎干细胞系的建立及其特性

背景：到目前为止,国际上通用的动物胚胎干细胞细胞系大多是从129品系和C57BL/6系小鼠中获得的,少部分来自BALB/C系,来自于中国昆明鼠则鲜有报道。 目的：分离培养昆明系小鼠胚胎干细胞,并对其生物学特性进行初步鉴定。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察性实验,于2006-05/2007-06在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。 材料：昆明小鼠3.5 d胚龄的囊胚。 方法：自昆明系小鼠3.5 d胚龄的囊胚分离内细胞团细胞,接种于小鼠原代胚胎成纤维细胞饲养层上,对分离的内细胞团细胞进行扩增、传代培养。 主要观察指标：观察胚胎干细胞集落的生长情况,对其碱性磷酸酶表达进行染色分析,采用免疫荧光法检测其阶段特异性胚胎抗原1表达,以反转录-聚合酶链反应检测其特异性表达因子c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2的基因表达情况,并对其体内外分化能力对进行鉴定分析。 结果：分离、培养自内细胞团的细胞呈典型的胚胎干细胞集落样生长,碱性磷酸酶染色及阶段特异性胚胎抗原1荧光染色阳性,细胞表达c-Myc,Nanog,Oct3/4和Sox2等基因,细胞在体内外均能分化成来源于不同胚层的多种细胞类型。 结论：成功从昆明小鼠囊胚中分离并建立一株胚胎干细胞系,其生物学特性与其他胚胎干细胞株相符。     

Cell culture study on neurofibromatosis

Cells obtained on culture from normal appearing skin (NFns) and from neurofibromas of neurofibromatosis patients (NFnf), and from normal skin of normal donors (Normal) were studied. We measured the growth rate, maximal cell density, radiation sensitivity and resistance to 3-nitrotyrosine of each of the three groups of strains. The growth rate and maximal cell density of fibroblasts derived from neurofibromas of the neurofibromatosis patients were significantly lower than those in normal donors. The neurofibromatosis cells showed no X-ray hypersensitivity, as compared to normal controls. We also did not observe resistance to 3-nitrotyrosine of the cells derived from normal appearing skin of the neurofibromatosis patients. However, cells derived from neurofibromas of the neurofibromatosis patients showed resistance to 3-nitrotyrosine. This phenomenon may explain the slow growth rate of the latter cells.     

正常成人脑海马区多潜能神经前体细胞的体外分离鉴定

目的 从正常成人脑海马分离鉴定多潜能神经前体细胞并探讨体外培养条件.方法 材料取自8例非神经系统疾病的死亡者.分离正常成人脑海马细胞,在培养基中添加生长因子体外培养.通过细胞培养成球和BrdU染色鉴定培养细胞的增殖能力.利用免疫细胞化学三标染色来鉴定分化神经细胞的表型.结果 从正常人海马分离的细胞培养2周时,开始增殖成簇,致一个月时,形成细胞球,这些细胞能与BrdU结合,并能在体外分化成神经系统不同谱系的细胞.结论 与在啮齿类动物和猴的研究中结果一致,从正常成人脑海马区分离的细胞是多潜能神经前体细胞.     

Tuberous sclerosis: aberrant proline sensitivity of skin fibroblasts

Cultured skin fibroblasts from patients with tuberous sclerosis were analyzed as to their sensitivities to proline, glutamic acid and arginine, and their analogues by means of a cell growth study. A difference was observed between tuberous sclerosis and normal cells when proline was added. Skin fibroblasts derived from normal-appearing skin of tuberous sclerosis patients exhibited sensitivity to proline. Skin fibroblasts derived from tumorous skin of tuberous sclerosis patients exhibited resistance to proline in the cell growth study and was found to be rather sensitive to proline in a colony formation study. This aberrant sensitivity to proline of tuberous sclerosis cells may indicate abnormal proline metabolism in tuberous sclerosis patients.     

Decreased survival of hippocampal neurons in medium conditioned by fibroblasts from aged and Alzheimer donors

Medium conditioned by fibroblasts promotes survival and neurite outgrowth of cultured hippocampal neurons. Sub-confluent cultures of cells from normal young, aged and Alzheimer donors conditioned serum-free medium for 2 days. Hippocampal neurons from 18- to 19-day-old embryos were maintained in medium conditioned by skin fibroblasts from young, aged or Alzheimer donors. One, 4 and 7 days after plating the cells were examined for morphological differences. Neuron survival four days after plating was found to be the highest in medium conditioned by young greater than aged greater than Alzheimer cells. These findings suggest that both aged and Alzheimer donors secrete less of the substances that are necessary for survival and neurite outgrowth of hippocampal neurons. This provides further evidence that non-neuronal cells demonstrate abnormalities during aging and Alzheimer's disease.     

