果蝇神经特异性拼接因子Dxl6变体在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的:表达与纯化果蝇中SR蛋白家族新成员Dxl6 N端变体.方法:用PCR方法扩增得到Dxl6 N端基因片段,经酶切亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中与GST融合表达,并用谷胱甘肽-sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白.结果:表达产物以可溶形式经亲和层析柱纯化后获得相对分子质量约为37 000的融合蛋白.结论:成功克隆、表达并纯化了果蝇神经特异性拼接因子Dxl6N端变体与GST的融合蛋白.     

人源Parkin蛋白在大肠杆菌BL-21(DE3)中的异源表达和纯化

目的 在大肠杆菌中异源表达和纯化人源Parkin蛋白.方法 构建带有人源Parkin基因的克隆载体,测序保证Parkin基因序列正确后,构建异源表达载体pET-28a/Parkin;在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导人源Parkin蛋白过表达,采用镍亲和色谱纯化人源Parkin蛋白,用West...     

人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达

目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

岸蟹金属硫蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

目的：在大肠杆菌BL21中表达岸蟹金属硫蛋白基因，建立金属硫蛋白原核表达的流程。方法：将重组质粒pET-GST-R转化至大肠杆菌，经PCR扩增和酶切检测，得到含重组质粒pET-GST-R的工程菌。结果：从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导金属硫蛋白表达的条件，表达出分子量约为33kD的融合蛋白。结论：成功制备金属硫蛋白的工程菌菌株。金属硫蛋白对大肠杆菌细胞毒性很大，培养基需添加金属离子。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

人白细胞介素6表达的核因子蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

将ＮＦ－ＩＬ６基因与谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因融合并成功地表达出具有生物活性的ＮＦ－ＩＬ６,经ＧｅｌＲｅｔａｒｄａｔｉｏｎ分析证实该重组蛋白能与其ＤＮＡ识别元件结合。实验还发现,虽然重组蛋白的表达率较低,但能形成不溶性包含体     

SHV-4型ESBL在pET26b/BL(DE3)中的表达纯化及其特性研究

目的:表达SHV-4型超广谱β-内酰胺酶,对纯化的SHY-4酶进行特性研究.方法:将SHV-4基因克隆到pET26b表达质粒,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,重组工程菌经摇瓶发酵后获得种子菌,种子菌转入发酵罐发酵,当菌体密度OD600为0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,于37℃培养6 h.培养液离心收获菌体沉淀,其超声裂解上清液进行Ni2 亲和层析,获取的SHV-4酶进行分子量、纯度、等电点、最适条件、米氏常数、催化常数等特性进行分析.结果:SDS-PAGE电泳,等电聚焦电泳及系列的酶动力学实验表明SHV-4酶分子量约为30 kD,纯度大于95%,等电点为7.9,最适pH值为6.0～8.0,最适温度为37℃,以头孢硝噻吩为底物测定的Km值为2.61×10-6 mol/L,Kcat为258 s,Kcat/Km为9.88×107 mol-1·s-1·vL.结论:重组的SHV-4酶初步满足制成商品酶的条件.     

重组人白血病抑制因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:利用大肠杆菌表达并制备重组人源白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)。方法:构建p ET-30a-rh LIF表达载体并转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)之中,IPTG诱导使无标签的目的蛋白呈可溶性表达,继而利用三步柱层析纯化目的蛋白。最后对所获目的蛋白活性进行测定,并对其N端和C端的完整性分别应用Edman测序法以及质谱法进行鉴定。结果:通过三步柱层析以及中间的内毒素去除步骤可使无标签rh LIF获得纯化,检测结果提示所获目的蛋白内毒素水平<1 EU/μg,其活性同市售商品化LIF产品一致,Edman测序结果提示少部分目的蛋白N端存在甲硫氨酸修饰,质谱检测结果表明所获目的蛋白C端完整性较好。结论:建立了一种新的重组人源白血病抑制因子表达和纯化的方法,本方法不需利用标签蛋白,并可有效降低所获蛋白中内毒素水平,所获rh LIF蛋白可用于干细胞培养以及相关生物学研究。     

Caspase 3在大肠杆菌E.coli BL21中表达和活性的研究

目的：研究凋亡蛋白酶Caspase 3在大肠杆菌中的表达及活性. 方法：用PCR法扩增出Caspase 3基因cDNA,然后插入pCMV-Myc载体,扩增后克隆至表达载体pGEX-6p,使用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导Caspase 3蛋白的表达;应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定其性质. 结果：经测定诱导3h后Caspase 3活性最高. 结论：可在大肠杆菌E.coli BL21中诱导表达出有活性的Caspase 3,为研究其在细胞凋亡中的作用奠定了基础.     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

