力学刺激对软骨细胞Cdc42基因表达及表型的影响

目的 探讨大鼠软骨细胞在力学刺激下Cdc42(细胞分裂周期蛋白42)表达和软骨细胞表型稳定的相互关系。方法 分离和收集SD大鼠股骨头软骨细胞,在体外扩增培养到第3代,然后放在专用培养板中行力学刺激培养(应变幅10%,频率0.5Hz),分别在刺激0、3、6、9、12h后收集软骨细胞行免疫组化、定量PCR分析软骨细胞Cdc42和Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和Aggrecan(聚集蛋白聚糖)的表达,然后分析他们之间的关系。结果 软骨细胞在受到不同时间的持续的力学刺激后,Cdc42和Ⅰ、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达随着时间的变化出现规律性的变化,并发现其变化在9h达到了一个峰值。Ⅰ、Ⅱ型胶原和Aggrecan的表达和Cdc42的表达的变化出现了一致性。结论 力学刺激使软骨细胞Cdc42表达随时间变化并导致软骨的表型的表达也出现了相应的变化,Cdc42可能对软骨的表型具有调节作用。     

逆转录病毒载体介导HPV16E7对人关节软骨细胞的转化及其生长特性

目的 研究HPV16E7（human papillomavirus 16 E7)基因片段对人关节软骨细胞的转化作用以及转化细胞的生长特性。方法 利用含HPV16E7基因的逆转录病毒载体pLXSN转染人关节软骨细胞，检测HPV16E7基因的整合与表达，并用生长曲线，血清依赖试验，电镜及流式细胞仪细胞周期时相观察，了解转化细胞与正常软骨细胞的生长特性。结果 挑选出能够在体外长期培养的经HPV16E7转化的细胞克隆，已传代50代，PCR及RT－PCR证实HPV16E7已与宿主细胞基因组成功整合及转录，转化细胞的生长速率要高于正常软骨,二者都对血清有较大程度的依赖，转化细胞的核质比大，核仁明显，S期细胞数显著高于正常软骨细胞。结论 经HPV16E7基因转化的人关节软骨细胞增殖能力强，可连续传代达50代。     

bFGF对体外培养的兔软骨细胞的胶原合成和稳定细胞表型的作用

为探寻软骨损伤修复的理论依据 ,取新西兰幼兔关节软骨组织 ,经消化后将软骨细胞分别接种在含有bFGF和缺乏bFGF的培养液中进行培养 ,测软骨细胞对 [3H] 脯氨酸的摄取量 ,观察载玻片上单层细胞经Vangieson染色后的胶原形态和电镜下胶原的形态 ,观察在细胞汇合生长情况下 ,bFGF对软骨细胞表型表达的影响。结果 :在含有bFGF和缺乏bFGF培养基中生长的软骨细胞对 [3H] 脯氨酸的摄取量的对数值有明显差异 (P <0 .0 5) ;电镜下可见加入bFGF培养出的软骨细胞分泌的胶原比未加bFGF培养出的软骨细胞分泌的胶原排列有序 ;加入bFGF后汇合生长的细胞表型无变化 ,而缺乏bFGF软骨细胞发生成纤维细胞样变。提示 :bFGF可促进软骨细胞合成胶原 ,对维持汇合生长的软骨细胞正常表型有重要作用。     

bFGF、IGF-Ⅰ对兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insuline-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）单独及联合应用对体外培养多次传代的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。探讨传代多次的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：第3、5、7代体外培养的兔关节软骨细胞，以常规培养组作为对照组，bFGF（5ns／m1）或和IGF-Ⅰ（100ng/ml）单独刺激及联合刺激作为实验组，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的定性表达，并通过图像分析作半定量分析。结果：对照组细胞第5代以后无阳性表达。第3、5、7代细胞在bFGF或IGF-Ⅰ刺激下。Ⅱ型胶原表达强度显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF和IGF-Ⅰ联合作用下，Ⅱ型胶原表达强度均显著高于单独以bFGF或IGF-Ⅰ刺激组（P〈0．05）。结论：bFGF、IGF-Ⅰ能促进多次传代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且联合应用时促进作用更为明显。多次传代软骨细胞在生长因子刺激下，仍有再分化的能力。而有成为软骨组织工程种子细胞的可能。     

