丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活研究进展

丙型肝炎病毒非结构区3（HCVNS3）基因位于HCV基因组非结构区3420—5312核苷酸区段。HCVNS3具有多种潜在生物学功能,如蛋白酶、解旋酶活性,介导细胞免疫反应、反式激活端粒酶、调节p53活性及参与蛋白激酶A和STAT信号转导等,从而影响宿主细胞功能,导致细胞增生、凋亡,甚至癌变。对于NS3蛋白反式激活作用研究,可为进一步研究HCV致病（癌）的分子生物学机制和探索新的丙型肝炎治疗技术提供帮助。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆

目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4A（NS4A）相互作用蛋白的基因，明确其具体作用机制。方法应用酵母双杂交系统3，将聚合酶链反应法扩增的HCV NS4A基因连接入酵母表达载体PGBKT7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人肝cDNA文库质粒PACT2的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基和X—α-半乳糖上进行双重筛选阳性菌落，提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上，选择生长菌落，提取质粒酶切鉴定，测序并在GenBank中进行生物信息学分析。结果成功克隆出HCV NS4A基因，构建表达载体并在酵母细胞中表达，与肝文库配合后选出既能在四缺培养基又能在铺有X—α-半乳糖的四缺培养基上生长，并变成蓝色的真阳性菌落22个，序列分析显示，筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞能量代谢、蛋白翻译合成等多种生物学过程。结论成功克隆出HCV NS4A蛋白在肝细胞内的结合蛋白，为进一步研究NS4A蛋白的功能、阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A基因酵母表达载体的构建及表达

丙型肝炎病毒（HCV）是一种单股正链RNA病毒，在HCV丝氨酸蛋白酶和宿主细胞信号肽酶的联合作用下，裂解成为10余种结构和非结构蛋白。其中，HCV NS4A蛋白作为一种非结构蛋白形式，是NS3丝氨酸蛋白酶裂解活性的辅因子，并参与NSSA蛋白磷酸化修饰和免疫应答的调节。为了进一步研究NS4A蛋白在肝细胞内的功能，我们在酵母细胞中表达了NS4A蛋白。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的PBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3。以pcDNA3．1(-)-NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术(bioinformatics)，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS3，经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2后提取总RNA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6，新基因的编码基因序列全长为414个核苷酸(nt)，编码产物由138个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术。发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆其中的NS3TP6，为阐明HcvNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒致肝细胞癌的分子机制

丙型肝炎病毒（HCV）属黄病毒科,基因组为单股正链RNA,全长约9．6kb,编码4种结构蛋白（Core,E1,E2,p7）和6种非结构蛋白（NS2,NS3,NS4A,NS4B,NSSA,NSSB）。全球约有1．7亿人感染HCV。HCV感染是导致慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌（HCC）的主要原因之一。约70％急性HCV感染者可发展为慢性感染,其中约2．5％发展为HCC。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3(HCV NS3)特异性噬菌体模拟表位，为抗—HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗—HCV NS3的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机七肽库进行3轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程，随机挑取60个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS3抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的60个克隆中得到13个阳性克隆，确定氨基酸序列SRNTxKL为HCV NS3的模拟表位。结论 用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV NS3的模拟表位。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因1的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP1，已在GenBank中注册，注册号为AYll6969。NS3评1基因的编码序列全长为1932个核昔酸(nt)，编码产物由眺个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，HCVNS3反式激活作用的新靶基因的发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因，研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术，以HCV NS5A表达质粒pcDNA3．1(-)-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性，利用表达序列标签(EST)序列数据库的搜索和比对，进行电子拼接，根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列，确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，命名为NS5ATP9，在GenBank中注册，注册号为AF529370。结果 Ns5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt)，编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成，并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆，为进一步研究HcvNs5A反式激活作用的分子生物学机制开辟了新的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5a对细胞周期的影响

丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化的主要病因之一，并与肝细胞癌的发生关系非常密切。但HCV导致原发性肝细胞癌的机制，特别是其基因产物(结构蛋白和非结构蛋白)在致癌中的作用仍不清楚。HCV非结构蛋白5a(NS5a)能激活多种转录因子，并与细胞内因子结合，影响其功能，导致细胞增殖分化异常，可能与原发性肝细胞癌的发生有关。为进     

丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对肝瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法 将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK－CMV的Hind Ⅲ和BamH I位点间,构建重组质粒PBK－HCVc。再将重组质粒PBK－HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT－PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组织化学,蛋白印迹检测VEGF蛋白表达;原位杂交,RT－PCR检测VEGF mRNA。结果 重组质粒PBK－HCVc在HepG2细胞中有稳定表达;表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的VEGF在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达,可能对肝细胞癌的生长具有促进作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5（HCV NS5）特异性噬菌体模拟表位，为抗HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗－HCV NS5的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取30个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS5抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的30个克隆中得12上阳性克隆，确定氨基酸序列QIRPTRQ为HCV NS5的模拟表位。结论 用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV NS5的模拟表位，为用HCV模拟表位探索HCV感染的研究创造了条件。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

