开发用于肿瘤微环境成像的pH敏感荧光探针

目的·合成水溶性pH响应性花菁类近红外荧光探针,评估其光学性能,并将其应用于模拟肿瘤微环境的在体成像。方法·应用两步经典的化学反应,合成水溶性pH响应性近红外荧光探针R2S,同步合成脂溶性探针R2Z作为对照。应用磁共振氢谱、质谱及高效液相色谱验证探针的化学结构及纯度。利用紫外-可见、光致发光光谱学测试评价探针的pH响应性、响应可逆性、光稳定性及结构稳定性。利用细胞荧光共定位成像评价探针的细胞膜通透性,使用HCT-116细胞、HeLa细胞进行细胞毒性实验,使用BALB/c健康雌性小鼠进行小动物在体成像实验,评估探针的安全性。通过在小鼠背部左侧和右侧分别皮下注射pH 6.50和pH 7.40的PBS溶液模拟肿瘤微酸性环境和正常的细胞环境,随后注射探针R2S进行在体成像实验,比较R2S在pH 6.50侧和pH 7.40侧的荧光强度。结果·成功合成了水溶性pH响应性近红外荧光探针R2S及其脂溶性类似物R2Z。随着溶液酸性逐渐增强（从pH 11.10到pH 3.47）,R2S的最大吸收波长由642 nm红移至774 nm,最大发射波长亦由794 nm红移至808 nm。探针R2S的酸解离常数（p...     

靶向MPO的次氯酸荧光探针用于细胞成像

目的：合成靶向髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）的次氯酸（hypochloric acid,HClO）荧光探针并评估其HClO示踪活性。方法：以硅罗丹明为荧光团合成SiRho-GABA-KYC,紫外分光光度计和荧光分光光度计检测其紫外光谱和荧光光谱以及pH稳定性和选择性,CCK-8法检测细胞毒性,用共聚焦显微镜进行细胞荧光成像。结果：合成了SiRho-GABA-KYC,对 HClO响应高,选择性好,细胞毒性小,可示踪HeLa细胞中HClO浓度的变化。结论：探针SiRho-GABA-KYC可用于检测HClO 浓度进而反映MPO催化活性。     

苯乙烯类菁染料pH荧光探针在细胞荧光成像中的应用及细胞毒性检测

目的制备一种苯乙烯类菁染料用于细胞活体荧光成像。方法将1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚和4-吡啶苯甲醛反应得到
苯乙烯类菁探针,考察pH对苯乙烯类菁探针荧光性能的影响,检测探针对细胞活性的影响,最后将苯乙烯类菁探针作为探针应
用于活细胞成像。结果制备的苯乙烯类菁探针在中性和碱性条件下显示绿色荧光,在酸性条件下荧光发生由绿色变成橙色。
该探针用于细胞活体成像荧光信号清晰可见。结论研制出了一种用pH敏感的苯乙烯类菁探针,该探针表现出了较好的细胞
穿透性和细胞活体成像性能。
     

基于芴母核的新型水溶性弱酸性荧光pH指示剂

目的:设计并合成可以检测弱酸性环境的pH荧光探针,为检测溶酶体 （pH =4~5）和内涵体（pH=5~6）中的酸性环境提供科学的方法依据。方法:以2,7-二溴芴为荧光母核,分别与电子给体二乙胺基和电子受体苯并噻唑相连,构建供体-π-受体体系,并在芴的亚甲基上引入能够改善水溶性的二乙二醇甲醚乙基得到目标化合物5,并对其进行核磁表征确定结构,采用紫外分光光度计法和荧光光谱法研究目标化合物5对pH值的响应性,计算pKa。结果:核磁数据与化合物结构相吻合,化合物5紫外吸光度与荧光强度变化具有pH依赖性,通过非线性回归显示pKa为5.88。结论:基于芴母核结构设计并合成了探针化合物5,紫外和荧光结果表明是一个弱酸性pH荧光指示剂,在弱酸性环境的检测方面应该具有很好的应用前景。     

两种荧光显微成像系统采集细胞器探针荧光图像的对比研究

目的：应用荧光显微数码成像系统和共聚焦荧光显微成像系统采集细胞器探针图像的对比研究。方法：传代培养内皮细胞，将四种细胞器探针与细胞共同孵育不同时间。采用荧光显微镜、计算机及高分辨率数码CCD组成的荧光显微数码成像系统采集四种细胞器探针的荧光图像。同时应用激光共聚焦显微镜采集图像进行对比。结果：两种系统均可采集到细胞器荧光探针的图像；荧光显微数码成像系统采集的图像的特点为分辨率高，速度快，对细胞器的损伤小。结论：荧光显微数码成像系统在细胞器探针的荧光检测定位研究中准确可靠、方便实用。     

