淫羊藿甙对成骨细胞凋亡的影响

目的 通过研究淫羊藿甙对体外培养的成骨细胞凋亡的影响,探讨淫羊藿甙防治骨质疏松的可能机制.方法 采用酶消化法和机械分离法获得新生SD大鼠成骨细胞,取第四代细胞随机分为,雌二醇组(1×10-8 mmol/l),淫羊藿甙低剂量组(1 ng/ml),中剂量组(10 ng/ml),高剂量组(100 ng/ml)对照组,经药物处理48 h后,用TUNEL和扫描电镜的方法检测成骨细胞的凋亡.结果 与对照组相比较,淫羊藿甙各剂量组的凋亡指数均下降(P<0.05),其中淫羊藿甙中剂量组的凋亡指数下降明显,差异有高度统计学意义(P<0.01);扫描电镜显示淫羊霍甙各组的凋亡细胞较对照组减少,尤以淫羊霍甙中剂量组最少.结论 淫羊藿甙可以通过抑制成骨细胞的凋亡,促进骨形成,减少骨吸收,从而发挥抗骨质疏松的作用.     

淫羊藿甙促成骨细胞分化的分子机制研究

【立论依据】 骨质疏松症是以骨量减少和骨的微观结构退化为特征,导致骨的脆性增加以致易于发生骨折的一种全身性代谢性骨病。骨质疏松严重威胁人类健康,且发病率呈逐年上升趋势,目前全世界约有2亿多骨质疏松症患者。目前临床上治疗骨质疏松的化学合成药物存在毒性大、价格昂贵等问题,而天然中草药及其制剂则可以克服上述缺点。淫羊藿(Herba Epimdii)是目前临床上治疗骨质疏松的常用中药,已有研究显示其主要成分淫羊藿甙(Icariine, ICA)具有促成骨分化功能,但具体机制不详。microRNA (miRNA)是一类长度约为20~25 nt、在基因转录后水平发挥调控作用的小分子非编码RNA,它几乎参与生物所有的生理病理过程。作为重要的生物调节分子,miRNA是否参与了ICA促成骨分化过程呢?关于ICA促成骨分化的分子机制的研究,可以为临床上提高淫羊藿治疗骨质疏松的效果提供理论和实验依据。 【设计思路】 首先确定ICA促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量,然后进行差异miRNAs筛选并选取部分差异miRNAs进行验证,最后挑选miR-27a进行深入研究。 【实验内容】 (1)ICA处理时间和剂量的确定:用MTT、real-time PCR确定ICA促MC3T3-E1分化的合适的时间和剂量。(2)差异miRNAs的筛选:将5 μM ICA处理48 h 的MC3T3-E1 RNA及对照进行miRNA测序和分析。(3)差异miRNAs的验证:挑选15个差异miRNAs用Real-time PCR进行验证(已完成),并从中挑选miR-27a进行深入研究。(4)miR-27a在ICA促成骨分化中的作用及机制:① miR-27a靶基因的预测:运用miRWalk在线工具预测miR-27a的靶基因。② Osterix是miR-27a靶基因的验证:A. 构建含有Osterix 3'UTR以及miR-27a结合位点突变的荧光素酶报告质粒;B. 将miR-27a的mimic或对照和构建的荧光素酶报告质粒共转染HEK 293 T细胞,检测并比较荧光素酶活性;C. 将miR-27a的mimic或对照转染MC3T3-E1细胞,确定miR-27a对Osterix mRNA和蛋白表达的影响。③ miR-27a在ICA促成骨分化中的作用:将miR-27a的mimic、inhibitor和对照分别转染MC3T3-E1细胞,再用ICA处理,然后分别用Real-time PCR和碱性磷酸酶染色确定miR-27a在ICA促成骨细胞分化中的作用。 【材料】 HEK 293-T、MC3T3-E1细胞;pGL3-promoter荧光素酶报告基因载体、Real-time PCR用引物及试剂,蛋白质印迹用试剂及抗体;碱性磷酸酶染色用试剂。 【可行性】 我们具备本课题实施所需要的研究材料包括试剂和仪器;课题设计所用的方法均为指导教师课题组常用的方法;本课题已顺利实施,我们目前已完成了ICA处理时间和剂量的确定、差异miRNAs的筛选和鉴定、miR-27a靶基因的预测。以上实验的实施和结果的获得表明本课题在理论和技术上均可行。 【创新性】 (1)首次证明miRNAs参与ICA促成骨细胞分化过程;(2)首次证明miR-27a 在ICA促成骨细胞分化中起重要作用。研究结果将进一步阐明ICA促成骨细胞分化的分子机制,从而为提高淫羊藿的临床治疗效果提供理论和实验依据。     

