三叶木通AFLP反应体系的建立及优化

目的 为研究三叶木通种质资源遗传多样性,建立并优化三叶木通 AFLP 反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料,对影响 AFLP 反应体系中连接、预扩增和选择性扩增的各因素进行分析,建立优化的 AFLP 反应体系。结果 建立三叶木通 AFLP 反应优化体系：连接体系加入 T₄ 连接酶 2 U,Mse I 接头 100 pmol,EcoR I 接头 10 pmol;预扩增反应总体积 20 μL,加入连接产物 2.0 μL,E-0、M-0 各 100 ng,dNTPs 0.250 mmol/L, Mg²⁺ 1.875 mmol/L, Taq DNA 聚合酶 2 U;选择性扩增反应总体积 20 μL,加入 5 μL 稀释 100 倍的预扩增产物,E₃、M₃ 各 50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L, Mg²⁺ 1.875 mmol/L, Taq DNA 酶 1.5 U。结论 建立适用于三叶木通种质资源遗传多样性研究的 AFLP 反应优化体系。     

三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选

目的 研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的最佳反应体系。结果 建立的MSAP最佳反应体系为酶切反应：HpaII/MspI 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应：总体积20 μL,连接产物2 μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg^2＋ 1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2 U;选择性扩增反应：总体积20 μL,稀释200倍的预扩增产物5 μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg^2＋ 1.250 mmol/L,Taq DNA酶1 U。利用优化的体系,最终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对。结论 建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究。     

基于方差分析优化菊花ISSR-PCR反应体系

目的 对影响药用菊花ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法 基于方差分析方法,利用正交试验从Taq酶、Mg²⁺、dNTP和引物等4因素3水平对药用菊花反应体系进行优化。结果 药用菊花ISSR-PCR的最佳反应体系：在20 μL的反应体系中,Taq酶1.00 U,Mg²⁺ 2.00 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,引物0.50 μmol/L。结论 Taq酶、Mg²⁺、dNTP等对ISSR反应结果有极显著影响。所建立的药用菊花ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于药用菊花的遗传多样性研究。     

薏苡SRAP反应体系的优化

目的 建立稳定可靠的SRAP分子标记反应体系,为进一步研究薏苡种质资源的分子鉴定提供依据。方法 采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,并采用单因素试验分析Mg²⁺浓度、dNTP浓度、BSA浓度、模板DNA用量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量等6个因素对薏苡相关序列扩增多态性(SRAP)扩增结果的影响。结果 建立了薏苡最适的SRAP反应体系：10 μL PCR反应体系中,含1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris·HCl,pH9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),1.5 mmol/L Mg²⁺,0.15 mmol/L dNTP,10 ng模板DNA,10 pmol引物,0.5 U Taq酶。结论 所建立的薏苡SRAP反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定等特点,为薏苡种质资源的分子鉴定提供了良好的基础。     

菝葜RAPD扩增条件优化

目的 研究菝葜的RAPD-PCR扩增体系最适宜的条件。方法 采用CTAB提取方法，从菝葜的嫩叶中提取总基因组DNA，以此为模板，优化菝葜RAPD-PCR的反应条件。结果 最适宜的PCR扩增体系为：反应体积30 μL，内含0.20 μmol/L引物、200 μmol/L dNTP、40 ng模板DNA、2 U Taq DNA聚合酶、2 μmol/L Mg²⁺。结论 通过扩增条件优化实验，建立了重复性好、稳定性高的药用植物菝葜RAPD-PCR扩增体系最适宜的条件，筛选出条带清晰多态性好的14条随机引物，共扩增得到144条电泳带，其中有多态性带62条，检测到了62个多态性位点，多态率为43%。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序，为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法 采用单因子试验和正交设计法，研究Mg²⁺、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果 天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25 μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg²⁺ 1.25 mmol/L、dNTP 320 μmol/L、引物1.2 μmol/L、Taq DNA 聚合酶1.5 U。在此基础上，从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物，并通过梯度PCR试验，确定引物最佳退火温度。结论 建立的天门冬ISSR-PCR反应体系，经过17份天门冬种质检验，证明该体系稳定可靠，可用于天门冬遗传分析。     

正交设计优化翼梗五味子ISSR-PCR反应体系

目的 对影响翼梗五味子ISSR-PCR扩增反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系。方法 基于正交极差分析方法,以Taq酶、Mg²⁺、模板DNA、dNTP和引物5因素4水平的正交试验对翼梗五味子ISSR-PCR反应体系进行优化。结果 翼梗五味子ISSR-PCR的最佳反应体系（20 μL）为：Taq酶1.00 U、Mg²⁺ 1.50 mmol/L、模板DNA 40.00 ng、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.50 μmol/L。筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并确定了每个引物的最佳退火温度。结论 所建立的翼梗五味子ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、重复性好等优点,为翼梗五味子的分子水平研究提供实验依据。     

