烟草凝聚物对人正常支气管上皮细胞中ΔNp63α表达的影响

[目的]探讨ΔNp63α与吸烟型肺癌发生的关系。[方法]用烟草凝聚物处理体外培养正常支气管上皮细胞HBE,并分别用Realtime PCR和Western blot检测其ΔNp63αmRNA和蛋白的表达。同时构建ΔNp63α的基因组启动子载体,利用荧光素酶分析烟草凝聚物对其转录活性的影响。[结果]烟草凝聚物处理后,HBE细胞中ΔNp63αmRNA和蛋白的表达明显增多,且具有剂量依赖性,以50μg/mL浓度诱导效应最明显,mRNA和蛋白表达分别升高93%和311%。烟草凝聚物能够显著增强ΔNp63α启动子的转录活性,同样表现出剂量依赖性,50μg/mL的诱导效应最明显,转录活性升高140%。[结论]烟草凝聚物能够通过增强ΔNp63α启动子的转录活性而诱导ΔNp63α的表达,说明ΔNp63α可能与吸烟导致的肺癌发生相关。     

喉鳞癌中△Np63和△Np73的表达及临床意义

目的 通过研究喉鳞癌中△Np63和△Np73的表达及与患者各临床病理参数的关系,探讨其在喉鳞癌发生、发展中的作用.方法 采用免疫组化二步法,检测40例喉鳞癌及相应癌旁组织中△Np63和△Np73的表达情况.结果 △Np63和△Np73在喉鳞癌组织中的阳性表达率分别为85%(34/40)和82.5%(33/40).喉癌组织中△Np63和△Np73的表达显著高于相应癌旁组织(P＜0.001).△Np63在喉癌组织中的表达与肿瘤分化程度有关(P＜0.05);而与患者性别、临床分期、有无淋巴结转移等无关.△Np73在喉癌组织中的表达与患者性别、肿瘤分化程度、临床分期、有无淋巴结转移等无关(P＞0.05).喉癌组织中△Np63和△Np73的表达无显著相关性(r=0.16,P＞0.05).结论 △Np63和△Np73可能作为癌基因维持肿瘤细胞干细胞样的增殖特性,在喉鳞癌的发生、发展中发挥重要作用,并可能成为喉癌成瘤机制研究中的重要靶点.     

△Np63 mRNA在膀胱癌组织中的表达及意义

目的：探讨△Np63 mRNA在膀胱移行细胞癌（TCCB）中的表达及意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测48例TCCB患者肿瘤组织、10例对照膀胱组织△Np63 mRNA的表达，并分析△Np63 mRNA表达与TCCB临床分期、病理分级等的关系。结果：48例TCCB组织中△Np63 mRNA表达阳性率为75．0％（36／48），对照组膀胱组织中△Np63蛋白表达阳性率为0．0％（0／10），TCCB组△Np63 mRNA表达阳性率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。不同临床分期肿瘤组织中△Np63 mRNA表达阳性率、各组间△Np63 mRNA表达阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。不同病理分级肿瘤组织中△Np63 mRNA表达阳性率、各组间△Np63 mRNA表达阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：TCCB组△Np63 mRNA表达水平均明显高于对照组，提示△Np63与TCCB的发生密切相关，其可能为TCCB发生的重要促进因素，△Np63 mRNA表达水平和TCCB的临床分期、病理分级没有相关性，故△Np63在TCCB进展中的作用有待进一步研究。     

△Np63蛋白在骨肉瘤中表达的意义

目的：研究△Np63蛋白在骨肉瘤中的表达,探讨其在骨肉瘤发生、发展中的可能作用。方法：应用免疫组化S-P法检测28例骨肉瘤石蜡标本中△Np63蛋白的表达情况。结果：在28例骨肉瘤中仅有1例高分化骨肉瘤出现弱阳性反应,还有1例骨肉瘤△Np63表达为阴性,二者癌旁组织呈阳性反应（ ）。对照组的15例骨软骨瘤中,共有3例阳性,其中2例为（ ）,另1例为强阳性（ ）。结论：△Np63在骨软骨瘤和骨肉瘤的癌旁正常组织中呈阳性或强阳性反应,推测p63可能具有肿瘤抑制基因功能。     

