PCR产物液相杂交检测的优化

目的 为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速。方法 通过改进杂交液的成分,选择最佳的探针浓度,使5＇端标记生物素的PCR扩增产物与5＇端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃ 10 s冷却到37℃ 10 s即完成杂交。杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果 液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300 ml·L~(-1),探针浓度为0.5μmol·L~(-1),杂交温度为37℃。对60～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×10~4copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100％(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBe(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6％(22/28);HBsAg(+)、抗HBe(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7％(16/24),其余为阴性。结论 该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用。     

PCR杂交梳法在HBV检测中的应用

聚合酶链反应（PCR）以其灵敏性高、特异性强的特点,近年来正广泛应用于乙型肝炎病毒（HBV）感染的研究和诊断。然而,实践证明,PCR影响结果的因素很多,这主要是由于过去PCR产物分析的手段较落后。如琼脂糖凝胶电泳（即一次PCR）的方法只能判断产物的大小,并不能鉴别产物的特异性,因此不可避免地会出现一些难以判别的非特异产物[1],而造成人为主观因素导致的误差,出现假阳性和重复性差等现象。另外,在实际应用中PCR大约只可以将约103个模板DNA分子扩增出来[2、3],而不是理论上的只要具有一个拷贝的模板就可以被反应系统扩…     

竞争PCR及其产物酶联杂交定量检测HBV DNA

目的 研究竞争性PCR及其产物酶联杂交定量检测法价值。方法 竞争性PCR对HBV基因进行扩增，并引入微反应板酶联杂交技术对扩增产物定量分析。结果 检测HBV DNA灵敏度、特异性及定量分析精确度均十分理想。结论 该法值得推广应用。     

PCR杂交梳法与细菌培养法检测淋球菌的对比研究

当今性传播疾病在我国日趋流行,其中尤以淋病的发病率最高,约占60－70％1,而淋病的确诊主要依靠实验室检查,目前主要使用淋球菌分离培养方法,虽然淋球菌的分离培养并不困难,但细菌的生长易受各种条件影响,且对慢性淋病患者的检出率较低,同时其生化鉴定复杂和需时较久,达不到快速检测的目的。近年来分子生物学技术的发展,也使PCR技术能应用于淋菌的检测2,我们曾采用PCR电泳法检测淋球菌,虽说快速敏感,但假阳性率偏高,特异性似乎不足3。近来我们采用PCR杂交技术即杂交梳方法检测淋球菌（NG）4,并与细菌培…     

PCR与半定量分子杂交法检测骨髓移植受者巨细胞病毒病

ＰＣＲ与半定量分子杂交法检测骨髓移植受者巨细胞病毒病杨晓林，王申五，郭乃榄，陆道培，王虹，孙继红，毛滕淑巨细胞病毒病（ＣＭＶＤｉｓｅａｓｅ）包括ＣＭＶ肺炎，肝炎，肠炎，肾炎等是爱滋病和器官移植受者等免疫低下人群最严重的感染并发症之一，病死率可达８０％...     

PCR微孔板杂交法检测TTV DNA影响因素探讨

1997年底日本学者利用代表性差异分析法首先发现ＴＴＶ[1],1998年我国周育森、周伯平、孟庆华等[2～4]用巢式ＰＣＲ证实我国存在ＴＴＶ。我们根据Ｏｋａｍｏｔｏ[5]报道的ＴＴＶ基因全序列设计引物和探针,建立了ＰＣＲ微孔板杂交法检测ＴＴＶＤＮＡ。本文对该法影响因素进行探讨。1　材料和方法11　血清标本　取10份ＴＴＶＤＮＡ阳性血清混合作阳性对照,取10份ＴＴＶＤＮＡ阴性献血员血清混合作阴性对照。12　方法　将血清标本中的ＴＴＶＤＮＡ抽提后经ＰＣＲ扩增,扩增产物变性后,加入到包被有链霉亲合素的微孔板中,产物中的生物素与微孔板…     

样品不同处理对PCR—微孔板杂交法检测TTVDNA的影响

自 1997年底日本学者Ｎｉｓｈｉｚａｗａ等[1] 报道从输血后肝炎病人血清中分离出ＴＴＶ以来 ,不少学者做了大量有关ＴＴＶ的检测工作。目前国内外用ＰＣＲ方法检测ＴＴＶ的报告较多 ,但不同实验室检测的结果存在较大差异 ,可能与其检测方法特别是样品处理方法不同有关。我们比较了 8种常规的ＤＮＡ抽提方法 ,并建立了适合于ＰＣＲ 微孔板杂交法检测ＴＴＶＤＮＡ的标本处理方法。1　材料和方法1 1　血清标本　取 10份ＴＴＶＤＮＡ阳性血清混合后 ,以混合的正常血清 10倍系列稀释。1 2　样品处理方法　①直接稀释法 :分别用ＰＢＳ(ｐＨ 7 2 )…     

