大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的 原核表达大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10,并对其进行鉴定。方法 从大鼠脾细胞中提取RNA,用RT-PCR方法得到IP-10cDNA,双酶切将其插入pET-32a（＋）载体中。重组质粒pET-32a（＋）-IP-10经酶切、PCR及测序鉴定后转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。结果 所获得的大鼠IP-10克隆,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS-PAGE和Westem blot分析获得证实。结论 已成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-IP-10,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL(BLCAP)SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32(a)中,从而构建原核表达重组质粒pET-32(a)-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni2 亲和层析纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32(a)-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

HMGN2抗菌结构域的研究

目的：本室从人外周血单个核白细胞分离获得一个新的抗菌多肽。其氮端氨基酸序列与人HMGN2相同。本研究HMGN2的抗菌谱和其功能结构域。方法：OMIGA蛋白结构软件分析HMGN2的二维结构。合成HMGN2氮端和碳端肽片段和α-螺旋结构域。检测各合成肽片段的抗菌活性。同时构建HMGN2全肽和α-螺旋结构域编码基因原核表达载体及制备其大肠杆菌重组表达产品。检测重组全肽和α-螺旋结构域的抗菌活性。结果：0MIGA蛋白结构软件分析发现HMGN2含1个从其氨基酸序列第17位到47位的跨膜α-螺旋结构域。     

ctB和ureⅠ双基因融合表达及其免疫特性分析

目的：构建霍乱毒素B亚单位（CtB）和幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（UreⅠ）融合的原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,并初步研究融合蛋白Ct B/Ure Ⅰ的表达特性和免疫特性.方法：PCR从pUC18 ctB中克隆ctB基因,定向在pET32a（＋）/ureⅠ的ureⅠ基因5＇端插入ctB基因,构建ctB和ure Ⅰ双基因原核表达质粒pET32a（＋）ctB/ure Ⅰ,转该质粒于E.coli BL-21（DE3）,经酶切和序列分析鉴定工程菌.IPTG诱导表达,HP-His亲和层析纯化,SDS-PAGE和Gel-Pro Analizer4分析,重组蛋白免疫BALB/c小鼠.用Western blot和ELISA分析重组蛋白的免疫特性.结果：工程菌含完整的ctB和ure Ⅰ基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%.在22℃,1 mmol/L IPTG诱导4 h后,重组蛋白的表达占菌体总蛋白12%,亲和层析纯化后蛋白纯度为94.3%.Western blot表明重组蛋白分别能与相应的抗体反应,该蛋白免疫小鼠后能产生相应的IgG抗体.结论：成功构建了能表达CtB/Ure Ⅰ蛋白的大肠杆菌表达菌株.对融合蛋白表达和纯化后,初步证明了该重组蛋白有CtB和Ure Ⅰ的双特异反应原性和免疫原性,为研究新型幽门螺杆菌疫苗奠定了坚实的基础.     

Nanog基因的原核表达及抗体制备

目的:在大肠杆菌中表达Nanog融合蛋白,制备兔抗小鼠Nanog融合蛋白抗体。方法:从含小鼠Nanog基因的pNA992质粒中扩增出小鼠Nanog基因并插入pET-32a中构建pET-32a-Nanog重组表达载体,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,得到了Nanog融合蛋白,并经Histrap亲和层析柱纯化后,将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫细胞化学染色检测抗体特异性。结果:成功地构建了重组表达载体pET-32a-Nanog,经诱导获得了大量Nanog融合蛋白,其主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达到97%,经免疫的兔抗血清效价可达1∶32 000,并表现出较好的特异性。结论:成功地制备出高滴度、高特异性的兔抗Nanog融合蛋白抗体。     