脂筏特异性AIE荧光探针的设计、合成及其应用

脂筏（lipid raft）是由饱和磷脂、鞘磷脂以及胆固醇组成的位于细胞膜的液态有序微区，与细胞的许多生理/病理过程密切相关。基于脂筏区与非脂筏区脂质组成与分布的差异，本研究设计并合成了一种具有聚集诱导发光（aggregation-induced emission，AIE）特性的脂筏探针胆固醇-三聚乙二醇-四苯乙烯（TCHS-TPE）用于细胞膜上脂筏区的便捷特异性成像。本研究首先成功合成了TCHS-TPE，同时测定了TCHS-TPE的光物理性质以评价其AIE特性，最后采用激光共聚焦显微镜研究了TCHS-TPE对B16F10黑色素瘤细胞膜上脂筏区的特异性成像。与现有脂筏探针霍乱毒素B（CTxB）相比，TCHS-TPE脂筏探针具有操作简单、特异性高等优势。该荧光探针的成功合成将为研究脂筏区相关生理、病理过程提供有利工具，并为其他脂筏区成像探针的设计奠定了理论基础。     

壳聚糖纳米微粒荧光探针的制备及特性研究

目的 制备出壳聚糖纳米微粒荧光探针,对其物理特性进行研究,并观察其靶向性及细胞毒性.方法 使用离子交联法制备出壳聚糖纳米微粒荧光探针(chitosan-nanoparticles-fluorescein isothiocyanate,CS-NP-FITC).Zeta粒径分析仪观察其粒径及表面电位情况;扫描电镜观察其形态特点;接着用靶向转化生子因子βⅡ型受体(TGF-β receptor Ⅱ,TβRⅡ)的核酸适配子S58标记CS-NP-FITC,作用于人Tenon's囊成纤维细胞(human Tenon's capsule fibroblasts,HTFs),观察其靶向结合特异性受体的情况;用LDH释放实验检测其细胞毒性.结果 制备出的壳聚糖纳米微粒荧光探针CS-NP-FITC的平均粒径为274.6 nm,平均表面电位为+24.3 mV,扫描电镜下可观察到呈球形的微粒,分布均匀;激光共聚焦显微镜下观察到适配子S58标记的CS-NP-FITC能够与TβRⅡ特异性结合;LDH释放试验证实CS-NP-FITC的使用浓度在0.18～18 mg/mL时,细胞毒性很小,具有良好的生物相容性.结论 壳聚糖纳米微粒荧光探针CS-NP-FITC经适当的适配子或抗体标记后具有靶向结合特异性受体的能力,且细胞毒性小,具有应用于生物成像中的潜力.     

L-鸟氨酸盐酸盐碳点的制备及其在细胞成像中的应用

目的:以L-鸟氨酸盐酸盐探索制备新型碳点,并研究其在细胞成像领域的应用。方法:以L-鸟氨酸盐酸盐为碳源,利用一步水热法,制备出碳点,通过高分辨率透射电镜(HRTEM)、紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和傅里叶红外光谱(FTIR)等方法对碳点的大小、形貌和光学性能进行表征;MTT法检测碳点的细胞毒性,荧光显微镜观察碳点对肿瘤细胞A549成像能力。结果:L-鸟氨酸盐酸盐碳点具有水溶性好,粒径均一,荧光性质稳定,细胞毒性低等优点,并能用于A549细胞荧光成像。结论:L-鸟氨酸盐酸盐碳点具有优良的光学性质,有望应用于细胞成像领域。     

以基质金属蛋白酶-2为靶向的荧光共振能量转移探针制备及其对肝癌细胞的检测

目的构建以基质金属蛋白酶-2(MMP-2)为靶向的聚乙二醇(PEG)修饰的荧光共振能量转移探针,探讨其用于肝癌细胞成像检测的可行性。方法将荧光基团7-(N,N-二乙基氨基)香豆素-3-羧酸琥珀酰亚胺酯通过能够被MMP-2切割的多肽链(GPLGVRGKGG)连接淬灭基团4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸N-丁二酰亚胺酯,构建荧光共振能量转移(FRET)探针。以人肝癌7402细胞和人正常肝细胞L-O2为研究对象,通过细胞成像实验检测人肝癌7402细胞和L-O2细胞中MMP-2的表达水平。结果体外实验(MMP-2、MMP-1及其他物种对探针的荧光响应)显示了探针对MMP-2的靶向性;体内实验(细胞成像)结果显示,人肝癌7402细胞中MMP-2表达水平高于人正常肝细胞L-O2。结论该实验制备的探针可以检测人肝癌7402细胞和人正常肝细胞L-O2中MMP-2的表达,将有望用于肝癌的筛查、诊断和预后判断。     