液相杂交检测B细胞淋巴瘤细胞系miR-28的表达

microRNA（miRNA）是一组在进化上高度保守、非编码蛋白、参与转录后调节的小分子RNA（19-25核苷酸）。为了进一步明确miRNA的加工机制及功能和定量研究miRNA的表达水平，应用液相杂交和Northern blot两种方法检测miR-28在B细胞淋巴瘤细胞系中的表达并进行了比较。结果表明：液相杂交和Northern blot检测miR-28均显出阳性结果，但液相杂交所用的细胞总RNA量（5μg）明显少于Northern blot（30μg），液相杂交的条带信号也较Northern blot的强。结论：液相杂交是一种较Northern blot更为快速、简便和敏感的检测miR-28的方法。     

PCR扩增产物的量化检测技术

随着分子生物学的日益发展与普及,PCR产物的定量检测受到广泛重视。本文将近年国外报道PCR扩增产物的量化检测技术的某些方法的原理、特点等作简要的介绍。并着重介绍杂交酶免疫测定法的优点及其广阔的应用前景。     

PCR-反向微孔板杂交法检测医学真菌初步应用

目的通过建立PCR-反向微孔板杂交法鉴定临床常见的致病真菌,为临床治疗提供可靠依据。方法应用通用引物对真菌ERG11基因的保守序列进行扩增,扩增片段包被于微孔板中,再将真菌特异性引物与之杂交,经漂洗后显色,读取450nm处吸光度值判断结果。结果8种真菌特异性探针不与其他种的真菌、细菌和人类DNA分子杂交,而只和其对应的真菌DNA扩增产物反应,呈现阳性杂交结果。55例临床血液病、肿瘤等患者的血液、脑脊液及痰等标本分别用PCR一反向微孔板杂交法和真菌培养法（API20C）鉴定,2种方法的结果基本一致（阳性率分别为34．5％和30．9％）。结论PCR-反向微孔板杂交法可用于临床不同标本致病真菌的检测。     

双重PCR快速检测百日咳杆菌

目的:以百日咳毒素S1亚基启动子ptxA-Pr基因和插入序列IS481为目的基因,建立敏感、特异的双重PCR快速检测百日咳杆菌方法.方法:运用百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因序列特异性引物,采用双重PCR技术同时扩增百日咳杆茵的特异性基因ptxA-Pr和IS481.通过构建目的质粒获得阳性对照,测序并与GenBank比对序列验证扩增产物.百日咳标准茵株DNA 10倍系列稀释为模板.采用此方法扩增双基因,检测此方法敏感性.扩增肺炎克雷伯茵、肺炎链球茵、铜绿假单胞茵、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及阳性样本DNA,检测此方法特异性.结果:百日咳杆菌标准株和阳性样本均能同时扩增ptxA-Pr和IS481目标序列,分别为191、145 bp.构建质粒后测序结果与GenBank对比一致.每个反应体系能检测到的标准菌株核酸最小量为1.65×10<'-2>ng.其他菌株检测未出现非特异性扩增.结论:双重PCR扩增百日咳杆菌ptxA-Pr和IS481基因的方法可用采特异快速的检测百日咳杆菌.     

快速反相杂交法检测HBV DNA

为建立一种简便快速的核酸探针杂交法检测 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中的 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ,将 Ｐ Ｃ Ｒ 上游引物用生物素标记后进行扩增;核酸探针固定于硝酸纤维素膜上,与带有生物素的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交,杂交信号用链霉亲和素 酶结合物显色检测。结果表明,该法检测的敏感性为 ５ ｆｇ,杂交时间为４０ 分钟。２００ 例临床标本检测的阳性率（２７５％ ）高于琼脂糖电泳法（２４５％ ）。同时具有操作简便的特点,可作为 Ｐ Ｃ Ｒ扩增产物中 Ｈ Ｂ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 的常规检测方法。     

A LightCycler real-time PCR hybridization probe assay for detecting food-borne thermophilic Campylobacter

In a previous study, we reported the performance of a PCR assay amplifying 287-bp of the 16S rRNA gene of thermo-tolerant Campylobacter (C. jejuni, C. lari, C. coli) through an international ring-trial involving 12 participating laboratories. Based on the validated set of primers, a LightCycler real-time PCR assay (LC-PCR), which used fluorescent hybridization probes was developed. The test incorporated an internal amplification control co-amplified with the 16S rRNA gene of Campylobacter to monitor potential PCR inhibitors and ensure successful amplifications. The specificity study involving 39 Campylobacter and nine strains of other species indicated that the LC-PCR test was highly specific, giving cross-reactivity with only one strain of C. upsaliensis (CCUG19559). The sensitivity of the LC-PCR assay, evaluated in 32 spiked poultry-rinse or pork carcass-swab samples, was determined at 10CFU/ml carcass-rinse. The prevalence of samples positive for thermo-tolerant Campylobacter was 58.8% in 68 naturally contaminated poultry rinse samples tested by LC-PCR and the data were in good concordance with those of bacteriological method. The Ct values of the three replicates obtained for each sample tested in three different runs demonstrate that the LC-PCR was highly reproducible and afford a powerful tool for rapid detection of the thermo-tolerant Campylobacter strains.     