基质诱导的自体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的临床研究

目的:探讨基质诱导的自体软骨细胞移植(Matrix-induced Autologous chondrocyte implantation,MACI)修复关节软骨缺损的疗效。方法:膝关节软骨炎患者7例,年龄14~57岁,平均35.5岁;左侧5例,右侧2例。关节镜下取软骨、MACI。分别于术前、术后随访按膝关节IKDC2000主观评分标准和Lysholm评分标准进行主观问卷调查。结果:所有患者均获得随访,随访时间6~24个月,平均15个月。术后半年,多数患者各项症状逐渐消失,IKDC2000、Lysholm评分大部分增高;复查MRI和关节镜,显示原来缺损的关节软骨已基本修复,并伴有软骨下骨的修复。结论:MACI是治疗关节软骨缺损的有效方法。利用MACI技术修复关节软骨缺损具有术后恢复时间短、操作简便、创伤小、生成更多透明软骨等优点,具有良好的应用前景。     

山羊骨髓间充质干细胞分离培养及向软骨细胞诱导分化

目的 探讨体外分离、培养山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs),并将其诱导分化为软骨细胞表型,明确其向软骨细胞分化的能力.方法 抽取10月龄健康中国青山羊骨髓,贴壁法培养BMSCs,体外培养至第4代时进行流式细胞术鉴定,并加入成软骨诱导培养基,其成分包括10% FBS高糖DMEM培养基、6.25 μg/ml 胰岛素、6.25 μg/ml 转铁蛋白、50 μmol/ml抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松及10 ng/ml TGF-β1.分别于0、1、2、4周行细胞化学染色、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹试验(Western blot)检测II型胶原和Aggrecan的表达.结果 山羊BMSCs生长良好,传至第4代时细胞纯度较高.加入诱导培养基后,山羊BMSCs在1、2、4周均可看到软骨细胞表型的表达,并且随着时间的延长,其II型胶原及Aggrecan基因和蛋白的表达量逐渐增加,2周时即可达到较好的诱导效果.结论 本实验采取一种简易的方法 分离、培养并向软骨细胞方向诱导分化山羊BMSCs,证实其具有分化为软骨细胞的潜能,为山羊用于骨软骨组织工程的体内研究提供了实验基础.     

胰岛素样生长因子Ⅰ与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

【目的】研究胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )和透明质酸 (HA)联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响 ,判断其稳定软骨细胞表型的效果。【方法】分离培养人关节软骨细胞 ,从第 4代开始 ,用hIGF Ⅰ和HA联合培养 ,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化及RT PCR判断联合培养第 8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第 6代细胞为对照组。【结果】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡 ;RT PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性 ;甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒 ;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见 80 %～ 92 %的细胞染色呈阳性或强阳性 ,平均灰度分别为 85 92和 116 2 3,均显著低于对照组 ,说明处理组染色较对照组增强。【结论】IGF Ⅰ和HA联合培养的第 8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型 ,为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

胰岛素样生长因子I与透明质酸对人胚关节软骨细胞表型的影响

目的：研究胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸（HA）联合培养对人关节软骨细胞生物学行为的影响，判断其稳定软骨细胞表型的效果。方法：分离培养人关节软骨细胞，从第4代开始，用hIGF-I和HA联合培养，通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、II型胶原和aggrecan免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化。自然传代的第6代细胞为对照组。结果：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞浆内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡；RT-PCR显示II型胶原mRNA表达阳性而I型胶原mRNA表达阴性；甲苯胺蓝染色显示细胞浆内有大量的紫色异染颗粒；II型胶原和aggrecan免疫组化见80％-92％的细胞染色呈阳性或弱阳性，平均灰度分别为85.92和116.23，均显著低于对照组，说明处理组染色较对照组增强。结论：IGF-I和HA联合培养的第8代细胞仍能保持透明软骨细胞的表型，为体外获得高数量级别的有正常功能的人关节软骨细胞提供一种新方法。     

糖尿病诱导血管平滑肌表型转化机制的研究进展

糖尿病是一种以高血糖为主要特征的慢性疾病,其血管并发症严重影响患者预后及生活质量,成为糖尿病患者的首要致死原因.血管平滑肌表型转化在糖尿病血管并发症中起关键作用,因此阐明血管平滑肌表型转化机制成为近年来临床医师和科研人员的研究重点.文章对糖尿病诱导血管平滑肌表型转化机制和目前存在的靶向药物展开综述,为糖尿病血管并发症的...     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

