葛根素通过AMPK-mTOR通路激活自噬改善大鼠激素性股骨头坏死的研究

目的 探讨葛根素通过自噬信号通路对激素性股骨头坏死早期血管内皮细胞自噬的干预作用。方法 48只雄性SD大鼠随机分成4组（每组12只）。对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共3次，间隔24h；模型组：肌肉注射甲基强的松龙，20mg/kg共3次，间隔24h。葛根素干预组：同模型组方法造模，在最后一次臀肌注射完甲基强的松龙后给予葛根素（100mg/kg?d)腹腔注射。雷帕霉素干预组：同模型组方法造模，在最后一次臀肌注射完甲基强的松龙后同时给予雷帕霉素（1.2mg/kg?d，自噬特异性激动剂)腹腔注射。造模后二周、四周后处死实验动物，取出双侧后肢的股骨头及主要供血血管。HE染色光镜下观察股骨头坏死情况；利用免疫组化法和RT-PCR方法检测Beclin1、LC3、P62、AMPK,mTOR和ULK1的mRNA与蛋白的表达；采用ELISA法检测血管内皮损伤标记物6-keto-PGF1a的表达。结果 与对照组比较，模型组大鼠骨细胞坏死加重，血管内皮细胞6-keto-PGF1a的表达增加（P<0.05），血管内皮细胞中自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1、LC3表达降低（P<0.05）、mTOR、P62表达增高（P<0.05）；与模型组比较，葛根素干预组大鼠的骨坏死程度明显改善，6-keto-PGF1a的表达降低（P<0.05），自噬相关蛋白AMPK、ULK1、Beclin1、LC3表达增高（P<0.05）、mTOR、P62表达降低（P<0.05）。结论 葛根素可能通过AMPK-mTOR-Ulk1 信号通路激活血管内皮细胞的自噬，从而减轻激素所造成的股骨头坏死。     

提高激素性股骨头坏死兔模型动物存活率的实验研究

目的 应用内毒素脂多糖(LPS)联合甲基强的松龙(MPS)建立兔股骨头坏死模型,探讨提高兔存活率的方法.方法 将64只新西兰大白兔随机等分为4组:模型组(A组)、庆大霉素组(B组)、庆大霉素+泮托拉唑组(C组)和对照组(D组),每组各16只.A组、B组和C组兔建立股骨头坏死模型:单次经耳缘静脉注射LPS(10 μg/kg);24 h后于臀肌注射MPS(20 mg/kg),共3次,注射间隔24h.D组臀肌注射同等剂量的生理盐水作为对照.B组和C组于最后1次注射MPS后连续7d以4×104 U/d臀肌注射庆大霉素注射液,C组同时连续7d以40 mg/d臀肌注射泮托拉唑注射液.结果 造模期间A组、B组和C组分别有8只、5只和2只动物死亡,A、B组动物死亡原因主要为呕吐、腹泻、消化道出血等,C组动物死亡原因不明.4组动物的死亡数量差异有统计学意义(P＜0.05);最后一次注射MPS 6周后,3组动物存活率分别为50.0％、68.6％、87.5％.实验期间D组未出现动物死亡.A组、B组和C组存活下来的动物经组织病理学观察均显示造模成功.结论 在建立兔激素性股骨头坏死模型期间的同时,应用庆大霉素预防感染和泮托拉唑护胃,可以显著提高实验动物的存活率.     

