建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株的巢式PCR方法

目的建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。方法通过全基因组序列比较, 分析布鲁氏菌A19疫苗株与其他布鲁氏菌全基因组序列的差异位点, 依据差异位点设计引物, 建立检测与鉴定布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。提取布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA, 倍比稀释后作为模板DNA, 应用建立的巢式PCR方法进行灵敏性测试;同时, 应用建立的巢式PCR方法检测除布鲁氏菌A19疫苗株之外的其他布鲁氏菌及非布鲁氏菌菌株基因组DNA, 进行特异性测试。结果建立的巢式PCR方法检测布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA最低检出限为3.43 fg, 扩增结果显示, 出现246 bp电泳条带, 其他布鲁氏菌菌株出现314 bp电泳条带, 而非布鲁氏菌菌株均未扩增出电泳条带。结论建立的巢式PCR方法具有灵敏性高、特异性强的特点, 反应体系中存在1个拷贝数的布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA, 即可检测到, 本方法适用于标本中布鲁氏菌A19疫苗株微量基因组DNA的检测与鉴定。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

副溶血性弧菌热稳定直接溶血素基因转录水平差异研究

目的 运用实时荧光定量 PCR 检测24株副溶血性弧菌热稳定直接溶血素（TDH）基因转录水平差异。方法 普通 PCR 法检测分离自患者、海产品和环境中的副溶血性弧菌 tdh 基因,tdh 阳性菌株提取细菌总 RNA 后逆转录合成 cDNA,检测无 DNA 污染后定量至同一浓度,采用实时荧光定量 PCR 同时检测 cDNA 产物中 tdh 基因和内标基因16 S rRNA 的 Ct 值,ΔCt 等于 tdh 的 Ct 值减去16 S rRNA 的 Ct 值,以ΔCt 值反应 tdh 相对于内标基因16 S rRNA 的转录水平。结果 24株副溶血性弧菌的 tdh Ct 值、内标基因16 S rRNA Ct值和各样本两者之差的ΔCt 值结果范围分别为18.04～25.95、8.30～10.93和8.28～15.34,ΔCt 最大值与最小值差为7.06,最高转录水平菌株为最低菌株的133倍（ΔΔCt ＝27.06）。结论 副溶血性弧菌 tdh 基因转录水平存在较大差异,该差异性形成的分子机制以及与该菌的致病性的关系有待进一步研究。     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

荧光定量聚合酶链反应检测血液制品中细菌污染方法的建立

目的建立快速检测血液制品中细菌污染的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌分别作为革兰阴性菌和革兰阳性菌代表菌,模拟不同程度细菌污染的血液标本,利用3种不同抽提方法提取细菌基因组DNA进行荧光定量PCR(FQ-PCR);以大肠埃希菌系列浓度梯度基因组DNA为模板建立标准曲线,将14株不同菌株模拟细菌污染的血液标本进行FQ-PCR检测。结果根据Ct值和扩增效果,3种基因组抽提方法中以DNA过柱纯化法效果最佳;以大肠埃希菌梯度稀释(1.2×108)～(1.2×102)CFU/ml进行FQ-PCR反应,得到标准曲线为Y=-0.2211X+8.80(R2=0.998);14株不同细菌均能在103CFU/ml检测出阳性,但Ct值差异有统计学意义。结论建立了检测血液制品中细菌污染的荧光定量诊断技术,该方法快速可靠,在预防和诊断输血相关性细菌污染上具有一定的应用价值。     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值

目的建立荧光实时定量PCR（FQ-PCR）定量测定铜绿假单胞菌的方法，检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法选择铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物，建立Taqman探针FQ-PCR体系定量检测5种标准菌株、3种病毒株、白色念珠菌、肺炎支原体、人基因组DNA及临床培养96株菌株。结果31株铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌与其它菌种或人全血的混合液均产生特异扩增信号，标准曲线的相关系数为0．997；其他菌种（76株）无扩增；乙肝病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体及健康人全血均无扩增，与传统培养相比特异性吻合率达100％，铜绿假单胞菌标准株按等级浓度稀释后其拷贝数也呈等级梯度递减，实际可检测到的最小菌落数为100个／ml，全程检测〈4h。结论荧光实时定量法检测oprI基因可以运用于铜绿假单胞菌的快速检测。     

肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应标准质粒的构建

目的制备用于检测肉制品中沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准质粒。方法设计针对沙门菌inv A基因的引物,扩增特异片段,转入质粒载体中构建重组质粒。将构建的重组质粒作为标准品,进行优化后的实时荧光定量PCR,建立标准曲线,并考察该标准品灵敏性及稳定性。结果成功构建含有沙门菌inv A基因的质粒标准品,用其建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.9979),最低可以检出10拷贝/反应。该标准质粒经验证具有良好的稳定性。用该质粒标准品检测肉制品中的沙门菌,经2 h增菌后,可在7 h内完成对样品的检测。结论所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门菌,为考量实验质量提供参考依据。     

基孔肯雅病毒的纳米金实时荧光PCR方法的建立

目的建立一种检测基孔肯雅病毒纳米金实时荧光定量PCR的方法。方法以课题组建立的普通实时荧光PCR方法为基础,在PCR体系中添加不同大小粒径的纳米金进行体系优化,评价优化后的体系。结果添加纳米金的实时荧光PCR较不添加的扩增效率高;优化后的纳米金实时荧光PCR产物的Ct值与模板稀释浓度存在良好的线性关系,回归方程:y=-3.31x+41.78,R2=0.9997,PCR扩增效率为99.5%。结论纳米金能提高实时荧光PCR的反应效率。     

脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测

目的探讨荧光定量PCR技术检测脆弱类杆菌。方法用特异性引物和荧光染料实时PCR扩增并检测产物。结果脆弱类杆菌标准株（ATCC25285）和4株分离株均有特异扩增曲线，灵敏度达102个菌；而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论荧光染料实时PCR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌     

实时荧光定量PCR快速鉴定短乳杆菌

目的:建立鉴定短乳杆菌的实时荧光定量PCR法。方法:根据GanBank登录的乳酸杆菌序列,以gyrB基因为靶目标设计引物和探针,对啤酒中分离到的6株乳酸杆菌进行实验,并对其中一个短乳杆菌样本作定量检测。结果:实时荧光定量PCR对短乳杆菌可产生特异扩增信号,对其他乳酸杆菌无响应。标准曲线的相关系数为0.97739,测得短乳杆菌样本浓度为15635拷贝/m l。结论:实时荧光定量PCR是一种快速、特异、灵敏检测短乳杆菌的方法。     

西尼罗病毒PCR检测方法的建立

[目的]应用通用引物建立快速、敏感、特异的PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染相关疾病的实验室监测和早期诊断。[方法]以西尼罗病毒感染者血清分离得到的病毒RNA逆转录cDNA为检测样本,通过对多株病毒基因组序列各区段保守性进行分析比较,在基因组非编码区设计引物和探针,分别用巢式PCR和荧光定量PCR方法对样本进行扩增。[结果]以西尼罗病毒RNA逆转录cDNA为模板,采用所建立的两种PCR方法,均可得到阳性检测结果。[结论]本研究设计的PCR扩增引物具有较好的通用性;建立的实时荧光定量PCR结合巢式PCR用于检测WNV的分析方法具有互补性,为研制成熟的西尼罗病毒检测试剂盒提供实验基础。     