食管鳞癌△Np63基因的检测

目的:探讨△Np63基因作为食管鳞癌检测指标的可能性.方法:50例新鲜食管鳞癌组织,未经放疗或化疗,癌旁组织15例,用免疫组化和RT-PCR方法检测组织和外周血△ Np63表达情况.食管癌患者外周血标本21例,用RT-PCR方法检测了△Np63 mRNA表达情况,胃腺癌12例和10例健康人外周血作为对照.结果:食管鳞癌组织△Np63蛋白和mRNA表达明显高于癌旁组织,分别是96%和60%(P＜0.01).食管癌21例外周血检测中△Np63 mRNA阳性率38%,而胃腺癌和健康人外周血中未见表达.结论:食管鳞癌的发生和△Np63过度表达有关,△Np63 mRNA外周血检测可以作为一个食管鳞癌的肿瘤标志物.     

人膀胱癌荷瘤鼠中shRNA沉默△Np63基因对肿瘤的抑制和cdk4的影响

目的:利用RNAi(RNA interference,RNA干扰)技术,通过抑制△Np63基因的表达,研究其对人膀胱癌裸鼠皮下移植模型的抑瘤作用,同时检测△Np63基因被抑制后对cdk4(细胞周期素依赖性激酶4,cyclin-dependent kinase 4)的影响.方法:建立人膀胱癌裸鼠皮下移植模型,构建△Np63基因特异性shRNA(short hairpin,短发卡)表达质粒,将表达质粒转染荷瘤鼠瘤体,观察肿瘤生长情况,HE染色法观察质粒治疗后瘤组织的病理改变,RT-PCR方法检测△Np63基因的表达变化,SP免疫组化检测△Np63和ckd4蛋白表达变化.结果:转染质粒8周后,△N p63-shRNA组、Control-shRNA组与生理盐水组比较,△Np63-shRNA组与生理盐水组瘤体积有显著性差异(p＜0.01),抑瘤率为74.44%,Control-shRNA组与生理盐水组体积无显著性差异(p＞0.05).病理学结果发现:△Np63-shRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞核分裂相减少,可见大量肿瘤细胞坏死和凋亡、炎症细胞浸润.RT-PCR结果显示△Np63-shRNA组△Np63基因表达降低,免疫组化结果显示△Np63和ckd4蛋白表达均降低.结论:△Np63特异性shRNA质粒表达载体沉默△Np63基因后,可显著抑制人膀胱癌裸鼠肿瘤的生长,△Np63可能通过抑制ckd4的表达而抑制肿瘤的细胞增殖.     

△Np63基因对TCCB5637细胞侵袭作用的影响

目的:研究△Np63基因对TCCB 5637细胞侵袭功能的影响.方法:针对△Np63基因的不同靶点设计并化学合成具有阳性转染率的siRNA,用脂质体法转染TCCB 5637细胞,并根据转染的方式将实验分组为:空白对照组、空载体组、阴性质粒组和干扰质粒组;采用实时荧光定量PCR、Western blot检测各组中△Np6...     

△Np63在食管鳞癌组织中的表达及意义

目的探讨p53基因家族新成员截短型p63(△Np63)在食管鳞癌组织中的表达及其意义。方法采用RT-PCR法检测50例食管鳞癌及50例正常食管组织中△Np63 mRNA的表达情况,分析其与食管鳞癌患者各临床病理指标的关系。结果△Np63 mRNA在食管鳞癌组织中的阳性表达率(74.0%)及表达水平(1.036±0.157)均显著高于正常食管组织(40.0%,0.954±0.110),并且其在食管鳞癌组织中的阳性表达率及表达水平与分化程度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论在食管鳞癌组织中存在△Np63的过表达,并且这种表达可能与食管鳞癌的浸润、转移有关。     

