大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定

目的:建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs具有多项分化潜能。     

Wistar大鼠骨髓间充质干细胞的原代培养和鉴定

目的 探讨大鼠骨髓来源的间充质干细胞的培养和鉴定方法,为其功能研究奠定基础.方法 采用全骨髓贴壁法进行骨髓来源的间充质干细胞的原代培养,通过酶消化法进行人工纯化,通过形态学观察、细胞周期测定及其自然分化实验进行鉴定.结果 获得纯化的大鼠骨髓来源的间充质干细胞,该细胞呈长梭形或多角形,大小不等,生长密集,排列呈流线型.结...     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定及成脂诱导

目的分离、体外培养、鉴定兔的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及诱导分化为脂肪细胞.方法采用健康幼龄日本大耳白兔,麻醉致死后冲洗骨髓收集骨髓液,采用直接贴壁法分离培养MSCs,对MSCs进行形态学观察,同时通过流式细胞分析术对CD34、CD44、CD45、CD90 4种表面抗原进行鉴定.取第5代MSCs,加入50μmol/L抗坏血酸盐2磷酸盐,50μmol/L消炎痛和0.5μmol/L地塞米松诱导其分化.结果第2代MSCs经流式细胞技术鉴定出细胞的CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、CD90(+)符合MSCs的表面抗原.第5代骨髓间充质干细胞,成脂诱导10 d后油红O染色显示有大量脂质沉积并相互融合,细胞由长梭形变为多边形.结论本研究证实了体外培养的细胞为间充质干细胞且成分单一,具有干细胞特性,能分化为脂肪细胞,可作为一个细胞资源,为组织工程和动物模型研究细胞分化机制.     

离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞2 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d[]形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.ossa染色可见矿化结节.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.     

不同培养方法对小鼠脂肪干细胞成骨分化的影响

目的??比较组织块贴壁法及胶原酶消化法所得脂肪干细胞的成骨分化能力。方法??分别采用组织块 贴壁法及胶原酶消化法原代培养小鼠脂肪干细胞, 观察细胞形态及细胞增殖情况, 并进行细胞鉴定, 比较两者成 骨分化能力。结果??两种方法所得脂肪干细胞在形态学上无差异,培养至第 3 代,细胞生长状态良好,生物学特 性稳定, CD44、Sca-1 表达率 >90%, CD31 表达率 <10%, 具有较好的成脂、成骨分化能力 ; 组织块贴壁法培养 所得脂肪干细胞增殖率高于胶原酶消化法（ P <0.05） ; 组织块贴壁法培养所得脂肪干细胞矿化结节、ALP 活 性及钙离子浓度高于胶原酶消化法（ P <0.05） 。结论??组织块贴壁法相对胶原酶消化法在脂肪干细胞培养及成 骨诱导分化过程中更具优势。     

全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

[目的]研究全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,及获取的MSCs的生物学特性.[方法]用全骨髓接种和贴壁培养法获取、纯化、扩增Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞.倒置相差显微镜动态观察培养细胞的生长、形态、排列变化.取第3代MSCs,用台盼蓝拒染法检测细胞的活力,Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖能力并绘制生长曲线图,用成骨和成脂诱导分化实验检测MSCs的多向分化能力.[结果]骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性,通过换液、传代的方法可去除悬浮细胞和纯化细胞,传代细胞生长快于原代细胞.MSCs呈长梭形或多角形,胞体上有不规则突起.排列成漩涡状或鱼群状.全骨髓接种培养法获取的MSCs高表达骨髓间充质干细胞表型(CD29、CD44),造血细胞标记(CD45、CD11b)表达率低,细胞活力好、凋亡率低,具有较强的增殖能力及成骨、成脂分化能力.[结论]全骨髓接种加贴壁法培养MSCs方法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好,且具备多向分化能力的骨髓间充质干细胞.     

人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养方法的改进

目的：对人骨髓间充质干细胞(Mesenchvmal stem cells，MSCs)的体外分离纯化、培养扩增方法的改进，为MSCs的进一步诱导分化和应用奠定基础方法：抽取人骨髓细胞，采用密度梯度离心结合贴壁培养法进行分离纯化，并传代扩增，测定生长曲线和贴壁率，形态学观察，流式细胞仪检测其表面抗原表达。结果：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，MSCs在含胎牛血清的L—DMEM培养液中生长性状相对稳定，细胞基本呈成纤维细胞样生长，1、3、5代细胞生长曲线、贴壁率基本相同，贴壁存活率高，表达CD29、CD44、CD105、CD166。结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化人骨髓MSCs，在含胎牛血清的L-DMFM培养液中，细胞稳定扩增。     