骨髓间充质干细胞定向分化为心脏瓣膜构成细胞及鉴定

背景：心脏瓣膜的组成成分中不是只有内皮细胞发挥作用,成纤维细胞、平滑肌细胞等均参与心脏瓣膜基质成分构建。 目的：建立可以在体外获得大量内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞的简便方法,并对获得细胞进行形态观察及表面标志鉴定。 方法：全髓贴壁法获取大鼠原代骨髓间充质干细胞,体外培养、扩增,第3代细胞在特定条件下分别向内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞方向诱导分化,每日于倒置显微镜下观察细胞生长情况,并对诱导分化的细胞行免疫细胞化学检测。 结果与结论：骨髓间充质干细胞在特定条件下诱导培养后,诱导后的细胞分别具有内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的特点。提示骨髓间充质干细胞在体外可以定向分化为内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞。     

Intracerebral grafting of cultured autologous skin fibroblasts into the rat striatum: an assessment of graft size and ultrastructure

To identify a suitable donor cell population for gene therapy applications to the central nervous system, primary fibroblasts isolated from skin biopsies and maintained in culture are employed as autologous cells for intracerebral grafting within the adult rat striatum. Results from the present investigation reveal that cultured primary skin fibroblasts cease to proliferate once they reach confluence; these cells are thus contact inhibited in vitro. Following implantation within the striatum, the volume of the primary fibroblast grafts, stained immunohistochemically for fibronectin, does not differ significantly at 3 and 8 weeks. The graft size is dependent on the density of the cell suspension, but not dependent on either the number of passages the cells are taken through in culture prior to grafting or on the postoperative survival period. Ultrastructural evidence reveals that at 8 weeks the grafts are composed primarily of collagen and fibroblasts with rough endoplasmic reticulum and vesicles. Reactive astrocytic processes and phagocytic cells are also present in the grafts. The grafts are extensively vascularized with capillaries composed of nonfenestrated endothelium; intercellular junctions are evident at sites of apposition between endothelial cells. It is concluded that primary skin fibroblasts are able to survive for at least 8 weeks following intracerebral implantation and continue to synthesize collagen and fibronectin in vivo. Also, the grafts maintain a constant volume between 3 and 8 weeks, thereby indicating that primary skin fibroblasts do not produce tumors. Finally, dynamic host-to-graft interactions--including phagocytic migration, astrocytic hypertrophy and infiltration within the grafts, and angiogenesis--are features that constitute the structural integration of primary skin fibroblasts grafted within the adult rat central nervous system.     

Abnormal growth of skin fibroblasts from schizophrenic patients

Fibroblast cultures were established from skin biopsies of 18 schizophrenic patients (14 on drug and 4 off drug) and 13 normal subjects, and growth parameters (initial growth and rate of growth) and morphology were studied. Fibroblasts from patients took significantly longer to grow than did normal fibroblasts. Cell lines were established within 2 weeks for all normal controls, but for only 6 (33%) of 18 schizophrenic patients. The rate of growth (doubling time) was also significantly longer for fibroblasts from patients than from normals. Neither time to establishment of initial growth nor doubling time was related to age, sex, age at onset, duration of illness, or medication status in the patients. Fibroblasts from normals showed uniform, long (slender), characteristic spindle-like, bipolar appearance, with unidirectional orientation, both while growing from explant as well as after subculturing. By contrast, fibroblasts from patients generally showed random size (shorter and flatter), mostly spiny, multipolar cells with short stubby projections, and an irregular orientation resulting in a criss-cross pattern, and often exhibited poor attachment. Fibroblasts from skin biopsies of patients who were drug free at the time of biopsy showed similar initial growth, doubling time, and morphology to those from patients who were receiving neuroleptic treatment. In vitro challenge of skin biopsies of normal subjects with haloperidol in culture resulted in slight delay in initial growth and marginal increase in doubling time. However, the morphology remained normal. Possible molecular mechanisms that may be associated with abnormal growth of fibroblasts in schizophrenia are discussed.