子宫颈癌细胞中STAT3对△Np63α的转录调控机制研究

目的 探讨△Np63α在子宫颈癌细胞株中的转录调控机制.方法 通过生物信息学分析△Np63α可能转录调控因子,构建△Np63α启动子报告基因质粒,在HEK293T及子宫颈癌细胞中通过报告基因检测ANp63a及细胞信号转导与转录激活因子(STAT3)对△Np63α转录水平的调控.通过STAT3的激活剂及抑制剂,检测子宫颈癌细胞株中 ANp63a的蛋白表达情况.通过Western blot检测ANp63a的表达水平对子宫颈癌细胞株中P-STAT3的表达影响.结果 ①成功构建了含ANp63a启动子的质粒并通过酶切及测序验证;②荧光素酶报告基因检测系统显示ANp63a、 STAT3均可以激活ANp63a启动子的表达;③Western blot结果显示:STAT3激活剂及抑制剂分别可以激活或抑制 ANp63a蛋白的表达水平;④Western blot结果显示:△Np63α蛋白的过表达或沉默可以抑制子宫颈癌细胞株中STAT3的磷酸化,而对正常细胞株HEK293T没有相应的调控作用.结论 子宫颈癌细胞株中STAT3可以正性调控ANp63a的表达,而ANp63a的表达上调负反馈抑制STAT3的磷酸化,推测ANp63a可能通过与STAT3的复杂调控机制影响肿瘤细胞的恶性生物学行为.     

△Np63和VEGF在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨△Np63和VEGF在膀胱移行上皮癌（TCCB）中的免疫组化表达及与膀胱癌发生发展中可能的作用和相互关系。方法用免疫组化染色方法对56例膀胱移行上皮癌组织行△Np63和VEGF检测,将结果与病理分级、分期和预后进行分析。结果膀胱移行细胞癌中△Np63和VEGF阳性表达率明显高于正常膀胱粘膜（P〈0．05）。△Np63和VEGF在低分化、浸润性癌组织中的阳性表达率明显高于高分化、浅表性癌组织,在复发病例中的阳性表达率显著高于初发病例,2个标记物在膀胱癌的病理分级、分期和预后之间表达差异有统计学意义（P〈0．05）。采用Spearman等级相关性分析,△Np63与VEGF呈正相关。结论△Np63在膀胱癌中的异常表达是膀胱癌组织向浸润性发展和恶性程度增加的重要原因之一,可能通过促进肿瘤血管生成发挥促癌作用,△Np63可能是判断TCCB预后的生物学指标。     

膀胱移行细胞癌组织△Np63和MDM2蛋白表达及意义

目的 探讨缺乏酸性N端反式激活区的截短型p63(△Np63)和MDM2蛋白在膀胱移行细胞癌(TCC)组织中的表达及其临床意义.方法 用免疫组织化学法,检测35例石蜡包埋TCC组织标本中△Np63和MDM2的表达,以38例正常膀胱黏膜作为对照.结果 膀胱癌组30例(83.3%)△Np63蛋白呈阳性表达,膀胱黏膜组7例(18.4%)呈阳性表达,两组比较差异有显著性(uc=5.75,P＜0.01).膀胱癌组15例(42.9%)MDM2蛋白呈阳性表达,膀胱黏膜组3例(7.9%)呈阳性表达,两组差异有显著性(x2=11.99,P＜0.01).在不同病理分级、临床分期TCC中,△Np63表达差异有显著性(H=21.09、14.99,P＜0.01).随着TCC病理分级、临床分期升高,△Np63表达明显增强,呈显著正相关(r=0.64、0.51,P＜0.01).在不同病理分级、临床分期TCC中,MDM2表达差异有显著性(x2=16.63,P＜0.01;x2=6.72,P＜0.05).30例△Np63蛋白阳性表达TCC组织中MDM2蛋白阳性表达10例(33.3%),两者呈显著相关性(x2=7.78,P＜0.05).△Np63阳性表达主要集中在低分化、浸润性TCC中,而MDM2则主要表达在高分化、浅表TCC中.结论 △Np63和MDM2与膀胱肿瘤的发生发展密切相关,可作为膀胱肿瘤早期诊断和判断恶性程度的参考指标.     

ΔNp63α基因过表达对人宫颈癌细胞SiHa基因表达谱的影响

目的 分析ΔNp63α基因过表达时人宫颈癌细胞Si-Ha基因表达谱的变化,筛选受ΔNp63α调控的潜在靶基因.方法 利用慢病毒转染技术构建稳定过表达ΔNp63α的转染组细胞株SiHa-ΔNp63α和对照组细胞株SiHa-NC.应用基因芯片技术研究两组细胞株基因表达谱变化,并进行生物学信息分析和实时荧光定量PCR验证.结果 基因芯片数据共筛选出差异倍数1.5倍以上的基因共1405个,其中843个基因在SiHa-ΔNp63α细胞中表达上调,562个表达下调.通过生物信息学分析显示这些基因主要参与细胞生长与周期、信号转导、细胞通讯、细胞黏附、细胞转移和侵袭等功能,涉及的信号通路包括抗原加工提呈、细胞因子与受体相互作用、细胞黏附分子、补体系统等.结论 研究ΔNp63α调控的潜在靶基因或信号通路,对探索宫颈癌发生发展的机制有重要意义.     