DNA微点阵分析丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对信号传导相关基因表达的影响

目的 采用DNA微点阵（DNA microarray）技术检测致癌相关基因的表达水平，研究丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）非结构蛋白NS4B在HCV致癌中的作用。方法 通过建立稳定表达NS4B的细胞系，用微点阵技术研究NS4B对细胞基因表达的影响，实时定量RT—PCR分析微点阵结果中的两个上调基因（DKK1，FYN）和两个下调基因（AKR1C1，v—fos）的表达，对细胞中AKR1C1的活性进行酶学分析。结果 在2308个信号途径相关的基因中，34个基因表达上调，56个基因表达下调。在表达有明显差异的基因中，大部分原癌基因表达上调，而大部分抑癌基因的表达下调；一些基因与细胞压力有关。实时定量RT—PCR和AKR1C1的酶学分析进一步证实了DNA微点阵的结果。结论 HCV—NS4B在HCV的致癌过程中起一定作用。     

T7噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS）3的相互作用蛋白。方法 应用T7噬菌体展示技术，以通过原核表达的方式得到的丙型肝炎病毒NS3为靶分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选，对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性研究。结果 经鉴定得到2个阳性克隆，并确定能与丙型肝炎病毒NS3相互作用的蛋白质为serine peptidase inhibitor，cladeA，member 1（SERPINA1）和cyclophilin-LC。结论 T7噬菌体筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段，筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨NS3的致病、致癌机制提供了重要依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵(microauray)技术，结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因，阐明授性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌(HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV—H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应(PCR)扩增，获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体PcDNA3．1(-)-NS5A。以pcDNA3．1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCVKDA反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3．1(-)-NS5A，经过限制性内切酶作图分析和核苔酸序列分析证实正确无误。以PcDMA3．1(-)-NS5A转染HepG2后提取总MA，逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因，命名为NS5ATP13，在GenBank中登录，登录号为D21262。Ns5ATP13基因的编码序列全长为2103个核苷酸(nt)，编码产物由700个氨基酸残基(aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反式激活作用。微短阵技术是分析基因表达谱变化的自动化和高通量技术。应用这些技术，发现了HCVKDA反式激活作用的新的靶基因，将为进一步研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制及HCV相关疾病发病机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A调节新生多肽复合物启动子转录活性的研究

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白5A（NS5A）对新生多肽相关复合物（NACA）启动子转录活性的影响。方法以我室构建的能够表达NS5A蛋白的pcDNA3．1（-）-NS5A质粒和含有NACA基因启动子的PCAT3-NACA报告基因质粒共转染HepG2细胞系设为实验组，同时PCAT3-NACA单独转染HepG2细胞系作为对照组。用酶联免疫吸附法检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果pCAT3-NACA单独转染HepG2细胞的CAT酶表达活性与pCAT3-NACA和pcDNA3．1（-）-NS5A共转染组HepG2细胞的CAT酶表达活性比较，共转染组A值下降了79．3％。结论HCV NS5A能够抑制NACA启动子的活性，对NACA的表达具有下调作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A影响p53抑制肝癌细胞甲胎蛋白表达的分子机制

目的了解丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对p53抑制甲胎蛋白(AFP)基因表达的影响及分子机制。方法采用质粒转染技术及微粒体酶免疫法观察p53蛋白对Huh7肝癌细胞AFP表达的抑制作用及HCV NS5A对其抑制作用的影响;蛋白印迹实验观察HCV NS5A对p53蛋白表达的影响;谷胱甘肽转移酶沉淀实验鉴定HCV NS5A与p53蛋白能否相互作用形成复合物。结果转染pRc/CMV空质粒的Huh7细胞上清液AFP浓度为(14 322±2412)ng/ml,转染pCNS5A质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(13 843±3218)ng/ml,两组问t=1.42,P>0.05;转染pC53-NS3质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(10 241±1326)ng/ml,与上述两组比较,t值分别为2.41及2.38,P值均<0.05;pCNS5A和pC53- NS3共转染者AFP浓度为(14 582±1238)ng/ml,与pC53-NS3单独转染组比较,t=3.12,P<0.01; pCNS5A和pC53-NS3共转染者和pC53-NS3单独转染者Huh7细胞p53蛋白表达无变化。在谷胱甘肽转移酶沉淀实验中,加入谷胱甘肽-p53融合蛋白后出现HCV NS5A蛋白条带,而仅加入谷光甘肽者则未出现此条带。结论p53蛋白能抑制Huh7细胞AFP的表达,HCV NS5A能减轻p53蛋白对AFP表达的抑制作用。HCV NS5A不影响p53蛋白的表达但能与p53蛋白结合形成复合物是使p53功能失活的分子机制。     

丙型肝炎病毒核心蛋白致癌作用的研究

研究表明丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白可能具有潜在的直接致癌作用。应用腺相关病毒载体介导的病毒重组技术,成功观察到HCV核心蛋白诱发的肝癌形成。 1.材料和方法:(1)HCV core区基因克隆及测序:按文献[1]方法进行,各种工具酶等购自美国Promega公司。②含HCV core区重组腺相关病毒的制备:将腺相关病毒载体质粒PSSHG(西安交通大学医学院解剖教研室构建惠赠)和HCV     

HCV NS3蛋白酶及抑制剂的研究进展

丙型肝炎呈全球性流行,感染HCV后常呈慢性化,且易使病情进一步发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝细胞癌,至今仍缺少理想的治疗药物和方案.HCV NS3蛋白酶在病毒体的成熟和复制中起着重要的作用,是近年来抗丙型肝炎药物研究的重要靶点.本文从NS3蛋白酶结构、功能及与NS4A的相互作用和抑制剂等几方面,介绍NS3蛋白酶及抑制剂的研究进展.