水蛭ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的 建立并优化水蛭ISSR-PCR反应体系及扩增程序,为水蛭进行遗传多样性研究提供依据。方法 使用引物ISSR825,采用正交优化方法对影响PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行了体系优化,同时对引物的最佳退火温度进行了选择。结果 在25 μL总体积中,其中包括10×PCR 缓冲液 2.5 μL、Mg²⁺ 2.0 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、Taq DNA聚合酶2.5 U、模板DNA 2.0 ng/μL,最佳退火温度为49.7 ℃。结论 所建立的最佳ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可用于水蛭遗传多样性评价、不同种源鉴定及亲缘关系分析。     

三角叶黄连ISSR反应体系的建立与优化

目的 针对三角叶黄连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础。方法 通过筛选引物并设定影响三角叶黄连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立三角叶黄连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系。结果 建立了可用于三角叶黄连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系：25 μL PCR反应体系中,内含10×PCR Buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L Mg²⁺,200 μmol/L dNTP,0.3 μmol/L引物,40 ng模板,1.0 U Taq DNA聚合酶。扩增程序为94 ℃预变性5 min,然后进行35个循环：94 ℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性60 s,72 ℃延伸90 s,循环结束后72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。结论 所建立的三角叶黄连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于三角叶黄连的种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究。     

正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系

目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系。方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素（Mg²⁺、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度）进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测。结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响最大;地枫皮ISSR-PCR最佳反应体系（20 μL）为：Mg²⁺ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;最佳退火温度和循环次数分别为51.8 ℃和40次;从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析。     

海藻、芫花反甘草的研究进展

中药配伍中相反指两种药物合用产生或增强毒性或使疗效降低,而“十八反”是重要的配伍禁忌,也是现代药性理论争议最多的问题,且至今尚未形成较统一的判断标准和结论。主要介绍了“十八反”中有关海藻、芫花反甘草的毒性和机制研究,探讨了影响“十八反”的因素,并在此基础上提出根据不同药物的特点确定其特定部位的安全药理实验内容的观点。     

金钗石斛茎的化学成分研究

目的 对金钗石斛Dendrobium nobile茎的化学成分进行研究。方法 采用正相及反相硅胶柱色谱、凝胶柱色谱及制备高效液相色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据进行结构鉴定。结果 分离得到11个化合物,分别鉴定为石斛碱（1）、石斛醚碱（2）、邻苯二甲酸丁酯（3）、松脂素（4）、N-反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺（5）、N-反式阿魏酸酰对羟基苯乙胺（穆坪马兜铃酰胺,6）、N-顺式阿魏酸酰对羟基苯乙胺（7）、N-反式香豆酰酪胺（8）、N-顺式香豆酰酪胺（9）、山药素III（10）、二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯（11）。结论 化合物3、5～9均为首次从该植物中分离获得,其中化合物9为首次从石斛属植物中分离获得。     

小花八角化学成分研究

目的 研究小花八角Illicium micranthum的化学成分。方法 小花八角的枝叶提取物经醋酸乙酯萃取,余下水相经过反复的柱色谱分离、通过波谱分析确定化合物结构。结果 分离得到了1个新化合物和9个已知的成分,分别是小花八角苷（1）、7-β-D-glucosyl pseudomajucin（2）、4, 7, 9-trihydroxy-3, 3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan-9-O-α-L-rhamnopyranoside（3）、icariside E3（4）、isolariciresinol-3a-O-β-D-glucopyranoside（5）、芦丁（6）、杨梅树皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（7）、山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷（8）、山柰酚-8-C-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、莽草酸（10）。结论 化合物1为新化合物,是首次从八角属植物中分离到的seco-prezizaane型降倍半萜类化合物;化合物2～6为首次从该植物中分离得到。     

N-脂肪酰-N-三甲基壳聚糖的合成及其对蛇床子素的增溶作用

目的 合成2类两亲性壳聚糖（chitosan,CS）衍生物,自组装成聚合物胶束作为难溶性药物的新型递药载体。方法 先将CS与碘甲烷反应生成N-三甲基壳聚糖（trimethyl chitosan,TMC）,然后在TMC的氨基上引入长链脂肪酸（软脂酸和癸酸）,合成了两亲性的N-脂肪酰-N-三甲基壳聚糖（N-fatty acyl-N-Trimethyl chitosan,FA-TMC）衍生物。通过FT-IR、¹H-NMR和元素分析法,对衍生物的分子结构和N-位取代度进行表征,同时以疏水性药物蛇床子素（osthole,OST）为模型,探讨其胶束增溶特性。结果 实验合成了2类6种不同的新型CS衍生物,分析显示季胺化程度和脂肪酰基接枝率对FA-TMC的胶束性质有较大的影响;对于超声法制备的OST载药胶束,季胺化程度为62.00%、软脂酰基接枝率为13.37%的N-软脂酰-N-三甲基壳聚糖（N-palmitoyl-N-trimethyl chitosan,PA-TMC）和季胺化程度为43.06%、癸酰基接枝率为22.00%的N-癸酰-N-三甲基壳聚糖（N-caprinoyl-N-trimethyl chitosan,CA-TMC）的包封率分别为76.67%、79.11%,载药量分别为19.01%、19.08%,可使OST在水中的溶解度提高两个数量级。结论 FA-TMC是一种具有潜在应用价值的增溶载体,其在水中能自组装形成胶束,并对OST有明显的增溶作用,为OST制剂深入研究与应用奠定了基础。     