新生鼠缺氧缺血性脑损伤后自噬水平变化及其与细胞凋亡的关系

目的研究新生鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后自噬水平的变化规律，通过对Caspase-3的检测探讨自噬水平变化对细胞凋亡的影响。方法将实验动物分为假手术组、模型组、3．甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组，采用Rice法建立HIBD模型-3．甲基腺嘌呤组及雷帕霉素组于造模后0．5h腹腔注射3．甲基腺嘌呤及雷帕霉素。应用免疫组织荧光化学法检测损伤侧大脑海马及皮层组织自噬相关蛋白Beclin1的表达，Western—blot法检测Beclin1表达变化规律，免疫组织化学法检测各组Caspase-3的表达。结果免疫组织荧光化学检测结果显示，缺氧缺血性脑损伤后能激活自噬现象发生。Western．blot检测结果显示，HIBD后2hBeclin1蛋白表达开始增加，24h达到高峰，持续到168h。免疫组织化学检测结果显示，3-甲基腺嘌呤组时间点Caspase-3阳性表达显著升高，雷帕霉素组Caspase-3阳性表达显著下降。结论新生大鼠HIBD模型能激活自噬现象发生，自噬水平增高可抑制细胞凋亡，自噬水平降低可增加细胞凋亡。     

CircRNA YAP1对股骨头微血管内皮细胞血管生成的作用研究

目的:探讨环状RNA(circRNA)YAP1对激素性股骨头坏死(SONFH)大鼠股骨头微血管内皮细胞(MVECs)血管生成的作用与机制。方法:成年雄性SD大鼠接受甲基强的松龙(MPS,20mg·kg^-1·d^-1肌肉注射3周，以诱导SONFH模型(n=30只)。Ctrl组(n=30只)注射等量生理盐水。用micro-CT扫描和HE染色评估是否造模成功。分离大鼠的股骨头MVECs。并用CD31蛋白作为标志物用免疫荧光化学法(IF)鉴定股骨头MVECs。将MVECs分为过表达circRNA YAP1组(pcDNA-YAP1组)、阴性对照组(pcDNA-NC组)、以及pcDNA-YAP1联合Wnt1/β-catenin通路拮抗剂dickkopf-1处理组(pcDNA-YAP1+dickkopf-1组)。用qPCR检测circRNA YAP1表达，Western blot法分别检测Wnt1、β-catenin、VEGF-A和vimentin的表达。用CCK-8实验检测各组细胞的增殖活性。Transwell小室检测细胞的迁移率。管形成实验检测细胞的血管...     

葛根素对人脐静脉内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、IL-6及NO含量的影响

目的观察葛根素对人脐静脉内皮细胞(HUVE)细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)及一氧化氮(NO)含量的影响。方法选择HUVE,探寻葛根素抑制HUVE细胞生长的最佳浓度。随机分为正常组、模型组、葛根素组、雷帕霉素组,其中模型组用终浓度为5U/L的凝血酶为刺激物,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞法检测HUVE细胞周期分布情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HUVE细胞IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表达;硝酸还原酶法检测HUVENO的表达。结果 1×10-2mol/L浓度的葛根素对由凝血酶刺激的HUVE生长有明显的抑制作用(P0.01)。与模型组比较,葛根素组可抑制由凝血酶刺激导致的血管内皮细胞S期和G2期时相(P0.05),使IL-6、MCP-1、VCAM-1表达水平明显下降(P0.05),而ICAM-1无明显变化(P0.05)。与模型组比较,葛根素组HUVE上清液NO含量明显升高(P0.01)。结论葛根素组可抑制由凝血酶刺激导致的血管内皮细胞分裂增殖,主要表现为抑制内皮细胞S期和G2期时相,其主要机制可能是通过提高上清液中NO含量,抑制内皮细胞释放VCAM-1、MCP-1及IL-6而发挥作用。     