重组人IL2-MUC1融合蛋白在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为制备新型MUC1疫苗提供实验依据。方法：通过PCR方法钓取人IL-2基因片段,将其克隆入pBS-SK-MUC1重组载体中，再将人IL2-MUC1串联基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1。将重组的pGEX-IL2-MUC1转化大肠杆菌BL-21，通过IPTG诱导表达，采用SDS-PAGE 和Western blotting鉴定表达蛋白。结果：经酶切及基因测序证实获得的IL-2基因片段 402 bp及IL2-MUC1基因片段852 bp基因序列正确；构建的pGEX-IL2-MUC1表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达GST-IL2-MUC1蛋白，经SDS-PAGE证实其相对分子质量为64 000，与理论预期值相符。Western blotting分析表明该表达产物与抗人MUC1多克隆抗体及抗人IL-2单克隆抗体均具有特异性结合能力。结论：成功构建表达人IL2-MUC1融合蛋白的工程菌，为进一步研究以人MUC1为靶点的新型抗肿瘤疫苗奠定基础。     

重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达

目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET－32a（＋）／AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET－32a（＋）质粒和重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基．p—D．硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni抖金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。     

重组血红素加氧酶-2在大肠杆菌中表达与纯化方法的研究

目的　确定重组血红素加氧酶 2在大肠杆菌中表达与纯化方法。方法　将已构建的血红素加氧酶 2(HO 2 )的重组质粒pMW1 72a HO 2转入大肠杆菌BL 2 1 ,分析不同温度及摇床转速对HO 2表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超声波、超速离心、分级盐析、分子筛层析等方法纯化HO 2。检测酶活性。结果　确定了HO 2可溶性表达最佳条件为 37℃ ,(85± 5 )r min ;确定了HO 2具体纯化路线。得到蛋白纯度为 95 .0 % ,纯化倍数为 2 .9倍 ,收得率为 4 0 .9%的活性HO 2蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的HO 2蛋白 ,为进一步进行HO 2结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

CGGBPl蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的：对人CGGBPl蛋白进行原核表达及纯化，为进一步研究CGGBPl的生物功能奠定基础．方法：构建原核表达载体pRSETA／CGGBPl．在大肠杆菌BL21中诱导表达人CGGBPl蛋白，经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化，利用链酶亲和素磁珠鉴定所表达纯化的蛋白能否和d（CC．G）29重复序列双链DNA特异性结合．结果：诱导后表达得到CGGBPl蛋白，纯化得到的可溶性表达产物CGGBPl蛋白可以和d（CGG）29重复序列双链DNA特异性结合．结论：表达并纯化得到可溶性CGGBPl蛋白，为进一步研究CGGBPl的结构与功能奠定了必要的基础．     

重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中表达和纯化方法的研究

目的　确定重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中的表达条件及纯化方法。方法　将已构建的大鼠肾胆绿素还原酶 (BVR)的重组质粒pMW172a -BVR转入大肠杆菌BL - 2 1,分析不同温度、摇床转速对BVR表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超速离心、盐析、层析的方法纯化BVR。检测酶活性。结果　确定了BVR可溶性表达最佳条件为 37℃ (12 0± 5 )r/min ;确定了BVR具体纯化路线。所得蛋白纯度为 92 2 %、纯化倍数为 4 3倍、回收率为 19 8%的活性BVR蛋白。结论　获得了纯度高、具有活性的BVR蛋白 ,可作为工具酶用于某些相关酶的研究 ,也为进一步进行BVR结构与功能之间关系的研究提供了可行的纯化路线     

PKB/Akt 调节结构域的克隆,表达及初步纯化

目的: 克隆akt1的调节结构域 (regulation domain RD )的编码基因,表达并纯化 Akt RD蛋白,为研究 RD的功能奠定基础.方法: 用RT-PCR方法从胚胎肝细胞中获得Akt1调节结构域RD的编码基因,克隆至pMD18-T载体并测序,结果正确后亚克隆到含有6个His的融合表达载体pRSET-A中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达RD/6×His融合蛋白,超声裂菌,将上清通过金属螯合层析进行纯化.结果: 从人胚胎肝细胞中扩增出编码RD的cDNA,序列测定证实与文献报道的序列一致;成功构建了6×His融合的表达载体pRSET-A -RD;表达了RD/6×His融合蛋白,并纯化得到了RD/6×His蛋白. 结论: 成功克隆了人akt1的调节结构域RD基因,构建了6×His融合的表达载体,表达了RD/6×His融合蛋白并得到了纯化的RD/6×His蛋白.     

质粒pGH/BL21在大肠杆菌中表达条件的研究

目的 寻找质粒pGH／BL21在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法 当它在大肠杆菌中表达时，考查不同IPTG诱导浓度及不同的诱导时间对表达产物的影响，表达产物的量以SDS—PAGE电泳方法分析。结果 该基因的最佳表达条件为：IPTG诱导浓度1．0mmol／L，诱导时间4h。结论 IPTG对不同的基因在不同的表达体系中需不同的诱导条件，只有找到它的最佳诱导条件才能保证终产物的最大产率。