淫羊藿甙对大鼠成骨细胞分泌细胞因子的影响

目的观察不同浓度的淫羊藿甙对成骨细胞分泌的IL-6、TGF-β、TNF-αmRNA表达的影响,以17β-雌二醇作为阳性对照比较淫羊藿甙与雌激素对于细胞因子表达影响的差异。方法体外培养新生SD大鼠颅盖骨分离的成骨细胞,加入不同浓度的淫羊藿甙及17β-雌二醇,用RT-PCR测定的IL6、TGF-βα1、TNF-αmRNA的表达水平的变化。结果10μg／ml淫羊藿甙和三个浓度的17β-E2都能够促进TGF-β1 mRNA的表达,抑制IL-6和TNF-αmRNA的表达。5μg／ml的淫羊藿甙能够促进TGF-β1mRNA的表达并抑制IL-6 mRNA的表达。但对于TNF-α mRNA表达没有抑制作用。其中三个浓度的17β-E2组和淫羊藿甙组之间对于IL-6和TNF-αmRNA表达的影响没有显著性差别,而10-8mol／L17β-E2对TGF-β1 mRNA表达的影响作用最强。结论淫羊藿甙治疗骨质疏松的部分机理可能与抑制IL6、TNF-α mRNA的表达和促进TGF-β1 mRNA的表达有关。     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。     

淫羊藿甙对大鼠成骨细胞功能及Osterix表达的影响

目的观察淫羊藿甙对体外培养成骨细胞功能及Osterix（Osx）表达的影响,探讨淫羊藿抗骨质疏松的作用机制。方法分别用酶消化法获得新生SD大鼠成骨细胞,在培养液中分别加入不同浓度的淫羊藿甙,观察成骨细胞的增殖功能和分化功能。用RT—PCR法测定成骨细胞OsxmRNA表达。结果增殖率测定淫羊藿甙从1ng／ml起光密度值均较对照组增加,且呈剂量依赖关系。但仅有浓度为100ng／ml时差异才有显著意义（P〈0．01）;碱性磷酸酶活性从1ng／ml起均较对照组增加,也呈剂量依赖关系,且浓度≥10ng／ml差异有显著意义;1ng／ml,10ng／ml,100ng／ml淫羊藿甙均可促进OsxmRNA表达（P〈0,05）,以10ng／ml组作用最显著。结论淫羊藿甙能通过影响成骨细胞增殖、分化、提高成骨细胞Osx基因表达水平,从而促进骨形成,发挥抗骨质疏松的作用。     

淫羊藿苷通过激活Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的:观察淫羊藿苷骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中的促进作用及其对Notch信号通路的影响。方法:通过对BMSCs细胞进行体外分离培养,将细胞分为对照组与给药组,给药组加入0.1mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1淫羊藿苷分别培养3 d、7 d、10 d、14 d、21 d,测定细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,确定最佳给药剂量。将细胞分为3组,对照组、骨分化诱导组、骨分化诱导+淫羊藿苷处理组(联合组),培育7~21 d后测定ALP阳性染色率,Western blot法检测不同处理后Notch信号通路中Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达情况,RT-PCR法检测淫羊藿苷对Hes1、Runx2 mRNA的影响。结果:与对照组比较,0.1~1.0 mg·L-1淫羊藿苷处理后ALP活性升高较明显,7~14 d内活性均逐渐升高,14 d时活性达到最大值,其中0.4 mg·L-1处理活性最高。因此,选择淫羊藿苷最佳处理质量浓度为0.4 mg·L-1。对照组、联合组在细胞培养7~14 d间,ALP活性逐渐升高,14~21 d活性逐渐下降,第21天ALP活性维持较低水平;诱导组在培养期间ALP活性持续维持较高水平。第7天、第14天,与对照组比较,诱导组、联合组ALP活性升高,且诱导组升高程度高于联合组,差异有统计学意义(P0.05)。第21天,联合组ALP活性高于对照组、诱导组,差异有统计学意义(P0.05)。诱导组、联合组ALP阳性染色率均高于对照组,且联合组高于诱导组,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,联合组、诱导组Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达量均升高,联合组蛋白表达量明显高于诱导组。RT-PCR结果显示诱导组Hesl、Runx2 mRNA表达量均高于对照组,联合组Hesl、Runx2 mRNA表达量高于诱导组。结论:淫羊藿苷能够促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并通过上调Hesl、Runx2 mRNA表达以及增加Noth1、CBF1、Jagged-1蛋白表达来实现。     