小鼠肺间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的建立稳定的小鼠肺间充质干细胞分离、培养、鉴定技术,利用小鼠肺间充质干细胞研究肺组织修复和再生机制。方法无菌分离小鼠肺,采用胶原酶消化和组织贴壁法分离培养肺间充质干细胞,观察细胞形态和生长特性,流式分析细胞表面标记,进行体外成脂、成骨诱导分化。结果两种方法都成功分离培养了肺间充质干细胞,流式分析显示Sca-1、CD90、CD29、CDCD44均为高表达,CD31、CD45均为低表达。体外诱导后,肺间充质干细胞可以分化成脂肪细胞和成骨细胞。结论本研究利用两种方法分离培养小鼠肺间充质干细胞,两种分离方法获得的细胞均具有间充质干细胞类似的表面标记物,具有成脂、成骨分化能力。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的：观察兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长特性及潜在分化潜能,为组织工程中种子细胞选择提供实验基础。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs,相差显微镜下观察其生长特点,应用流式细胞术对第三代细胞进行表面抗原鉴定。经成脂和成骨诱导液体外诱导兔BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞分化,对诱导2周后的细胞进行油红O染色、茜素红染色、Van-kossa银染染色及碱性磷酸酶染色。结果：经流式细胞术鉴定,全骨髓贴壁法可获得兔BMSCs,第三代兔BMSCs生物特征基本一致并能诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞,成脂诱导后油红O染色细胞内出现红色脂滴,成骨诱导后茜素红染色、Vankossa银染均可观察到矿化结节。碱性磷酸酶活性染色对照组呈弱阳性,诱导组呈强阳性。结论：全骨髓贴壁法是分离培养兔BM-SCs简便可行的方法。BMSCs来源丰富并有成脂及成骨潜能,是组织工程的优良种子细胞。     

骨髓间充质干细胞的体外培养

目的建立骨髓问充质干细胞（MSCs）体外分离纯化的方法，探索MSCs体外培养的最佳方法，为细胞工程学提供细胞来源。方法①MSCs的分离、培养：在无茵条件下取3．4周龄Wistar雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞，采用裂解红细胞后的贴壁培养法分离MSCs，利用MSCs与其他贴壁细胞的贴壁差异性，严格控制传代时酶的量和消化时间，传代纯化MSCs；②MSCs的鉴定：取第4代（n）MSCs，用免疫荧光染色的方法检测MSCs的表面抗原CD44、CIM5和CDg0。结果①采用裂解红细胞分离骨髓细胞得到的骨髓单个核细胞形态较多样，分布不均，含杂细胞多，随挟液和传代次数增多，细胞纯度提高，n后细胞形态一致，分布均匀，几乎不见杂细胞；②免疫荧光染色结果显示：P4代MSCs经加入一抗、二抗及荧光染料后见CD44、CD90染色呈阳性，CIM5染色呈阴性反应。结论采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离、纯化MSCs，可得到活性和纯度均较好的MSCs。     

人外周血间充质干细胞向肝样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨人外周血来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离、培养及诱导分化成有功能肝样细胞的可行性.方法 静脉采集13例成人外周血,分别应用单纯密度梯度离心法及人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法分离MSCs;将得到的MSCs经贴壁纯化扩增,以流式细胞仪检测细胞表面抗原后,经肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及抑瘤素M(OSM)诱导分化成肝样细胞;以RT-PCR、免疫荧光染色及Western blot检测所得细胞中白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)在基因及蛋白水平上的表达情况;电镜检测所得细胞的超微结构.结果 外周血应用单纯密度梯度离心法无法培养得到MSCs.人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法可分离并培养获得梭形细胞,经细胞表面抗原检测证实为MSCs;所得细胞经过纯化扩增和诱导分化后,RT-PCR、免疫荧光及Western blot均证实细胞在基因及蛋白水平上存在ALB和AFP的表达;电镜证实其具有类肝细胞的超微结构.结论 人外周血中存在MSCs并可使用非侵袭性的人间充质干细胞富集试剂+密度梯度离心两步法方法提取分离,所得MSCs具诱导分化成有功能肝样细胞的能力,此方法能够为以后的肝组织工程研究提供种子细胞来源.     