基于mTOR/ULK1/ATG13通路探讨绞股蓝总苷对抑郁症大鼠海马神经元过度自噬的保护作用

目的：探讨绞股蓝总苷(Gyp)对抑郁症大鼠海马神经元自噬及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(ATG13)通路的影响。方法：取SD大鼠，随机分为正常对照组、模型组、Gyp低(25 mg/kg)剂量组、高(100 mg/kg)剂量组、自噬激活剂-雷帕霉素(Rap)组(1 mg/kg)、Gyp+Rap组(100 mg/kg+1 mg/kg),每组10只。用慢性轻度不可预见性应激法制备大鼠抑郁模型，各组连续给药4周，1次/天。用旷场、糖水偏好及强迫游泳试验评估大鼠抑郁样行为，取海马组织，透射电镜观察海马神经元结构变化及自噬小体、自噬溶酶体形成情况；TUNEL法检测神经元凋亡状况；免疫组织化学染色法检测ULK1磷酸化水平(p-ULK1)及p-ATG13在海马组织中阳性表达水平；Western blotting检测总mTOR、p-mTOR、核糖体S6蛋白(S6)及p-S6、ULK1特定位点Ser757蛋白(ULK1 Ser757)及p-ULKl Ser757、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)蛋白、凋亡相关蛋白-半胱天冬酶-3(Casp...     

雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响

目的探讨雷帕霉素对人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及可能机制。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分组后给予雷帕霉素常规剂量(1.5mg/kg.d-1)、低剂量(0.15mg/kg.d-1)、高剂量(4.5mg/kg.d-1)腹腔注射,对照组给予相同体积生理盐水。用药21d后处死动物,称量鼠重、瘤重,计算抑瘤率;CD34标记血管内皮细胞后行肿瘤微血管密度(MVD)计数;ELISA法检测血清中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平。结果与对照组比较,常规剂量雷帕霉素明显抑制了肿瘤生长,并降低了肿瘤MVD及血清VEGF水平(P<0.05),低剂量、高剂量组皮下移植瘤、MVD、VEGF水平均受到一定程度抑制,但是无统计学意义(P>0.05),实验中还发现高剂量组裸鼠体重明显下降(P<0.05)。结论常规剂量雷帕霉素可抑制肿瘤血管生成,从而抑制肿瘤生长,这为肝癌肝移植术后免疫抑制剂选择提供实验依据。     

激素合并内毒素诱导大鼠股骨头坏死扫描电镜观察

目的以扫描电镜观察大鼠激素合并内毒素诱导股骨头缺血性坏死模型病理变化，为实验和临床研究提供标准化动物模型。方法雄性SD大鼠8只，尾静脉注射大肠埃希氏杆菌脂多糖（LPS，Lipopolysaccharide）10μg/kg（wt）一次，肌肉注射甲基强的松龙20mg／kg（wt）三次。另2只为空白对照。6周后处死，取股骨头，扫描电镜观察。结果造模大鼠股骨头表面失去小丘样结构，不光滑并有塌陷，呈蜂窝状改变。结论糖皮质激素合并内毒素可诱导出大鼠股骨头坏死早期病理变化。     

兔激素性股骨头坏死造模中的致死因素与干预分析

目的:探讨单纯糖皮质激素诱导建立兔股骨头坏死动物模型中的致死因素与干预思路,以优化造模方式。方法:新西兰大白兔40只随机分为四组,A组为单纯激素注射组,每周2次肌肉注射醋酸泼尼松龙,每次8mg/kg,连续6周;B组为激素+青霉素注射组,在A组基础上每周2次肌肉注射青霉素钠4万U/只;C组为激素+青霉素+雷尼替丁注射组,在B组基础上每周2次肌肉注射雷尼替丁25mg/只;D组为空白对照组,肌肉注射生理盐水5mL。观察各组一般形态学、死亡率、组织病理学。结果:A、B、C组均造模成功,其中C组生存状况最好,体重减轻最少。三组动物死亡率分别是50%、30%、10%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:单一激素醋酸泼尼松龙可以成功诱导兔激素性股骨头坏死动物模型,通过预防性应用抗生素与制酸剂,可以显著减少模型动物死亡率。     