结核分枝杆菌毒力分泌基因Rv3872重组卡介苗的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv3872的原核重组表达质粒pET-3872并对其进行表达及鉴定。构建表达结核分枝杆菌抗原蛋白Rv3872即PE35的重组卡介苗。方法:应用PCR技术扩增Rv3872基因,定向克隆入pET32a(+)并转化E.coli BL21(DE3)菌株,测序后用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测及鉴定。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。构建重组穿梭表达质粒pMV-3872,将重组质粒电穿孔进入卡介苗,对重组卡介苗进行诱导表达用SDS-PAGE和Western blot检测和鉴定目的蛋白。结果:表达融合蛋白的pET-3872质粒构建成功,重组蛋白经Western blot检测出特异性阳性信号。重组卡介苗BCG-3872构建成功,热诱导表达后经SDS-PAGE和Western blot,在培养上清中检测到目的蛋白。结论:成功构建了重组质粒pET32a(+),并在大肠杆菌中表达了PE35蛋白,有利于进一步研究Rv3872基因功能。本研究还对表达结核分枝杆菌蛋白PE35的重组卡介苗进行了鉴定,为进一步研究该重组卡介苗的免疫功能奠定了基础。     

人单核细胞系THP-1中HMGN2的分离纯化及其抗菌活性

 目的 从人单核细胞株THP-1中分离与纯化HMGN2抗菌肽,应用微量琼脂糖弥散法检测抗菌活性,以探讨HMGN2分子的抗菌作用。方法 采用HPLC分离纯化, 琼脂糖弥散法筛选纯化有抗菌活性的组分,用Tricine-SDS-PAGE电泳初步测定其分子质量,以质谱法进行分子质量的精确分析。结果 从人THP-1细胞中分离纯化出HMGN2抗菌肽, 琼脂糖弥散法检测显示其对大肠杆菌氨苄青霉素耐药株ML-35p有较强的抑菌活性,对大肠杆菌标准株ATCC25922和临床分离株54080亦有较强的抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌ATCC25923未检测出抗菌活性。结论：HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

人单核细胞株THP-1中HMGN2的分离纯化

目的:从人单核细胞株THP-1中分离与纯化HMGN2抗菌肽,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法:采用HPLC分离纯化,琼脂糖弥散法筛选纯化组分的抗菌活性,对活性组分进行Tricine-SDS-PAGE电泳初步测定分子量。结果:从人THP-1细胞中分离纯化出的HMGN2抗菌肽,对致病性大肠杆菌54080有抗菌活性。结论:HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

HMGN2: a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocytes?

Leukocytes are a central cellular element of innate-immune defense in mammals. In addition to the generation of toxic oxygen radicals and nitric oxide, leukocytes express and secrete a broad array of antimicrobial proteins and peptides. In the study, an antimicrobial polypeptide was isolated and purified from human peripheral blood mononuclear leukocytes in the presence of interleukin (IL)-2. Microsequencing provided that its N-terminal amino sequence was PKRKAEGDAK, which was identical to high mobility group nucleosomal-binding domain 2 (HMGN2). Mass spectrometric value and Western blot also indicated its individual character of HMGN2. The antimicrobial assays showed that the Escherichia coli-based production of HMGN2 had a potent antimicrobial activity against E. coli ML-35p, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, and to some extent, against Candida albicans ATCC 10231. The HMGN2 alpha-helical domain had the same antimicrobial activity as HMGN2. The immunocytochemistry staining, enzyme-linked immunosorbent assay, and Western blot revealed that HMGN2 was present in the cytoplasm of mononuclear leukocytes and released to the extracellular environment when stimulated with IL-2. These results suggest that HMGN2 would be a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocyte.     

HMGN2分离制备及其趋化性研究

目的:建立分离天然HMGN2的方法并研究其抗菌性与对中性粒细胞的趋化活性。方法:5%高氯酸对子宫纤维囊腺瘤组织进行萃取,萃取物通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)直接进行分离,Tricine-SDS-PAGE,AU-PAGE和Western-Blot对蛋白分子进行鉴定,采用Transwell实验检测HMGN2对中性粒细胞的趋化性。结果:分离出高纯度的HMGN2,HMGN2对大肠杆菌有杀菌活性但HMGN2在体外不能趋化中性粒细胞运动。结论:建立简单、直接分离高纯度的天然HMGN2的方法,有助于对其进一步研究,我们发现HMGN2对大肠杆菌有杀菌活性但它不能通过趋化中性粒细胞发挥作用。     