骨髓间充质干细胞体外培养及肝向分化方案的优化

目的优化一套简便、可靠、稳定的大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定及肝向分化的方案。方法采用全骨髓差速贴
壁法分离提取大鼠骨髓间充质干细胞,通过优化的1.5 h差速贴壁结合12 h首次全量换液方法,及体外改良培养方案实现细胞
高效纯化扩增。流式细胞术表面标志物检测结合成脂、成骨、成软骨诱导分化鉴定细胞群。采用添加bFGF、HGF、EGF等多种
生长因子的三步诱导法促使骨髓间充质干细胞向肝系分化,并进行形态学、免疫学、基因水平评估。结果分离纯化的细胞群阳
性表达CD29、CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45,经成脂、成骨、成软骨诱导液作用后,油红O、茜素红、甲苯胺蓝染色均呈阳
性。经三步法肝向诱导处理后,细胞群呈肝样细胞形态改变,表达肝脏特异性标志物ALB、AFP,肝系相关基因表达水平呈时间
依赖性逐渐上升。结论优化后的方案能够简便、可靠、稳定地获得高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,并能在特定微环境作用下
实现肝向分化。
     

人骨髓基质干细胞体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外分离、纯化培养人骨髓基质干细胞(hBMSCs),对其表面标志物、多向分化特性进行鉴定,为骨组织工程提供理想的种子细胞来源.方法 抽取健康成人骨髓,采用全骨髓培养法,多次消化以纯化hBMSCs;应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测;采用成骨、成软骨和成脂培养基进行三向诱导分化.结果 培养的第3代细胞表面抗原检测显示:表达CD106、CD166和CD29,不表达造血和内皮标志CD34、CD45和CD145在体外分别诱导出其向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化.结论 hMSCs体外经分离传代培养后细胞成分较为单一,具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的基本功能特征.     

两种培养方法在猪自体骨髓间充质干细胞培养的比较研究

目的 比较应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法.方法 取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状.结果 直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高.体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强.     

5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的:研究体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(mensenchymal stem cells,MSCs) 经5-氮胞苷(5-aza) 诱导定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征?方法:SD大鼠股骨骨髓经密度梯度离心及贴壁分离培养传代MSCs,体外用5-aza定向诱导向心肌样细胞分化?相差显微镜观察心肌样细胞形态学变化?免疫组化检测肌钙蛋白T(cTnT)?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达?结果:密度梯度离心及贴壁法分离培养的MSCs生长稳定,增殖快?5-aza诱导后,部分细胞形态发生变化,有肌管样结构形成?随诱导后培养时间延长MSCs中cTnT?α-肌动蛋白和缝隙连接蛋白Cx43表达逐渐增强?结论:密度梯度离心及贴壁分离培养可获得大量纯度较高的骨髓间充质干细胞?经5-aza诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞?     

人脐带华通胶间充质干细胞的体外分离培养及鉴定

目的 研究由脐带华通胶组织(Wharton's jelly)在体外分离、培养、扩增获得脐带间充质干细胞(umbilical cord derived mesenchymal stem cells,以下简称UC MSCs)的方法,并进行UC- MSCs的各项鉴定.方法 脐带华通胶组织采用胶原酶以及胰酶序贯消化法分离得到UC-MSCs,用流式细胞仪分析其表型特征,向成骨、成脂以及成神经元细胞诱导分化并鉴定.结果 由人脐带华通胶可以有效获得间充质干细胞.原代细胞培养24～48 h内细胞开始贴壁生长,5～7 d左右可以传代培养,在2～3周时间内可以迅速扩增至107到108数量级.各项分化鉴定试验证实UC-MSCs具有多向分化潜能,能分化成骨、成脂细胞以及神经元细胞.UC-MSCs在体外培养传至20～30代仍保持稳定的细胞表面标记.结论 由人脐带华通胶可以有效地获得间充质干细胞,这种UC-MSCs能在体外长期传代培养,生物学特性稳定,具有多向分化的潜能,是今后细胞治疗很有前景的种子细胞.     

骨质颗粒分离培养间充质细胞的实验研究

目的:为探索间充质干细胞更广泛的来源。方法:选择了正常人骨髓,急性粒细胞性白血病缓解期患者骨髓、再生障碍性贫血患者骨髓、脐带血和骨质颗粒等5种标本来源。采用贴壁法和特殊的干细胞培养基/间充质干细胞刺激因子分离、纯化MSCs,观察比较不同来源MSCs的体外生长特性,流式细胞术检测培养细胞的CD105。结果:正常人骨髓、急性粒细胞性白血病缓解期患者骨髓和骨质颗粒标本均能培养出MSCs,从骨质颗粒得到的MSCs数量较多。脐带血和再生障碍性贫血患者骨髓标本没有培养出MSCs。培养的MSCs均一地表达CD105。结论:在体外培养人类正常骨髓和急性粒细胞性白血病缓解期的骨髓均可以得到MSCs,两种样本分离培养得到的MSCs在形态学、表面标志、增殖特性等方面没有显著差异。从人类骨质颗粒得到的MSCs的生长从数量上优于从骨髓中获得的MSCs。