葛根素调节PINK1/parkin信号通路对横纹肌溶解致大鼠急性肾损伤的影响

目的 探讨葛根素是否可通过调节PTEN诱导激酶1/帕金森病相关基因(PINK1/parkin)信号通路影响横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠线粒体自噬。方法 将60只SPF级成年雄性SD大鼠分为正常组(等量生理盐水)、模型组(50%甘油10 mL/kg)、葛根素低剂量组(葛根素50 mg/kg)、葛根素中剂量组(葛根素100 mg/kg)、葛根素高剂量组(葛根素200 mg/kg)、3-MA组(腹腔注射3-MA 15 mg/kg),每组10只。3-MA组灌胃葛根素200 mg/kg同时腹腔注射15 mg/kg自噬抑制剂3-MA,各给药组连续灌胃给药7 d后,除正常组外其余各组大鼠在双侧后肢肌肉一次性注射50%甘油10 mL/kg,建立横纹肌溶解诱导的急性肾损伤大鼠模型。血清生化分析血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)和肌酐磷酸激酶(CK)水平;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)水平;HE染色法观察大鼠肾组织病理变化;试剂盒法测量大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平;透射...     

激素性股骨头坏死动物模型的诱导及观察

目的：通过马血清、激素联合作用于实验家兔，制备典型骨坏死动物模型，进一步探究激素性股骨头坏死的发病机理。方法：选新西兰白兔60只，随机分成4组。A组：20只，经静脉2次单纯注射马血清每次10ml/kg，间隔3周；B组：15只，连续3日腹腔内注射甲基强的松龙每日45mg/kg；C组：20只，先静脉2次注射马血清每次10ml/kg，间隔2周。第2次注射马血清后2周，连续3日腹腔内注射甲基强的松龙每日45mg/kg；D组：5只，对照组。分别于最后1次给药后1、2、3、5、7周处死取材。标本常规组织病理学检查，并进行动脉墨汁灌注观察。结果：在马血清和激素协同作用的C组中，股骨头内小动脉损害严重，血栓形成广泛，轮骨下灌注血管数量减少明显，共有74％的标本发生骨坏死。结论：激素性股骨头坏死是一个复杂的病理生理过程，是由多因素共同作用的结果。     

鸡激素性股骨头缺血性坏死实验模型的建立

目前,尚缺乏理想的激素性股骨头缺血性坏死实验动物模型,鸡与人的双下肢负重类似,我们通过大剂量应用激素,观察股骨头组织学变化,建立了鸡激素性股骨头缺血性坏死实验模型。 实验用成年英国罗斯鸡,雌性,23个月龄,1.91±0.17kg。对照组5只鸡;激素组15只鸡,胸肌注射甲基氢化泼尼松琥珀酸钠(4.2mg/kg),每周1次。为防感染,两组均肌肉注射青霉素每周3次,4万u/次;肌肉注射链霉素,每周2次,100mg/次。对照组于用药后6、8、12、14及18周;激素组于用药后6、     

活血化瘀法对激素性股骨头缺血坏死血液流变学的影响

为探讨活血化瘀法对激素性股骨头缺血性坏死模兔的血液流变学的影响,采用每周2次臀肌注射7.5mg/kg醋酸氢化泼尼松的方法,建立激素性股骨头缺血性坏死模型,喂服活血化瘀中药,进行血液流变学指标的测定。结果造模动物全血低切粘度、全血高切粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数等均明显上升,而治疗组上述改变明显减轻。说明血流变异常是激素性股骨头缺血坏死的重要原因之一,活血化瘀中药可对抗激素的作用。     

兔超早期激素性股骨头坏死的病理和影像学对比研究

目的研究兔超早期激素性股骨头坏死病理及影像学表现,以探索超早期诊断方法。材料和方法42只新西兰大耳白兔随机分戍两组：实验组28只,于臀肌注射甲基泼尼松龙20mg／kg,共3次,每次间隔24小时。对照组14只,于实验组相同时间点用同样方法注射等量生理盐水。在造模后第2、3、4、5、6、7、8周分别对实验组随机4只勉、对照组随机2只兔进行DR、CT、MRI检查及病理学观察。结暴所有动物股骨头DR、cT、常规MRI检查及大体病理均无异常改变;实验组造模3周后股骨头磁共振成像sTIR序列开始出现点片状高信号。造模后2周开始实验组股骨头出现异常病理改变,主要表现为空骨陷窝增多,骨髓脂肪细胞肥大,血窦出血。结论通过肌肉注射激素制作兔超早期股骨头坏死模型操作简单,成功率高;磁共振成像sTIR序列是超早期诊断股骨头坏死的敏感检查方法。     