胚胎干细胞向软骨细胞定向诱导分化的研究进展

软骨是一种由软骨细胞及细胞外基质(ECM)组成的特殊结缔组织,关节受损时,被破坏的软骨自我修复能力极低,需要细胞移植治疗.软骨组织的传统修复方式是自体组织分离的软骨细胞经体外大量培养后,将其包覆在生物性材料内再植入受损部位,这面临软骨细胞经体外培养逐渐丧失其原有特性而分化成其他组织的问题.胚胎干细胞具有自我更新和多分化潜能的特性,在一定培养条件下经适当刺激可诱导分化成软骨组织.这将为软骨组织的修复提供一种新的途径.本文拟简要探讨胚胎干细胞经诱导向软骨细胞方向分化的最新研究进展.     

二维及微团培养法对软骨细胞表型的影响

目的：探讨二维及微团培养对软骨细胞表型的影响。方法体外高密度二维及微团培养方法培养兔软骨细胞,从细胞形态、细胞外基质表达情况分析软骨细胞表型的差异。结果高密度二维方案培养兔软骨细胞,2周后软骨细胞多层分布, HE染色显示细胞呈圆形,细胞间联系较密,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌较少;微团培养方法培养兔软骨细胞,2周后形成肉眼可见的白色组织,HE染色显示细胞呈多边形,细胞较分散,阿尔新蓝染色显示细胞外蛋白多糖分泌明显多于二维培养,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论微团培养方法培养兔软骨细胞,有利于软骨细胞分泌细胞外基质。     

转化生长因子-β_1对猪关节软骨细胞合成糖胺多糖的作用

目的 :观察转化生长因子 β1 (TGF β1 )对软骨细胞外分泌基质糖胺多糖 (GAG)含量的影响。方法 :通过Ⅱ型胶原酶消化法获得高活性的软骨细胞 ,定量接种 6× 10 6 个细胞于培养皿 ,在细胞贴壁后更换培养基时 ,加入TGF β1 10ng mL ,每周传代 1次 ,连续 5周 ,留取所有培养液用阿利新蓝法测定软骨细胞外分泌基质GAG的变化 ;利用光镜观察原代及传代软骨细胞的生长情况。结果 :体外培养的软骨细胞从传代后合成糖胺多糖类基质 ,第 2代传代细胞分泌GAG的能力最强 ;加入TGF β1 能明显促进传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质。结论 :TGF β1 能明显促进体外培养的传代软骨细胞合成大量的糖胺多糖类基质     

Ⅱ型胶原体外促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化

目的 探讨Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ)在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向软骨细胞的定向分化作用.方法 体外培养BMSCs,分不同collagen Ⅱ接种浓度组(25、50、100、200 μg/mL)和空白对照组,分别作用于BMSCs 7、14、21 d,采用CCK-8法检测各不同浓度组对BMSCs活性的影响;qPCR法和免疫荧光法检测不同浓度组处理BMSCs后,各浓度组与空白对照组相比,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA及蛋白表达量的差异.结果 ①CCK-8检测结果显示各浓度组在7、14、21 d D(450)值差异无统计学意义(P＞0.05);②qPCR检测结果显示21 d后,不同浓度组与空白对照组比较,collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA表达量均升高(P＜0.05),以100 μg/mL组最高(P＜0.01);14 d时,各浓度组collagen Ⅱ、SOX9及aggreean mRNA以100 μg/mL组上调最明显(P＜0.05),而在7d时,各组之间三者mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05);③各浓度组21 d时免疫荧光结果显示:在100 μg/mL Ⅱ组collagen Ⅱ、SOX9及aggrecan mRNA蛋白的表达量较其他各组均明显上调(P＜0.05).结论 collagen Ⅱ可在体外促进大鼠BMSCs向软骨细胞分化,其中以100 μg/mL组促进作用最为明显.     