Rapid, non-separation electrochemiluminescent DNA hybridization assays for PCR products, using 3′-labelled oligonucleotide probes

Described are rapid assays for the analysis of PCR products in a one step, non-separation assay based on the use of electrochemiluminescence generated from a tris-bipyridine ruthenium (II) label. The assay uses PCR incorporation of a biotinylated oligonucleotide as a primer, with the inclusion of a labelled oligonucleotide. Oligonucleotides were labelled with an N-hydroxy succinimide ester of tris-bipyridine ruthenium (II) dihexafluorophosphate (Origen ^®-label) by modifying the 3′ and 3′ 5′ ends of the oligonucleotide probes. The assay makes use of the inherent thermal stability and absence of polymerase activity on such probes to allow the PCR and probe hybridization to be completed automatically on the thermocycler. The assay is concluded by the addition of PCR samples to streptavidin beads on an electrochemiluminescence analyser for binding and analysis. Target genes evaluated were the HIV-1 gag gene, and cystic fibrosis ΔF-508 deletion mutation. The results obtained from these assays demonstrated the detection of 10 copies of the HIV-1 gag gene, and cystic fibrosis ΔF-508 mutation in 1 ng of human DNA within 15 min. This assay format allows a rapid and simple determination of specific amplified DNA sequences, reducing the contamination risks due to washes and multiple pipetting.     

Development and application of a TaqMan-based real-time PCR assay for specifically detecting feline astrovirus

Feline astrovirus (FeAstV), an enteric RNA virus of recent concern that is associated with diarrheal illness in cats, has been described in several countries throughout the world. However, no scientific and sensitive diagnostic method against FeAstV was reported up to now. Here, we developed a specific, sensitive and repeatable TaqMan fluorescence quantitative PCR (qPCR) assay to investigate the prevalence of FeAstV in domestic cats from China, especially low copy numbers in clinical sample. Specific assay showed that no cross-reactivity was observed with other non-FeAstV cat-derivied pathogens, suggesting this method was highly specific for FeAstV. The lowest detection limit of this assay was 3.52 copies/μl, and 1000-times more sensitive than conventional PCR. Intra- and inter-assay variability was less than 1.72%, means a high degree of repeatability. A total of 578 clinical fecal samples were collected from northeast China, and were tested for FeAstV using our developed qPCR assay. 105 samples were positive for FeAstV with an overall prevalence of 18.17%. Moreover, a higher positive rate was found in cats with diarrhea (32.26%, 80/248) than that in asymptomatic cats (7.58%, 25/330), further demonstrating that FeAstV infection was associated with diarrhea in cats. In brief, our developed assay showed high specificity, sensitivity, reproducibility for detecting FeAstV, and can be used for clinical diagnosis and epidemiological investigation of FeAstV.     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

高效液相色谱法和酶法检测糖化血红蛋白结果的比对分析

目的：为了实现实验室间糖化血红蛋白（HbA1c）结果的互认;为了流行病学调查的研究,探讨高效液相色谱法（HPLC）和酶法测 HbA1c 结果的一致性。方法参考 NCCLS 文件,使用 HPLC 的全自动糖化血红蛋白仪为比较方法,Bayer ADVIA 2400全自动生化分析仪采用酶法测定 HbA1c 作为实验方法,对检测结果进行比对分析。结果 HPLC 法线性范围为5．10％～11．55％,酶法线性范围为3．5％～14．5％。按测定值高低分为三组, HPLC 法的批内变异系数（CV）分别为3．28％、3．55％、2．79％,批间 CV 分别为3．31％、3．67％、2．84％。酶法的批内 CV 分别为2．66％、2．67％、2．34％,酶法的批间 CV 分别2．89％、3．01％、2．40％。以 HPLC 法结果为参比,酶法结果偏低,差异有统计学意义（P ＜0．01）。Y ＝1．0074X -0．0929,r 2＝0．9962,两者相关性较好。结论酶法与HPLC 法具有良好的相关性,酶法精密度更高,线性范围更宽。适用于各种类型的生化分析仪,适用于流行病学的研究,方便快捷,具有很大的市场前景。     

液相杂交技术在聚合酶链反应酶联免疫检测的应用

目的采用液相杂交技术,简化核酸杂交过程,建立乙肝病毒（HBV）的液相杂交的聚合酶链反应-酶联免疫检测（PCR-ELISA）方法。方法将5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针呈液相混合,90℃2min,55℃1min杂交。杂交后产物被链霉亲和素酶标板固定,经酶标记抗地高辛标记抗体结合、显色。结果液相杂交酶联免疫检测条件优化探针浓度3pmol/次,酶标记抗体稀释度1∶1000。液相杂交时间3min,固相杂交时间120min,但其检测结果无明显差别。检测灵敏度1×10