具有聚集诱导发光特性的四苯基乙烯在细胞成像中的应用及细胞毒性检测

目的 应用四苯基乙烯(TPE)进行细胞成像并检测其对细胞的毒性.方法 用不同浓度的TPE对人宫颈癌细胞和原代人乳腺成纤维细胞进行细胞成像,观察染色部位和荧光强度,并检测不同浓度的TPE对细胞的活性和凋亡的影响.结果 在紫外光激发下,TPE完全溶解时不发光,而固态时发出蓝色荧光.TPE选择性作用于细胞质,随着TPE浓度的增加荧光强度增强,并且TPE对细胞的活性和凋亡没有明显影响.结论 TPE可以作为一种活细胞染色剂,在其基础上可以合成具有细胞器或者细胞内分子特异性的荧光探针,在生物医学领域具有良好的应用前景.     

谷胱甘肽响应型探针的制备及其在天然药物筛选中的应用

目的 制备谷胱甘肽（glutathione, GSH）响应的香豆素类荧光探针并应用于中药GSH调节剂的筛选。方法 以香豆素为荧光团,2-氯-5-硝基嘧啶为淬灭基团,构建GSH响应的荧光探针（HCN）,通过紫外、高效液相色谱、荧光光谱和核磁等表征手段确定HCN的结构及其对GSH响应的可行性、特异性、灵敏性,以确定最佳响应条件。通过MTT实验及细胞成像考察HCN的细胞毒性及胞内荧光信号。以GSH商品化消耗剂（NEM）为阳性对照,选取民族药血筒中16种化合物为筛选对象,通过HCN检测所选化合物对GSH水平的调控能力,并进一步采用分子对接手段验证筛选结果的可靠性。结果 核磁谱表明HCN合成成功,能与GSH特异性响应并呈线性关系,且HCN的最佳反应温度和反应时间分别为37℃和100 min。MTT实验表明,在HepG2细胞中,与0μmol/mL相比,80μmol/mL和100μmol/mL的HCN降低了细胞活力（P<0.05）,说明HCN对HepG2细胞增殖有影响;在HL-7702细胞中,与0μmol/mL相比,各浓度HCN对细胞活力影响微弱（P>0.05）,说明HCN对HL-770...     

乳腺癌转移演进的关键分子ALDH2体外可视化研究

目的：分析乙醛脱氢酶2(ALDH2)靶向脂质体纳米探针ALDH2-Cy7@LP-FA在细胞水平的成像能力和靶向性能。方法：研究制备荧光探针ALDH2-Cy7@LP-FA,通过粒径分析、紫外吸收和荧光发射光谱对其进行表征。利用Western印迹和免疫组化检测ALDH2在乳腺癌组织和细胞系的表达情况。以ALDH2高表达的乳腺癌细胞BT474、MDA-MB-231作为实验组,ALDH2低表达的MCF-10A作为对照组,通过流式细胞术及共聚焦荧光显微镜,观察探针的亚细胞器共定位及成像效果。采用CCK8法分析探针的细胞毒性和生物相容性,为体内成像提供实验依据。结果：脂质体探针ALDH2-Cy7@LP-FA粒径均一分布[（155±2）nm],脂质体的包载使得标记抗体的紫外吸收和荧光发射分别发生了4 nm和5 nm的蓝移,脂质体的包载实现了抗体纳米化。ALDH2蛋白在BT474细胞系中表达最高,在MCF-10A表达最低（t=29.123,P<0.001）。体外摄取及成像效果显示,ALDH2-Cy7@LP-FA可特异性靶向线粒体中的ALDH2,对BT474细胞的结合亲和力高于231细胞,对MCF...     

