体外人骨髓基质细胞克隆培养及分化特性的研究

目的:探讨人骨髓基质细胞(BonemarrowstromLcells,MSCs)克隆方法的有效性及其向神经干细胞(Neuralstemcells,NSCs)的定向分化的潜性。方法:贴壁生长的MSCs以套环法消化分离,扩增培养,流式细胞仪检测细胞的表面标记,应用维甲酸诱导向神经干细胞分化。结果:克隆培养的MSCs能够传代扩增,它们表达CD13、CD59、CD29,而不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR,并能诱导分化为NSCs。结论:该培养条件能有效扩增MSCs,并保持分化潜能。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells．NSCs）的体外培养，探讨NSCs作为基因靶细胞．以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记NSCs的可行性。方法：胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞，无血清细胞培养，免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs，用G418筛选，在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆．并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果：从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力。表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达，且不影响其增殖、分化能力。结论：小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。     

碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对恒河猴骨髓源性神经干细胞的体外诱导增殖作用

目的：探索骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)体外诱导分化为神经干细胞(nerve stem cells，NSCs)的增殖条件，比较碱性成纤维细胞生长因子(base fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)对神经干细胞生长曲线的影响，为BMSCs在神经科学领域内的应用提供参考。方法：以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象，实验组利用NSC培养基和bFGF，EGF生长因子，进行体外培养、诱导、增殖。对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖。Nestin及CD133作为免疫细胞化学鉴定NSCs的细胞标志。结果：原代培养第6天时多数细胞表现为Nestin及CD133抗原阳性，此后实验组及对照组细胞数量开始明显扩增，但实验组增殖更为明显，bFGF+EGF组从第8天时的(96．30&;#177;8．78)&;#215;10^4增加到第18天时的(1407.90&;#177;26.62)&;#215;10^4，并且增殖开始的时间较对照组提前2dc．NSCs在10d后有少量细胞向神经元和神经胶质细胞分化。结论：bFGF与EGF联合应用能够促使NSCs增殖时间提前及增殖效能显著提高。另外，bFGF和EGF还具有诱导NSC向神经细胞分化的作用。     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景：体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等，而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢.目的：研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效。设计：以细胞为研究对象，重复观察测量，探索性研究.单位：一所医学院病理生理学教研室。材料：实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，流式细胞仪检测其表面抗原表达，多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志：主要观察指标：①MSCs分离和扩增结果。②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果。结果：大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD14，CD11α，C34，CD38，CD45，CD80，CD86为阴性，CD29，CD44，CD90，CD105，CD166呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性，胶质纤维酸性蛋白阴性。结论：SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的诱导条件下，可以分化为神经元样细胞。     

小鼠MSCs分离体外扩增及向神经样细胞诱导分化的研究

目的：研究小鼠骨髓问充质干细胞(mMSCs)的分离、体外扩增及向神经样细胞分化的潜能。方法：取8—9周小鼠骨髓悬浮至全培养基中，接种于纤连蛋白覆盖的培养器皿中，纯化并扩增mMSCs；检测第9—10代细胞的生长状态、细胞周期、表型，并进行光镜形态学观察；用二甲基亚砜和丁羟茴醚诱导细胞分化，免疫荧光法检测其诱导分化前后神经细胞和神经干细胞的特异性标记蛋白的表达。结果：mMSCs为贴壁细胞，表现为成纤维细胞样，具有梭形、多角形等形态，传至15代仍可维持其形态特征；83％的细胞处于GO／G1期；mMSCs不表达CD45而表达CD44、CD13，与人MSCs表型一致；诱导分化后，大部分细胞变成双极、多极和锥形，并相互交织成网状结构，呈现神经细胞和神经干细胞表型。结论：mMSCs可被成功分离及体外扩增培养，并具有同人类MSCs相同的形态、表型、生长特征和向神经样细胞分化的潜力，是研究细胞及基因治疗小鼠病理模型的良好工具细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究