大鼠移植心脏组织中p27kip1表达及雷帕霉素的干预效应

目的:研究大鼠移植心脏冠状血管组织中p27kip1的表达情况以及雷帕霉素对其表达的影响.方法:取近交系Wistar大鼠16只做供体,SD大鼠16只作受体建立异系腹腔内心脏移植模型,随机分为环孢霉素组(n=8)和雷帕霉素组(n=8).环孢霉素组术后给予环孢霉素A 10 mg/kg·d-1皮下注射,雷帕霉素组术后给予雷帕霉素1.25 mg/kg·d-1灌胃.同系移植组 (n=8)取16只Wistar大鼠作供、受体行心脏移植,未行抗免疫排斥治疗.移植60 d后取移植心脏血管组织采用Van Gieson染色观察血管狭窄程度,用免疫组织化学染色(S-P)法检测p27kip1的表达情况.结果:雷帕霉素组较环孢霉素组血管狭窄程度明显减轻.p27kip1在正常心脏和同系移植组均为阳性表达(阳性率100%).在环孢霉素组和雷帕霉素组阳性表达率分别为62.5%、100%,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05).在各移植组中,p27kip1的表达情况与移植心脏血管狭窄程度之间呈负相关(rs=-0.541,P=0.007 5).结论:雷帕霉素可提高移植大鼠心脏血管组织中p27kip1的表达水平.     

急性肺损伤中性粒细胞凋亡异常及甲基强的松龙调控的研究

目的 探讨急性肺损伤时支气管肺泡灌洗液(BALF)中的中性粒细胞(PMN)凋亡发生规律及甲基强地松龙调控关系.方法 豚鼠30只,分为3组1组生理盐水正常对照组,2组油酸致病组,3组油酸+甲基强的松龙组.组2、组3分别由尾静脉注射油酸(0.12 mL/kg)造成豚鼠急性肺损伤模型.组1则注入生理盐水.油酸+甲基强的松龙组在实验造模前2 d由腹腔注射甲基强地松龙0.10 mg/kg体质量,1次/d.组1、组2、组3分别于注射后2 h用生理盐水进行全肺支气管肺灌洗,收集BALF.用梯度密度法离心收集PMN.用原位末端标记法检测BALF中PMN凋亡.结果 油酸致病组、油酸+甲基强的松龙组和正常对照组BALF中PMN凋亡百分比分别是(2.500±1.080)%、(4.200±1.033)%和(6.400±1.505)%.油酸致病组、油酸+甲强龙组较正常对照组BALF中PMN凋亡均显著降低(均P＜0.01).结论 急性肺损伤炎性细胞PMN凋亡延迟,PMN持续激活和释放毒性内容物与肺损伤有密切关系.甲基强地松龙能调控干预急性肺损伤时PMN凋亡延迟.     

兔股骨头坏死模型的血管内皮生长因子和Bcl-2的表达

目的：研究兔激素相关性股骨头坏死股骨头内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和抑制凋亡基因（Bcl-2）表达的动态变化特点。方法：健康雄性新西兰兔30只,随机分为实验组20只和对照组10只,实验组经耳缘静脉注射10μg/kg的脂多糖二次,再肌肉注射地塞米松25 mg/kg三次,对照组注射同等剂量的生理盐水,在造模至第4、8、12周后,处死动物,通过免疫组化、实时定量荧光PCR法检测不同时间点VEGFmRNA和Bcl-2mRNA表达。结果：在造模至第4、8、12周时,股骨头内VEGF和Bcl-2基因的表达免疫组化结果均为阴性;股骨头内VEGF和Bcl-2基因的表达随着时间推移各组表达量逐渐降低,与对照组差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：在地塞米松联合脂多糖建立的股骨头坏死模型中,股骨头内的VEGF和Bcl-2基因表达均受抑制。     