青枯菌诱导广藿香防御相关酶同工酶分析

目的 研究青枯菌诱导广藿香的致病过程及防御相关酶同工酶的动态变化。方法 利用青枯菌粗毒素诱导广藿香试管苗,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,对诱导植株中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）同工酶谱带的变化进行分析。结果 青枯菌诱导1～7 d后的广藿香植株,表现渐进的发病过程,开始时,植株失绿、少数叶片萎垂;逐渐植株茎杆弯曲、整株叶片萎蔫。同工酶电泳分析表明,SOD同工酶在第1、3天时分别出现了新谱带,与对照共有的谱带,强度先增后减;CAT同工酶在第3、5天时分别出现新谱带,第6天时强度达到最大;POD同工酶在第1、4天时分别出现了新谱带,强度先增后减,第7天时所有谱带消失。结论 青枯病的发生呈现渐进的过程。青枯菌诱导1～7 d,广藿香SOD、CAT和POD同工酶谱带在数目和强度上均有所不同,呈动态变化,表明SOD、CAT和POD在广藿香抵抗青枯菌入侵时可能起到较为重要的作用。     

黄连的化学成分研究

目的 研究毛茛科植物黄连Coptis chinensis根茎的化学成分。方法 利用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等技术对黄连95%乙醇提取物进行分离,根据理化性质与光谱数据鉴定化合物的结构。结果 从黄连95%乙醇提取物的氯仿萃取部分分离得到10个化合物,分别鉴定为N-顺式阿魏酰基酪胺（1）、唐松草林碱（2）、(S)-2-吡咯烷酸-5-甲酸乙酯（3）、5-羟基吡啶-2-甲酸甲酯（4）、3-吲哚甲醛（5）、环-(苯丙-亮)二肽（6）、环-(苯丙-缬)二肽（7）、开环异落叶松脂醇（8）、n-butyl 3-O-feruloylquinate（9）、methyl 3-O-feruloylquinate（10）。结论 化合物1～8为首次从该属植物中分离得到。     

嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达

目的 选取嗜肺军团菌mip/flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法 运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA 抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。     

布渣叶的化学成分研究

目的 研究布渣叶Microcos paniculata的化学成分。方法 采用硅胶、Sephadex LH-20、大孔树脂等柱色谱及制备液相色谱等方法进行分离纯化,根据化合物的理化性质、波谱数据等鉴定结构。结果 从布渣叶的醋酸乙酯和正丁醇萃取部位分离并鉴定了12个化合物,分别为异鼠李素（1）、表儿茶素（2）、黑麦草内酯（3）、去氢吐叶醇（4）、香草酸（5）、丁香酸（6）、咖啡酸甲酯（7）、对羟基苯甲酸（8）、对香豆酸（9）、木栓醇（10）、豆甾醇（11）、β-谷甾醇（12）。结论 化合物3～7、9～12均为首次从该属植物中分离得到,其中化合物3和4为首次从该属植物中分离得到的单萜类化合物。     

长药隔重楼化学成分研究

目的 研究长药隔重楼Paris polyphylla var. pseudothibetica根茎中的化学成分,为阐明其有效成分及扩大重楼属植物的药用资源提供科学依据。方法 利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、正反相制备色谱等手段进行分离纯化,并通过¹H-NMR、¹³C-NMR、ESI-MS等波谱技术进行结构鉴定。结果 从长药隔重楼中分离得到了12个化合物,分别鉴定为：薯蓣皂苷元（1）、薯蓣皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷（3）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（4）、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、β-谷甾醇（6）、豆甾醇（7）、胡萝卜苷（8）、豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、山柰酚（10）、β-蜕皮激素（11）、蔗糖（12）。结论 化合物1～9为首次从该植物中分离得到。     

维药药西瓜化学成分的分离与鉴定

目的 研究药西瓜Citrullus colocynthis的化学成分。方法 采用硅胶、Sephadex LH-20等色谱手段结合重结晶技术进行分离纯化,通过NMR波谱数据和理化性质确定化合物的结构。结果 从药西瓜中分离得到11个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇（1）、α-菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、α-菠甾酮（3）、双-[(2-乙基) 己基] 邻苯二甲酸酯（4）、对羟基苯甲酸（5）、6-C-对甲基苄基牡荆素（6）、双氢葫芦素E（7）、葫芦素E（8）、异表双氢葫芦素D（9）、双氢异葫芦素B-25-乙酯（10）、葫芦素E-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（11）。结论 化合物6为新化合物,命名为6-C-对甲基苄基牡荆素;化合物1～5、7、9、10均为首次从该属植物中分离得到。