HPLC法测定复方淫羊藿颗粒剂中淫羊藿甙的含量

采用高效液相色谱法以甲醇－水（５５：４５）为流动相，色谱柱为ＯＤＳＣ＿(１８)，检测波长为２７０ｎｍ，测定复方淫羊藿颗粒剂中淫羊藿成含量，结果表明在２１．４～１０μｇ·ｍ￣(－１)浓度范围内线性关系良好，ｒ＝０．９９９８，加样回收率：９８．７２％。     

淫羊藿对骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化以及FN表达的影响

目的 研究中药淫羊藿对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stroma cells,MSCs)向成骨细胞方向分化以及对纤维连接蛋白(FN)表达的影响,探讨其促成骨作用的分子机制.方法 分别用淫羊藿含药血清和地塞米松干预诱导体外培养的骨髓间充质干细胞,即分为淫羊藿组(M组)、地塞米松组(D组)和阴性对照组(C组),分别于诱导培养的第2、5、8天对细胞进行Giemsa染色和FN免疫细胞化学染色,于诱导培养的第8天对细胞进行矿化结节染色.结果 ①随着培养天数的增加,M组和D组细胞中有大量的立方形和多角形细胞形成,C组细胞以梭形为主;②随着培养天数的增加,三组细胞的FN表达均呈现先下降后上升的趋势,但M组和D组FN上升的速率较C组快;③M组和D组均有大量矿化结节形成.结论 淫羊藿具有促进MSCs向成骨细胞分化的能力.淫羊藿在骨髓MSCs向成骨细胞分化早期,对FN的表达具有一定的抑制作用,之后可能具有促进作用,提示FN可能是淫羊藿促成骨细胞分化作用后期的辅助因子.     

不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响

目的：观察不同浓度淫羊藿苷对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化及功能的影响。方法：利用酶消化法从新生小鼠颅盖骨中分离和培养成骨细胞;用组织化学染色和矿化结节法进行细胞鉴定;用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测不同淫羊藿苷浓度对大鼠成骨细胞的增殖、分化作用;同时通过检测成骨细胞碱性磷酸酶的活性,以观察淫羊藿苷对成骨细胞功能的影响。结果：与各浓度组比较,10μg/L淫羊藿苷对成骨细胞的生长增殖、分化均有促进作用,且作用最强,最为持久。结论：浓度为10μg/L的淫羊藿苷能显著促进成骨细胞增殖,并增强其成骨活性。     

用高效液相色谱法测定淫羊藿中淫羊藿甙的含量

淫羊藿是一种常用中药,其有效成分淫羊藿甙的测定,药典方法步骤繁多,费时,且方法准确性、重现性都较难以保证。为此,建立了一种测定淫羊藿中淫羊藿甙含量的高效液相色谱法(HPLC),并测定了贵州产淫羊藿中淫羊藿甙的含量,方法简单、快速、可靠。     

四种含淫羊藿中成药中淫羊藿甙的含量测定

本文采用高效液相色谱法测定了四种中成药中淫羊藿甙的含量。以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，柱温３０℃；甲醇－０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠水溶液（磷酸调ｐＨ＝２．７）（５７：４３）为流动相，１ｍｌ／ｍｉｎ；检测波长为２６８ｎｍ，淫羊藿甙色谱峰形对称、分离度好。所测补肾强身片、龟龄集、壮骨关节丸和前列宁冲剂中淫羊藿甙的含量分别为０．１０５％，０．０９９５％，０．０５６６％，０．３１３％。     

淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展

淫羊藿是抗骨质疏松症中运用较多的中药。近年来,淫羊藿在抗骨质疏松方面的研究,无论从实验还是临床方面都取得了显著的成就。实验研究发现,淫羊藿不但可以促进体外成骨细胞增殖、分化,促进成骨作用;还可通过作用于成骨细胞相关基因的转录和信号通路的转导来影响成骨细胞的活性,为研制新型抗骨质疏松药物提供了前景。     

淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的影响

目的：观察淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞的作用。方法：取新生1－3d SD大鼠头盖骨用酶消化法分离成骨细胞。第3代细胞经MTT法、茜素红染色法观察淫羊藿总黄酮对体外培养成骨细胞增殖、矿化结节形成的影响。结果：淫羊藿总黄酮1－10μg/ml浓度具有显著的促进成骨细胞增殖及提高矿化结节形成数量的作用。结论：淫羊藿总黄酮具有促进体外成骨细胞增殖及分化成熟的作用。     

淫羊藿甙对诱导假体松动的骨吸收因子的影响

目的观察淫羊藿甙对关节磨屑刺激单核细胞分泌IL-1β、IL-6、PGE2、TNF的影响。方法分离培养兔外周血单核细胞,分成4组。D组为关节磨屑组:培养细胞中加入体积比为0.1%的Ti微粒。A、B、C组分别在D组的基础上加入10mg/mL、1mg/mL、0.1mg/mL的淫羊藿甙。用放射免疫测定法测量各上清液中PGE2及TNF含量;用酶联免疫吸附试验测定各上清中IL-1β及IL-6含量。结果与D组比较,A、B、C三组各检测指标均明显下降(P0.01),且与药物浓度呈负相关。结论淫羊藿甙可以降低假体周围炎性细胞因子的含量,从而防治假体松动的产生。     

淫羊藿苷对股骨骨折MSCs迁移及免疫功能影响

目的探讨淫羊藿苷对股骨骨折间充质干细胞(MSCs)迁移及免疫功能的影响。方法选取SPF级健康雄性SD大鼠96只,随机分为对照组16只及造模组80只。造模组通过截断股骨干中段建立股骨骨折模型,对照组予以假手术。将造模成功的大鼠随机分为模型组、骨肽组及淫羊藿苷低、中、高浓度组,各16只。模型组及对照组分别给予0.9%氯化钠注射液5 mL·kg~(-1),日1次,腹腔注射;骨肽组给予复方骨肽注射液5 mL·kg~(-1),日1次,腹腔注射;淫羊藿苷低、中、高浓度组分别给予8、16、24 mg·mL~(-1)的淫羊藿苷溶液5 mL·kg~(-1),日1次,腹腔注射。各组大鼠均给药4周。检测比较各组骨折愈合Garrett评分、股骨骨体积(BV)、样本体积(TV)、骨体积分数(BVF)、MSCs迁移能力,以及外周血T淋巴细胞水平。结果与模型组比较,各组大鼠骨折愈合Garrett评分较高,股骨BV、TV、BVF较高,骨折端MSCs迁移能力较高,外周血CD_4~+T淋巴细胞、CD_4~+/CD_8~+比值较高,且淫羊藿苷低浓度组淫羊藿苷中浓度组、骨肽组淫羊藿苷高浓度组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论淫羊藿苷能有效促进股骨骨折大鼠骨折愈合,其作用可能与提高MSCs迁移能力及细胞免疫功能有关,且药物浓度越高作用越好。     

淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路对卵巢癌细胞CAOV3增殖的影响

目的 研究淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖。方法 通过四甲基偶氮唑盐(MTT)实验选择适当的淫羊藿苷浓度并探讨其对卵巢癌细胞CAOV3生长、增殖的影响,倒置显微镜观察细胞形态学变化,采用荧光实时定量PCR(RT-PCR)法检测β-catenin及Wnt信号通路靶基因c-myc和cyclinD1 mRNA的表达水平,利用Western blot法检测β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表达水平。结果 MTT结果显示,淫羊藿苷能显著抑制CAOV3的生长增殖;倒置显微镜下发现淫羊藿苷能使CAOV3细胞形态发生明显变化;RT-PCR检测结果表明淫羊藿苷可降低β-catenin的mRNA的表达以及抑制Wnt信号通路靶基因c-myc和cyclinD1 mRNA的表达;Western blot法检测结果表明淫羊藿苷可下调β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表达。结论 淫羊藿苷可以抑制人卵巢癌细胞CAOV3增殖,其机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来实现的。     

淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响

本实验根据小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力对巨噬细胞产生白细胞介素－１（ＩＬ－１）和肿瘤坏死因子的能力进行活测定。观察了淫羊藿甙对小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响。