葛根素和丹参酮ⅡA组分配伍对糖尿病肾病大鼠肾组织P27~(kip1)蛋白的调控作用

目的探讨葛根素、丹参酮ⅡA组分配伍对糖尿病肾病大鼠p27kip1表达的影响,为中医药治疗糖尿病肾病提供实验依据。方法单次腹腔注射链脲佐菌素(65 mg/kg)建立糖尿病肾病大鼠模型,实验分为对照组、模型组、葛根素低、高剂量组(50 mg/kg,200 mg/kg)、丹参酮ⅡA低、高剂量组(10 mg/kg,40 mg/kg)、葛根素+丹参酮ⅡA低、高剂量组(葛根素50 mg/kg+丹参酮ⅡA 10 mg/kg,葛根素200 mg/kg+丹参酮ⅡA 40 mg/kg),8周末处死大鼠,测定血糖、24 h尿量及24 h尿蛋白,通过RT-PCR和Western blot法检测各组大鼠肾组织p27kip1mRNA及蛋白的表达。结果葛根素+丹参酮ⅡA高剂量组可明显降低糖尿病肾病大鼠血糖,减少尿量,减轻尿蛋白排泄,抑制糖尿病肾病大鼠肾组织P27~(kip1)蛋白表达(P0.05,P0.01),且优于其他各组。结论葛根素和丹参酮ⅡA组分配伍具有抗糖尿病肾病的作用,其机制可能是通过下调糖尿病肾病大鼠肾组织p27kip1的表达实现的。     

低分子肝素钙预防激素性股骨头坏死的实验研究

目的研究低分子肝素钙对激素性股骨头坏死预防作用及对血栓形成的影响。方法健康Wistar大鼠15只,随机分为A组5只,臀肌注射地塞米松磷酸钠15mg/kg每周1次;B组5只,臀肌注射地塞米松磷酸钠15mg/kg每周1次,皮下注射低分子肝素钙2000u/kg,1次/d;C组5只为空白对照组。6周后取双侧股骨头,观察外观后脱钙做切片,行HE染色计算空骨陷窝率、观察骨小梁面积,用磷钨酸苏木素染色观察血栓。结果三组股骨头外观无明显差别;三组空骨陷窝率差别有统计学意义（P〈0.05）;磷钨酸苏木素染色观察可见A组有血栓形成;三组骨小梁面积比差别有统计学意义（P〈0.05）。结论 B组通过预防血栓的形成使激素性股骨头坏死的发生率明显低于A组,皮下注射低分子肝素钙是预防激素性股骨头坏死的途径之一,但不能预防骨质疏松的发生。     

雷帕霉素对非酒精性脂肪性肝病大鼠的影响

目的 探讨雷帕霉素对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠的治疗效果及作用机制。方法 选用24只清洁级SD雄性大鼠,体重180～220 g,随机选取8只作为正常组,喂普通饲料。剩余16只喂高糖高脂饲料构建NAFLD模型,6周末造模成功后按随机数字表法将其分为模型组、雷帕霉素组,每组8只。雷帕霉素组用2.8 mg/（kg·d）雷帕霉素灌胃,正常组和模型组等量生理盐水灌胃,持续给药4周。实验结束后,采用苏木精-伊红染色及油红O染色观察各组肝组织的病理变化。检测并比较各组血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平及肝组织TC、TG水平。检测并比较各组肝组织自噬相关蛋白（Beclin1、ATG5）、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、泛素结合蛋白p62表达水平。结果 正常组肝细胞形态未见明显异常,模型组肝组织苏木精-伊红染色可见大多数肝细胞内有大小不等的脂肪空泡,油红O染色可见大多数肝细胞内含有脂质被染成橘红色。雷帕霉素组肝组织苏木精-伊红染色及油红O染色可见脂肪空泡...