目的研究人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向神经细胞分化的可能性。方法利用Per-coil梯度分离及贴壁筛选法分离培养和扩增MSCs；利用bFGF、化学诱导剂DMSO和BHA联合诱导MSCs向神经元转化，观察分化过程中细胞形态的变化，利用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果经Perecoll梯度分离及贴壁筛选法获得了纯度较高的人MSCs，诱导分化后的细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态，并且分别从mRNA和蛋白水平上证明诱导分化后的细胞表达神经元标记物NSE和NF，不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论人MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞，这种潜能使其有可能成为神经系统疾病细胞移植治疗的种子细胞。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的 神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础，从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)，并观察其向神经元的分化情况。方法 分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织，采用无血清原代及传代培养方法，获得具有克隆能力的细胞群；应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达；应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果 从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力，表达神经上皮干细胞蛋白(nea6n)，分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；随着贴壁后分化时间的延长，表达nestin的细胞数量从80．5％下降到10．9％，向神经力特异性烯醇化酶(newonspecific enolase，NSE)阳性细胞数量则从1．1％上升到31．6％。结论 用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力，并具有多分化潜能，是中枢神经系统的干细胞；随着分化时间的延长，神经干细胞数量下降，而神经元比例有明显上升。     

离体实验条件下胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的观察

背景：有关神经干细胞(neural stem cells，NSCs)治疗研究有明显增多趋势，已有许多研究认为NSCs能够增殖分化并在中枢神经系统内发生神经整合，NSCs在中枢神经系统中迁移的特性已成为近年来干细胞治疗神经系统疾病研究的热点。目的：探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。设计：重复测量设计。单位：解放军第三军医大学新桥医院神经外科、中南大学湘雅医院神经外科、Department of Urology,National Defense Medical College。材料：新生第1天Wistar大鼠，由解放军第三军医大学实验动物中心提供。方法：通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区NSCs，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。主要观察指标：MTT比色法测定NSCs的生存率。结果：本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞。基因转染使G418抗性细胞(NSCs／CD细胞)对5-FC高度敏感。未转染的NSCs对5-FC不敏感，IC50约为5000μmol／L，而转染基因后IC50小于10μmol／L。G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论：CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗神经系统退行性病变及多种疾病研究提供依据。     

人脐血间充质干细胞分离、培养及向成骨细胞分化的实验研究

目的探讨脐血间充质干细胞(MSCs)的分离培养及向成骨细胞的分化潜能。方法从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;1.0×10-8mol/L地塞米松,2.0×10-4mol/L抗坏血酸,7.0×10-3mol/Lβ-磷酸甘油的IMDM培养基对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,von-Kossa染色鉴定。结果成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后细胞间可见黑色矿化物沉积阳性。结论脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为成骨细胞。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨分化对血管内皮细胞形成的可能影响

背景：种子细胞的成骨功能及局部血管形成是骨组织工程修复重要影响因素。目的：体外研究兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)诱导培养分化为成骨细胞的功能表现及血管内皮生长因子(vascular endothelia gmwth factor，VEGF)的表达。探讨MSCs向成骨分化及对血管内皮细胞形成的可能影响。设计：以细胞为研究对象，单一样本研究，重复观察测量。单位：一所大学组织胚胎学教研室。材料：本实验于2002-03／12在广东医学院组织胚胎学教研室完成。对象为兔骨髓间充质干细胞。方法：分离、培养新生兔骨髓间充质干细胞，用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养液诱导MSCs向成骨细胞分化，观察诱导细胞碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节形成以及VEGF的表达。主要观察指标：①细胞形态学观察。②培养细胞的成骨分化鉴定。③诱导培养的成骨细胞VEGF表达。结果：MSCs诱导培养后，细胞ALP呈强阳性染色，形成矿化结节，且VEGF表达增强，其灰度值为132．3&;#177;4．6，与MSCs的VEGF表达灰度值(148．5&;#177;5．3)比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：兔MSCs经诱导可分化为成骨细胞，且VEGF表达增强，可能参与内皮细胞的形成。     