无溶剂法荧光碳点的制备及卵巢癌细胞荧光成像研究

目的：构建基于碳点（carbon dots,CDs）的荧光纳米探针CDs@Tf,探讨其材料制备及应用于卵巢癌细胞荧光成像的潜能。方法：以二水合柠檬酸钠和尿素为原料,在高温下经无溶剂法制备一种高效荧光碳点,用新型四唑化合物（MTS）法检测其对人卵巢癌细胞HO?8910及人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926的细胞毒性。昆明小鼠经尾静脉注射CDs 7 d和21 d后采集主要器官（心、肺、肾、肝、脾）进行组织学分析,评价CDs的活体毒性。利用1?（3?二甲基氨基丙基）?3?乙基碳化二亚胺盐酸（EDC·HCl）及 N?羟基琥珀酰亚胺（NHS）作为化学耦合剂,将制备的CDs与转铁蛋白（Tf）共价结合成荧光分子探针CDs@Tf。对其表征分析并应用于细胞成像。结果：制得一种平均粒径为3.85 nm的球形荧光CDs,最佳激发波长为400 nm,最大发射波长为520 nm,量子产率高达93%。所制备的CDs具有较高的荧光强度和低细胞毒性等性质。建立的CDs@Tf分子探针能靶向识别H0?8910卵巢癌细胞。结论：成功构建一种光学性能优良、毒性低的靶向性新型荧光纳米探针CDs@Tf,有助于应用于卵巢癌的早期筛查。     

一种用于前列腺癌细胞体外检测生物导航纳米探针的制备

目的 制备一种用于对人前列腺癌PC3细胞进行体外检测的粒细胞靶向介导的磁性-荧光纳米探针.方法 制备以Fe3O4为核、表面包被siO2和异硫氰酸罗丹明的具有磁性且携带红色荧光的纳米材料,将其与正常人外周血粒细胞按不同比例混合,分别孵育不同时间以检测纳米材料对粒细胞的毒性.选择最佳比例将纳米材料和粒细胞体外结合,得到粒细胞靶向介导的磁性-荧光纳米探针;将PC3细胞与正常人全血细胞分别以不同比例混合,加入上述探针,于荧光显微镜下观察探针的靶向情况.结果 在实验所用的浓度和作用时间范围内,制备的纳米探针对粒细胞存活率无明显影响.镜下可见纳米探针在PC3细胞周围富集,形成“花瓣样”结构,而全血细胞周围无探针富集.结论 本研究制备的磁性-荧光纳米探针不会对粒细胞本身产生明显毒性,利用粒细胞对肿瘤细胞的生物靶向作用可使纳米探针有效地靶向检测肿瘤细胞.     

HaloTag 技术在α-突触核蛋白质的细胞影像与定量分析中的应用

目的：探讨 HaloTag 技术用于α-突触核蛋白质（α-synuclein,SNCA）在细胞内荧光成像及半定量分析的方法及其应用。方法采用重组克隆技术构建 pHalo-SNCA 质粒,将其转染至 HEK293人胚肾细胞中,经 Western blotting 鉴定 Halo-SNCA 融合蛋白质的表达;通过激光共聚焦显微镜观察 Halo-SNCA 在细胞内的定位与分布;通过蛋白酶催化的解偶联反应的荧光强度测定细胞内 Halo-SNCA 的荧光强度进行目的蛋白质的间接定量分析。结果本研究成功构建了 Halo-SNCA 真核表达质粒,能够在转染的真核细胞中高效表达目的融合蛋白质,该融合蛋白质结合特定的荧光配基后,可通过激光共聚焦显微成像分析 Halo-SNCA 在细胞中的动态水平与分布状况。此外,经水解释放的荧光配基可用于表达融合蛋白质在细胞中较为精确的相对定量分析。结论HaloTag 技术能够用于 SNCA 在细胞内成像和定量分析,同时可以作为细胞生物学和生物化学分析的可关联检测指标。对于SNCA 的生理功能以及在神经系统病变中的作用等相关研究,HaloTag 具有令人瞩目的潜在应用前景。     

以HER2为靶点的乳腺癌双模态纳米探针的制备与实验研究

目的 构建具有荧光成像和磁共振成像的双模态纳米探针Fe₃O₄-Cy5.5-trastuzumab,分析其表征,初步探讨其对乳腺癌人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)阳性表达的SKBR-3细胞在体外的靶向性及显像。方法 将聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)加入超顺磁性氧化铁溶液中,离心后用NaHCO₃调节pH为7.5。所得溶液与荧光Cy5.5偶联得到Fe₃O₄-PEG-Cy5.5。再将曲妥珠单抗(Trastuzumab)加入上述溶液中,室温下孵育过夜,离心除去未反应的Trastuzumab,其细胞毒性运用CCK-8法进行检测,细胞摄取情况运用激光共聚焦显微镜检测,并采用纽迈小核磁、磁共振分别检测其弛豫率及强化程度。结果 所制备纳米探针通过透射电镜观察,其大小均匀、呈颗粒状,粒径大小约(85.67±11.46)nm,水合粒径约(93.72±6.34)nm,电位为(-21.54±3.2...     