△Np63基因沉默对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

目的探讨癌基因△Np63对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法通过将△Np63特异性短发夹RNA(△Np63-shRNA)和非特异性短发夹RNA(Control-shRNA)转染膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinom a of bladder,TCCB)5637细胞,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot分别检测△Np63、p27kip1、p57kip2mRNA和蛋白的表达水平,WST-1法检测细胞增殖活性,利用流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布,TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果特异性的△Np63-shRNA能够有效地沉默△Np63并上调p27kip1和p57kip2的基因和蛋白水平,转染△Np63-shRNA的5637细胞的增殖能力明显受到抑制(P<0.05),且明显促进了细胞的凋亡(P<0.05)。结论靶向△Np63基因的shRNA片段可以有效的抑制人膀胱癌5637细胞的增殖并促进其凋亡,其可能的机制是通过上调p27kip1和p57kip2的表达实现的。     

ΔNp63蛋白在骨肉瘤中表达的意义

目的: 研究ΔNp63蛋白在骨肉瘤中的表达,探讨其在骨肉瘤发生、发展中的可能作用 .方法: 应用免疫组化S-P法检测28例骨肉瘤石蜡标本中ΔNp63蛋白的表达情况.结果: 在28例骨肉瘤中仅有1例高分化骨肉瘤出现弱阳性反应,还有1例骨肉瘤ΔNp63表达为阴性,二者癌旁组织呈阳性反应(+).对照组的15例骨软骨瘤中,共有3例阳性,其中2例为(+),另1例为强阳性(+ + +).结论: ΔNp63在骨软骨瘤和骨肉瘤的癌旁正常组织中呈阳性或强阳性反应,推测p63可能具有肿瘤抑制基因功能.     

烟雾凝聚物对人正常支气管上皮细胞中p16转录的抑制作用及其机制

目的：通过体外模拟吸烟过程来检测抑癌基因p16表达的变化,探讨p16基因在吸烟导致肺癌发生过程中的作用。方法：常规正常支气管上皮细胞（HBE）分为实验组和对照组,分别接受烟雾凝聚物和DMSO处理。利用免疫印迹和Realtime RT-PCR分别检测P16蛋白表达和mRNA的转录水平。构建p16的基因组启动子载体,利用荧光素酶分析烟雾凝聚物对其转录活性的影响。结果：不同浓度（0,10,25,50,100 mg•L^-1）的烟雾凝聚物处理HBE后,其p16的mRNA和P16蛋白表达水平明显降低,并且表现出剂量依赖性。大于25 mg•L^-1的烟雾凝聚物能明显抑制P16蛋白表达和mRNA的转录水平,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其中100 mg•L^-1烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。烟雾凝聚物也能以剂量依赖方式抑制p16启动子的转录活性,大于25 mg•L^-1的烟雾凝聚物能显著抑制p16启动子的荧光素酶活性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）,其中100 mg•L^-1的烟雾凝聚物表现出最大的抑制效应。结论：烟雾凝聚物能够抑制p16启动子的转录活性,进而抑制P16蛋白的表达;P16蛋白表达水平的降低可能是吸烟导致肺癌发生的一种分子机制。     

小干扰RNA抑制ΔNp63α表达对人食管鳞癌细胞生物学特性的影响

目的通过腺相关病毒介导的小干扰RNA(siRNA)抑制人食管鳞癌细胞Eca109中ΔNp63α的表达,观察其对食管鳞癌细胞生物学特性的影响。方法构建H1启动子驱动的表达针对ΔNp63α的siRNA重组腺相关病毒AAV-ΔNp63αshRNA并感染Eca109细胞。同时以感染空腺相关病毒AAV-Null的细胞及不加腺相关病毒的细胞分别作为对照组和空白对照组,观察siRNA干扰ΔNp63α表达在体外及体内对Eca109细胞生长、增殖、致瘤及凋亡的影响。结果与对照组和空白对照组比较,Eca109细胞感染AAV-ΔNp63αshRNA后ΔNp63α蛋白表达下降(P均<0.05),细胞生长速度减慢(P均<0.05),细胞增殖指数(proliferation index,PI)降低(P均<0.01),裸鼠瘤体质量减轻(P均<0.05),细胞凋亡增加(P均<0.05)。结论腺相关病毒介导的siRNA干扰能显著抑制Eca109细胞ΔNp63α的表达,减慢肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长。     