两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 建立两步培养法分离培养人孕中期羊水间充质干细胞(MSCs)的方法,观察羊水MSCs向神经元样细胞的诱导分化.方法 采用改进的两步培养法分离和培养人羊水MSCs,以β-巯基乙醇诱导其向神经元样细胞方向分化;并使用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法研究人羊水MSCs的生物学特性.结果 成功分离、培养和传代出人羊水MSCs.流式细胞术检测人羊水MSCs表达CD44、CD29、CD105,不表达CD45、CD34、人白细胞DR抗原(HLA-DR);免疫荧光法和RT-PCR检测表明,部分人羊水MSCs表达转录因子Oct-4.两步培养法羊水MSCs集落形成率[(15.0±2.3)%]和Oct-4阳性细胞率[(1.2±0.3)%]均高于一步法[分别为(10.0±1.8)%,(0.9±0.2)%,P均<0.05].羊水MSCs经β-巯基乙醇诱导后细胞形态发生改变,伸出突起并呈神经球样改变;免疫细胞化学法检测显示(54.76±3.65)%的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),同时(36.28±4.27)%的细胞表达神经胶质酸性蛋白(GFAP).结论 人羊水中存在MSCs,两步培养法是一种高效、简便、实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法.在体外条件下,利用β-巯基乙醇和适宜的培养液可使羊水MSCs定向分化为神经元.     

兔骨髓基质细胞体外培养、诱导及分化成神经干细胞的实验研究

目的：研究新西兰大白兔骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法：梯度密度离心法分离新西兰大白兔骨髓基质细胞(BMSCs)，于体外用神经干细胞培养基和多种细胞因子进行培养、诱导、分化，细胞免疫化学方法进行鉴定。结果：新西兰大白兔骨髓基质细胞能在体外培养中增殖、分化，具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达干细胞特异性抗原神经巢蛋白(Nestin)，这些细胞最终能分化出类神经元样细胞，免疫细胞化学检测可见有神经核蛋白抗体(NeuN)的表达。结论：新西兰大白兔骨髓基质细胞是具多向分化潜能的细胞，具有较强的增殖、自我更新能力。在适宜的条件下，可以分化成能表达神经系细胞特异性抗原的细胞。骨髓基质细胞来源方便、取材较容易，体外培养和扩增的技术条件简便，具有向神经系细胞分化的潜能，可以考虑作为细胞移植治疗的种子细胞     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及诱导分化成骨细胞的实验研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离培养及诱导分化成骨细胞的潜能。方法采用Perco密度梯度离心和贴壁细胞法对MSCs进行分离培养,并观察其形态学特征。在诱导剂诱导作用下,通过形态学观察,采用免疫组化法检测细胞CD44,CD54表型,钙钴法检测ALP活性,Von-Kossa法矿化结节染色,RT-PCR扩增成骨细胞中CBFA I基因表达。结果采用Perco分离的MSCs,CD44,CD54表达阳性,经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,ALP合成增多,活性增加,Von-Kossa法矿化结节染色阳性,RT-PCR扩增出165bp CBFA I基因转录片段。结论体外分离纯化培养的MSCs经成骨诱导剂诱导后能向成骨细胞方向分化增殖。     

PPARγ在神经干细胞的表达

[目的]探讨神经干细胞(NSCs)增殖和分化过程中过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达情况及意义.[方法]体外分离培养神经干细胞,诱导其分化,先用免疫荧光法查看PPARγ在NSCs中的定位,然后分别取未分化的及诱导分化后d1、d5、d9的NSCs,应用RT-PCR和Western Blot法检测各相应时间点NSCs内PPARγ的mRNA及蛋白表达.[结果]成功培养大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并诱导其分化为神经元和神经胶质细胞.PPARγ蛋白存在于NSCs细胞核内,并在NSCs未分化阶段高水平表达,NSCs诱导分化后则表达量随时间延长而逐渐下降.[结论]在NSCs的增殖阶段,PPARγ的表达较高,而在分化过程中,表达量逐渐减少,提示PPARγ可能对NSCs的增殖和分化起重要作用.     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经样细胞的机制