K562细胞的诱导分化与表型

Ｋ＿５６２细胞的诱导分化与表型临床生化教研室泰建平综述蒋纪恺，王霞文审校中图分类号Ｒ７３３．７目前对于白血病的治疗主要是用化疗、骨髓移植等，但疗效都不能令人满意。因此，探讨新的治疗途径显得十分必要而迫切。自从ＬｅｏＳａｃｈｓ于１９７８年报告恶性肿瘤细...     

组织TGFβⅡ型受体表达与胃癌恶性表型的关系

目的：通过检测29例胃癌病人组织TGFβⅡ型受体的mRNA水平，探讨它们与胃癌浸润和转移的关联性。方法：应用点杂交法和计算机灰度扫描分析组织TGFβⅡ型受体的mRNA灰度均值。结果：胃癌原发灶组的TGFβⅡ型受体mRNA灰度均值显著低于非肿瘤组织对照组（P＜0．001），分化较差组、浸润组及伴有淋巴结转移组均分别明显低于分化较好组、膨胀组及无淋巴结转移组（P＜0．05）。结论：组织TGFβⅡ型受体可能在胃癌的浸润和转移过程中发挥着某种作用。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的：研究软骨组织工程中传软软骨细胞与原代的差异，方法：用5个月人胎关节软骨分离培养细胞，观察细胞存活率，贴壁率，生长曲线和组织形态学的改变。结果：（1）软骨块在4℃下，3天内细胞存活率可达93．4％－97．6％。（2）原代细胞为圆形或三角形；第4代有一半转变成梭形，到第6代全部变为长梭形。（3）传代细胞贴壁时间（2－3h)短于原代（4－7h)。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为78．7％－85．5％，原代8．8％。（4）生长曲线表明，从原代到第4代都有高增殖力；到第8代时增殖降低；到第12代几乎丧失细胞增殖。结论：软骨块4度冷藏，3天内对细胞存活率无明显影响。第4代细胞壁壁快，增殖 ，适于作为组织工程用细胞，第8代以后不适合。     

大鼠关节软骨细胞的培养

目的探讨大鼠关节软骨细胞培养方法。方法采用胶原酶NB4消化法从1周龄SD大鼠的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况,并用HE、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色进行鉴定。结果软骨细胞形成单层的时间在原代培养1周左右,5d左右即可传代。第5代后部分变为梭形,第7代后绝大部分变为长梭形,增殖能力减弱。结论采用此法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞向软骨细胞表型分化的影响因素

目的探讨软骨形态发生蛋白1（CDMP1）生长因子体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化的影响因素。方法取包皮环切术后丢弃的真皮组织共3例,分离成纤维细胞体外培养扩增,以含10％胎牛血清的F—12培养液加入CDMP1（终浓度为100ng／m1）进行诱导,未加CDMP1的作为对照。观察细胞多次传代后（P2、P5、P10）细胞表型分化情况;调整CDMP1浓度分别为10、30、100、300ng／ml,观察诱导后软骨细胞表型的变化;单层培养与微团块培养成纤维细胞分别体外诱导7、14d,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞诱导前后骨形态发生蛋白受体（BMPR）、Ⅱ、Ⅳ、Ⅹ型胶原表达;Western印迹检测细胞诱导前后Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖的表达;流式细胞术检测表面标志CD29、CDl05、CDl06、CDl66及细胞诱导后Ⅰ、Ⅱ型胶原表达。结果细胞多次传代后（P5、P10）仍可表达特异软骨基质Ⅱ型胶原与蛋白聚糖,Ⅱ型胶原阳性细胞率与P2诱导后差异无统计学意义（P〉0．05）。CDMP1浓度为10、30ng／ml诱导7、14d,均未见Ⅱ型胶原与蛋白聚糖表达;CDMP1浓度为100、300ng／ml时,Ⅱ型胶原与蛋白聚糖表达强度差异无统计学意义。单层培养成纤维细胞诱导14d后,软骨基质表达消失;微团块三维培养诱导14d,软骨基质仍保持表达。RT—PCR检测诱导后ActR—Ⅰ／ALK-2,BMPR—IA／ALK-3,BMPR—IB／ALK-6基因表达明显增强。结论在CDMP1生长因子诱导下,人真皮成纤维细胞体外扩增后可保持向成软骨细胞表型分化能力,细胞分化与CDMP1浓度、细胞三维培养条件及BMPR介导有关。