带标签的高迁移率蛋白N2(HMGN2)重组质粒用于亚细胞定位分析

为进行HMGN2的亚细胞定位分析,提取人LAK细胞总RNA,设计合成相应引物,应用RT-PCR从其总RNA中扩增HMGN2cDNA,以pcDNA3.1-myc-his和pEGFP-N1为载体,成功构建出HMGN2真核表达载体,转染HeLa细胞,转染效率达70%~80%,用抗六组氨酸臂的单克隆抗体经免疫细胞化学染色显示经pcDNA3.1-myc-his-HMGN2转染的HeLa细胞除细胞核外,胞浆亦明显着色,未转染的Hela细胞无论细胞核还是细胞浆均显阴性;用兔抗人HMGN2多克隆抗体进行的免疫细胞化学染色显示转染的HeLa细胞与用抗六组氨酸臂的单克隆抗体检测结果相同,而未转染的Hela细胞核内和胞浆也均有着色。用两种抗体行ELISA分析在细胞培养上清亦检测到HMGN2。激光共聚焦显微镜下观察pEGFP-N1-HMGN2转染的HeLa细胞发现绿色荧光主要在核内,但核外也同样存在。本实验结果证明HMGN2不仅存在于细胞核中,而且分布于细胞浆,亦可分泌到细胞外。     

小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2构建及体内干扰效果鉴定

目的:构建小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2,以进一步明确HMGN2的生物学作用。方法:将HMGN2-shRNA片段退火后与小鼠psilence-cmv-4.1链接,饲养孕小鼠,尾静脉注射法导入shRNA表达质粒,提取8.5d胚胎RNA,用RT-PCR检测胎HMGN2的表达量进行鉴定。结果:测序结果显示psilence-cmv-4.1-HMGN2干扰质粒构建成功,RT-PCR结果显示HMGN2在8.5d胎儿表达较高广泛表达,且Psilencer-cmv-4.1-HMGN2尾静脉注射后有明显的抑制效果。结论:成功构建对8.5d胎鼠HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4.1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

Antimicrobial functionalized genetically engineered spider silk

Genetically engineered fusion proteins offer potential as multifunctional biomaterials for medical use. Fusion or chimeric proteins can be formed using recombinant DNA technology by combining nucleotide sequences encoding different peptides or proteins that are otherwise not found together in nature. In the present study, three new fusion proteins were designed, cloned and expressed and assessed for function, by combining the consensus sequence of dragline spider silk with three different antimicrobial peptides. The human antimicrobial peptides human neutrophil defensin 2 (HNP-2), human neutrophil defensins 4 (HNP-4) and hepcidin were fused to spider silk through bioengineering. The spider silk domain maintained its self-assembly features, a key aspect of these new polymeric protein biomaterials, allowing the formation of β-sheets to lock in structures via physical interactions without the need for chemical cross-linking. These new functional silk proteins were assessed for antimicrobial activity against Gram - Escherichia coli and Gram + Staphylococcus aureus and microbicidal activity was demonstrated. Dynamic light scattering was used to assess protein aggregation to clarify the antimicrobial patterns observed. Attenuated-total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) and circular dichroism (CD) were used to assess the secondary structure of the new recombinant proteins. In vitro cell studies with a human osteosarcoma cell line (SaOs-2) demonstrated the compatibility of these new proteins with mammalian cells.     

HMGN2基因干扰质粒构建及干扰效率测定

目的：构建HMGN2基因的干扰质粒,为深入研究HMGN2基因在信号通路中的作用提供有效手段。方法：根据文献选择两个HMGN2基因的干扰位点,合成两个干扰片段定向克隆到psilencer-4．1的干扰载体并测序验证。将干扰质粒转染至A549细胞,并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT—PCR产物检测结果显示干扰质粒psilencer-4．1-HMGN2—2干扰效率最高,其HMGN2表达量降低了70％左右。结论：成功构建了对HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4．1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。