嗜肺军团菌基因检测及分子特征研究

目的:了解外环境水中分离的嗜肺军团菌菌株的基因特征及遗传背景。方法:40株分离株分别经血清学凝集试验、胶乳凝集试验确定为LP1型嗜肺军团菌后,利用普通PCR技术对军团菌属5S rRNA基因和嗜肺军团菌mip毒力基因的特异序列进行扩增,应用实时荧光定量PCR技术扩增嗜肺军团菌mip基因,使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型技术对菌株进行全染色体DNA酶切电泳分型,并用BioNumerics Version 4.0软件进行聚类分析。结果:所有的菌株均带有属特异性5S rRNA基因及mip毒力基因,PFGE聚类分析结果显示大多数菌株的遗传相似度有一定差异。结论:所有菌株经普通PCR或定量PCR均相应扩增出其特征基因,PFGE聚类分析结果提示浙江省散在水系中分离的嗜肺军团菌菌株存在遗传多样性。     

实时荧光定量PCR检测汉赛巴通体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测汉赛巴通体的实时荧光定量PCR方法。方法根据汉赛巴通体特异的16S-23S rRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的16S～23S rRNA间隔区基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900HT)上建立实时荧光定量检测方法,对所建立的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析,并且对模拟标本进行检测。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(C_(?))与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其1000倍。用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,除军团菌检出微弱信号(2个拷贝)外,其余检出结果均为0;对重复性进行了评价,批内和批间的变异系数在0.2%～1.9%之间。用荧光定量PCR检测汉赛巴通体感染的小鼠血标本,在感染后第2天、第3天、第5天,检出少量的汉赛巴通体,在感染后的第1天和第2天从脾脏样本中检出大量的汉赛巴通体。结论检测汉赛巴通体实时荧光定量PCR方法具有高度特异性和高敏感性以及良好的重复性,可用于快速检测各种样本中的微量汉赛巴通体以及作为汉赛巴通体感染的实验室诊断。     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

实时荧光定量PCR、细胞培养法在流感病毒检测中的对比分析

目的对实时荧光定量PCR法和细胞分离培养法2种流感病毒检测方法和结果进行比较研究,为2种方法各自的实用领域提供参考依据。方法在流感高峰季节收集流感哨点医院流感样病例标本(ILI),同时进行实时荧光定量PCR检测和狗肾传代细胞培养,比较2种方法检测结果的差异。结果 1 025份ILI病例样本中,实时荧光定量PCR、细胞培养检测流感病毒核酸阳性率分别为26.63%、12.58%,差异有统计学意义(χ2=64.165,P0.05)。273份流感核酸阳性ILI病例样本中,分离病毒株118株,分离率为43.22%;752份阴性样本中,分离病毒株11株,分离率为1.46%。实时荧光定量PCR阳性标本与阴性标本分离率差异有统计学意义(χ2=94.712,P0.05)。结论实时荧光定量PCR具有高度灵敏性,检测速度快,实用于流感疫情应急检测、临床诊断、常规监测;细胞培养可获得毒株,用来开展抗原性、基因特性和耐药性等深入研究。     

实时荧光定量PCR检测0139群霍乱弧菌研究

目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测0139群霍乱弧菌的定量方法.方法:选取0139群霍乱弧菌糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记.对PcR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定.结果:本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定0139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例0139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致.结论:本文建立的检测0139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为0139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段.     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

猪链球菌2型多重PCR鉴定方法建立

目的 建立猪链球菌2型多重PCR鉴定方法.方法 根据猪链球菌种特异基因16S rRNA序列和猪链球菌2型特异性荚膜多糖编码基因cps2J基因序列,设计和合成2对特异引物,通过条件和体系优化,建立多重PCR检测方法.结果 猪链球菌2型参考株及18株分离株均扩增到清晰的目的 条带,而6株非猪链球菌2型参考菌株不能扩增出目的 条带.结论 多重PCR可以用于猪链球菌2型检测,特异性和敏感性好,为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术方法.     

新型冠状病毒N亚基因组荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组(SgN)的方法, 探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法根据全球共享流感数据库(GISAID)公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针, 优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件, 建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法, 绘制标准曲线, 评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本, 并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果 SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×102copies/ml, 变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%(361/372), gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%(7/19)和49.42%(169/342)。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔(Delta)毒株低。在25份SgN阳性样本中, 采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒;13份...