还原响应荧光探针的研制

基于荧光共振能量转移(FRET)原理和胞质中的还原环境,对载体在细胞胞质中的稳定性进行了表征。首次合成了同时具有FRET效应和还原响应性的新型荧光探针偶联物:3-羧酸-7-羟基-香豆素-硫-硫-异硫氰酸荧光素(CHC-SS-FITC)。以脂质体为模型载体,制备了荷载荧光探针偶联物的脂质体,并评价了探针偶联物的荧光共振能量转移效应和还原响应性。以巨噬细胞为模型细胞,通过激光共聚焦显微技术考察了载药纳米脂质体在巨噬细胞中稳定性。结果表明,本研究设计的新型荧光探针偶联物CHC-SS-FITC,由于同时具备FRET效应的高灵敏度和还原环境触发式响应的强抗干扰能力,克服了传统表征手段的不足,为纳米载体在细胞胞质中的稳定性表征开辟了新的道路。     

应用定量分析法与图像观察法对光敏剂细胞内分布的对比研究

目的 探讨定量分析法在光敏剂亚细胞定位研究中的应用特点,并与图像观察法进行比较. 方法 传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂血卟啉单甲醚孵共同孵育2,12,24 h.选择四种特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、Lucifer yellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体,倒置荧光显微镜和致冷CCD探测HMME和探针荧光图像.观察细胞中光敏剂和荧光探针各自的荧光图像并分析光敏剂在细胞中的分布特点.定量计算探针荧光高强度区域与细胞区域内的HMME荧光均量比IB/IA. 结果 图像观察法显示,孵育2,12,24 h,细胞内HMME几乎不进入细胞核,而主要弥散分布于细胞质及各细胞器.定量结果显示: A549肺癌细胞内,2 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、线粒体、内质网;12 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体;24 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体;高尔基体组IB/IA随时间上升. 结论 应用定量分析法较图像观察法更可以准确反映出HMME在细胞内分布随着孵育时间变化的特点.     

荧光定量法测量平滑肌细胞内钙离子浓度的探讨

目的 研究平滑肌细胞内Ca^2 浓度的动力学变化，建立一种定量测量细胞内Ca^2 浓度的方法。方法 分离肠系膜细动脉血管平滑肌(ASMC)细胞，用荧光探针Indo-1和激光扫描共聚焦显微成像技术测定单个平滑肌细胞Ca^2 浓度的动力学变化；首先在37℃环境下标定Ca^2 探针indo-1的解离常数Kd值，根据荧光-浓度换算公式将测量的荧光强度值换算成Ca^2 浓度值。结果 激光扫描共聚焦显微成像技术测量的细胞荧光图像分析显示．平滑肌细胞[Ca^2 ]i在地塞米松的刺激下显著上升，有时会出现自发钙波的现象，并且细胞内出现钙超载的现象(细胞荧光图像呈现白色)。通过测量得到的Kd值结合荧光强度-浓度换算公式可准确地测量细胞内[Ca^2 ]i。结论 荧光定量法结合共聚焦显微成像技术可以简易、快捷地监测细胞内钙离子的动力学变化，不失为一种定量测量细胞内钙离子的方法。     

用于分子影像学研究的双融合报告基因表达载体的构建及功能验证

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和人转铁蛋白受体(TfR)双融合报告基因表达载体,并进行功能鉴定,为活体光学/磁共振双模式成像提供实验基础.方法 将TfR基因克隆到pEGFP-C1载体,构建重组pEGFP-C1 -TfR质粒.pEGFP-C1 -TfR质粒转染293T细胞48 h后,通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况;通过RT-PCR检测TfR的表达情况;通过激光共聚焦扫描显微镜检测EGFP-TfR融合蛋白的亚细胞定位;通过Tf探针摄取和竞争实验检测EGFP-TfR融合蛋白的功能.结果 测序结果显示,EGFP-TfR基因序列正确,无突变或缺失.重组质粒转染293T细胞后,荧光显微镜下观察到EGFP的表达;RT-PCR结果显示TfR高效表达;EGFP-TfR融合蛋白主要位于细胞膜,并能够特异介导Tf的内吞.结论 EGFP-TfR双融合报告基因表达载体构建成功,并且能够高效表达发挥各自的功能,可以用于后续的活体光学/磁共振双模式成像.