肾细胞癌组织中△Np63和MDM2蛋白的表达及其临床意义

目的 探讨△Np63和MDM2蛋白在肾细胞癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭与转移的关系.方法 应用免疫组织化学SP法,检测76例肾细胞癌和14例正常肾组织中△Np63和MDM2蛋白的表达.结果 肾癌组织与正常肾组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著性(F=28.34、22.57,q=6.471～12.529,P<0.05);不同病理类型的肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异均无显著性(q=0.093～2.169,P>0.05);不同临床分期肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著性(F=24.59、10.82,q=4.694～11.971,P<0.05).△Np63和MDM2蛋白的表达存在着显著相关性(rs=0.513,P<0.05).结论 △Np63和MDM2蛋白可以作为反映肾细胞癌侵袭和转移潜能的生物学指标.     

△Np63α过表达乳腺癌细胞系的建立

目的建立稳定过表达△Np63α的乳腺癌细胞系,为研究△Np63α的功能奠定基础。方法利用MCF-7细胞系作为模型,通过表达△Np63α的PCDNA3.1质粒转染MCF-7细胞,利用质粒的抗药性筛选MCF-7细胞,从而获得稳定过表达△Np63α的MCF-7细胞,用Real-time PCR和Western blot方法检测验证目的基因表达。结果通过瞬时转染和药物筛选获得了稳定过表达△Np63α的MCF-7细胞。结论成功构建了过表达△Np63α的MCF-7细胞系和转染空质粒的MCF-7对照细胞系,为下一步研究NP63α的功能奠定了基础。     

烟草悬凝物对人支气管上皮细胞急性毒性损伤的研究

目的 通过研究烟草悬凝物(CSC)对人支气管上皮细胞(BEP-2D cells)急性毒性损伤生物学作用,探讨烟草烟气在人支气管上皮细胞损伤过程中的机制,为呼吸道疾病的防治措施提供实验依据.方法 收集某品牌香烟烟气并溶解于LHC-8培养液制备成CSC;采用永生化的人支气管上皮细胞,分为对照组(BEP-2D cells)和实验组(BEP-2DCSC cells).观察烟草悬凝物染毒后的细胞存活率、膜通透性损伤、细胞凋亡率和次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(HPRT gene)突变率.结果 在急性毒性生损伤过程中,随着CSC浓度的逐渐增加:细胞存活率逐步下降、细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)逐渐且明显增多、细胞的早期和晚期凋亡率均增大、HPRT基因突变率逐渐增大,均与染毒剂量具有明显量-效关系.结论 CSC作为一种复杂的香烟烟气混合物具有较为典型的急性细胞毒性作用,其机制可能与细胞膜通透性增加、细胞凋亡及HPRT基因突变有关.     

ΔNp63基因对TCCB 5637细胞侵袭作用的影响

目的:研究ΔNp63基因对TCCB5637细胞侵袭功能的影响。方法:针对ΔNp63基因的不同靶点设计并化学合成具有阳性转染率的siRNA,用脂质体法转染TCCB 5637细胞,并根据转染的方式将实验分组为:空白对照组、空载体组、阴性质粒组和干扰质粒组;采用实时荧光定量PCR、Western blot检测各组中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达;采用激光共聚焦显微镜对转染干扰质粒前后的ΔNp63蛋白进行定位;采用细胞计数法及MTT法来检测ΔNp63基因对TCCB 5637细胞侵袭能力和异质粘附能力的影响。结果:ΔNp63蛋白定位于TCCB 5637细胞的细胞核区域;与空白对照组比较,空载体组和阴性质粒组TCCB5637细胞中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达水平无明显变化(P>0.05);平均细胞穿越数和异质粘附性无明显变化(P>0.05);而干扰质粒组TCCB5637细胞中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),平均细胞穿越数明显增加(P<0.05),异质粘附性明显下降(P<0.05)。结论:ΔNp63基因能明显促进TCCB5637细胞的侵袭能力。