目的探索骨髓间充质干细胞 (MSCs)在体外诱导分化为神经样细胞的机制。方法分离培养大鼠MSCs ,用二甲基亚砜 (DSMO)和丁羟茴醚 (BHA)诱导分化 ,检测诱导分化前、预诱导 2 4h、诱导分化后 6h、2 4h和 48h神经细胞和神经干细胞的特异性标记蛋白的表达。结果诱导分化后 ,大部分MSCs变成双极、多极和锥形 ,并相互交织成网络结构 ,巢蛋白 (Nestin)在诱导分化前不表达 ,在诱导分化后 6h达到最高 ,2 4h和 48h逐渐降低。神经元特异性核蛋白 (NeuN )在诱导分化前不表达 ,在诱导分化后 6h出现表达 ,2 4h和 48h表达增强。结论MSCs经体外诱导先分化为神经干细胞 ,然后分化为神经元样细胞。     

小鼠神经干细胞无血清培养方法的优化及其分化特点

目的:优化小鼠神经干细胞(NSCs)无血清培养方法,观察其生长、增殖和分化特点。方法:分离出生后1～3d小鼠海马、室管膜下区组织细胞,采用无血清培养技术,分别以Neurobasal+B27培养液和DMEM/F12+N2培养液为基础培养基,添加bFGF、EGF,进行体外扩增培养、传代,比较2种培养条件下NSCs的增殖;免疫细胞化学法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养均可形成细胞克隆,与DMEM/F12+N2培养液相比,以Neurobasal+B27培养液为基础培养基可获得更多的NSCs克隆球,且细胞数量多(P0.01),克隆中细胞Nestin表达阳性,显微镜下观察可见典型的NSCs特征,诱导后可分化为神经元和星形胶质细胞。结论:以Neurobasal+B27培养液为基础培养基可获得更多的NSCs,分离培养的细胞为具有自我更新和增殖能力的NSCs,可诱导分化为终末神经细胞。     

神经干细胞定向诱导分化为神经元的方法学研究进展

<正>神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一种多功能干细胞,具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力。体外培养的NSCs经血清自然诱导分化或移植入脑损伤模型后形成的神经元数量相对较少,大部分都分化为胶质细胞,这对NSCs的应用产生较大阻碍。近来研究尝试把某些药物制剂、激素作为NSCs诱导培养基的添加剂,或将NSCs与其它细胞共培养,以增加NSCs定向分化为神经元的数目。     

兔骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外分化成神经细胞的方法。方法：抽取兔骨髓，淋巴细胞分离液密度梯度分离单个核细胞，体外培养传代，第3代时加入二甲基亚砜(DMSO)，观察MSCs分化为神经细胞的形态学变化。结果：MSCs在体外可以扩增，在DMSO诱导下向神经样细胞分化，行神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体免疫反应染色。阳性率约为NSE 60％，GFAP 5％。实验活细胞率为70％～90％。结论：MSCs在DMSO存在下能够分化为神经细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子对恒河猴骨髓源性神经干细胞的体外诱导增殖作用

目的:探索骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)体外诱导分化为神经干细胞(nervestemcells,NSCs)的增殖条件,比较碱性成纤维细胞生长因子(basefibroblastgrowthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)对神经干细胞生长曲线的影响,为BMSCs在神经科学领域内的应用提供参考。方法:以恒河猴骨髓中分离出的BMSCs为实验对象,实验组利用NSC培养基和bFGF,EGF生长因子,进行体外培养、诱导、增殖。对照组用神经干细胞培养基进行培养增殖。Nestin及CD133作为免疫细胞化学鉴定NSCs的细胞标志。结果:原代培养第6天时多数细胞表现为Nestin及CD133抗原阳性,此后实验组及对照组细胞数量开始明显扩增,但实验组增殖更为明显,bFGF+EGF组从第8天时的(96.30±8.78)×104增加到第18天时的(1407.90±26.62)×104,并且增殖开始的时间较对照组提前2d。NSCs在10d后有少量细胞向神经元和神经胶质细胞分化。结论:bFGF与EGF联合应用能够促使NSCs增殖时间提前及增殖效能显著提高。另外,bFGF和EGF还具有诱导NSC向神经细胞分化的作用。