肿瘤相关钙信号传导蛋白-2基因对人乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的 观察肿瘤相关钙信号传导蛋白-2(TROP-2)基因小干扰RNA (siRNA)对乳腺癌细胞黏附和侵袭力的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)方法检测TROP-2基因mRNA表达;筛选出TROP-2表达最高者.采用TROP4基因siRNA转染乳腺癌细胞,分别以荧光实时定量RT-PCR和免疫荧光方法观察TROP-2基因mRNA和蛋白水平,然后以噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Transwell方法检测癌细胞侵袭能力.结果 人乳腺癌Bcap-37、LCC1、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-35、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株TROP-2 mRNA分别是1.362±0.057、2.207±0.056、2.997±0.052、0.136±0.045、0.122±0.025、0.194±0.028和2.706±0.039,以MCF-7细胞最高;以TROP-2 siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞后,癌细胞TROP-2基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;黏附实验结果显示,5、10、20 nmol/L siRNA组黏附率分别为(52.9±2.5)％、(25.6±2.3)％、(12.8±2.2)％(P＜0.01);Transwell实验结果显示,5、10和20 mol/L siRNA组穿过滤膜的细胞分别为78±17、39±15、19±16,而对照组分别为136±25、139±21(P＜0.01).结论 TROP-2基因在乳腺癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染乳腺癌细胞,可抑制乳腺癌细胞黏附和侵袭能力.     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性(P＜0.001,P＜0.001).体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关(P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005).结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

siRNA干扰沉默GS基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的：利用RNA干扰技术,研究靶向Glutamine Synthetase（GS）基因的小干扰RNA（siRNA）在体外对胃癌细胞生长的影响,探索胃癌基因治疗并了解GS在胃癌发生、发展中的作用。方法：合成GSsiRNA,并用脂质体法将GSsiRNA转至胃癌BGC-823细胞中;采用实时定量PCR和Western印迹法观察GSsiRNA转染前后胃癌细胞GS基因及相应蛋白表达的变化;用CCK8、流式细胞检测技术分别检测胃癌细胞增殖及凋亡的变化。结果：转染GSsiRNA后的胃癌细胞BGC-823与对照组相比,生长明显变缓（P〈0.05）,细胞凋亡率明显增高（P〈0.05）。结论：靶向GSsiRNA可明显下调靶基因GS的表达,在体外可抑制胃癌BGC-823细胞的生长并促进其凋亡。     

RNA干扰抑制yrdC蛋白表达对人胃癌细胞株BGC-823体外增殖能力的影响

目的:构建针对人yrdC基因siRNA的重组腺病毒Ad-shyrdC并观察其转染人胃癌细胞株BGC-823后对细胞体外增殖能力的影响。方法:筛选高效抑制yrdC蛋白表达的RNAi位点,并构建表达siRNA的重组腺病毒,转染人胃癌细胞株BGC-823后以Western印迹法鉴定细胞yrdC蛋白表达的变化;同时通过MTT法、流式细胞术分别测定BGC-823细胞增殖活性和增殖指数的变化。结果:成功构建了抑制人yrdC基因siRNA的重组腺病毒Ad-shyrdC;转染BGC-823细胞后可明显抑制yrdC蛋白表达,并使所测定的细胞MTT值和细胞增殖指数提示BGC-823细胞增殖活性下降(P<0.05)。结论:腺病毒介导的RNAi能有效地抑制BGC-823细胞中yrdC蛋白表达,并降低其增殖活性。     

siRNA干扰沉默KLK12基因抑制胃癌细胞生长的研究

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,构建KLK12-siRNA表达载体,探讨其在体外对胃癌细胞生长的影响。方法合成KLK12-siRNA,以脂质体法转染至胃癌MKN-45细胞中建立稳定细胞系,并分成3组,即空白对照组、阴性对照组和KLK12siRNA组。采用实时定量PCR和Western blot方法观察KLK12siRNA转染后胃癌细胞KLK12基因和相应蛋白表达的变化;用MTT法,细胞迁移和侵袭试剂盒分别检测转染细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化。结果 KLK12siRNA组的KLK12mRNA和蛋白表达水平较两个对照组明显下调(P0.05)。KLK12基因沉默显著抑制胃癌细胞的增殖,并降低体外胃癌细胞的迁移能力。结论 KLK12-siRNA表达载体能抑制胃癌MKN-45细胞的增殖和迁移,为胃癌的基因治疗提供了有益的实验依据。     

miR-622在胃癌细胞中的表达及其功能的研究

目的 研究miR-622在胃癌细胞中的表达,探讨miR-622在胃癌中的生物学功能.方法 采用实时荧光定量PCR检测miR-622在胃癌细胞中的表达,以胃癌细胞SGC-7901和NCI-N87为模型瞬时转染miR-622寡核苷酸前体或抑制体,通过克隆形成、侵袭和划痕实验验证其在胃癌细胞中的功能.结果 荧光定量PCR实验结果表明:miR-622在胃癌细胞SGC-7901中相对表达量为1.29±0.58,而在NCI-N87细胞中相对表达量为10.96±1.02.在SGC-7901细胞中转染了miR-622 寡核苷酸前体,克隆形成率为76％.划痕试验中愈合能力为(11±7)μm,胃癌细胞侵袭能力为(732±3)个,与对照组相比差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR-622能够促进胃癌细胞克隆形成、迁移和侵袭.     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

RNA干扰沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因对结直肠癌细胞基质金属蛋白酶2和9表达的影响

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(PRL-3)基因对结直肠癌细胞侵袭的影响和可能机制.方法 应用PRL-3基凶小干扰RNA(siRNA)转染处理结直肠癌细胞系HCT116后,分别采用实时定量PCR和Western印迹检测PRL-3基因和基质金属蛋白酶家族(MMP)-2、MMP-9的mRNA和蛋白水平;分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力;其次,将转染48 h的细胞接种裸鼠,观察其在体内生长情况.结果 体外实验结果显示,PRL-3 siRNA可有效抑制结直肠癌细胞集落生长和侵袭能力,且与浓度相关(P＜0.05,P＜0.01));转染组细胞MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白水平明显下调(P＜0.05).体内实验结果显示,对照组裸鼠组织癌细胞侵袭横纹肌和血管,而转染组未见这些现象.结论 采用PRL-3siRNA转染可抑制结直肠癌细胞侵袭,其机制可能与下调MMP表达有关.     

趋化因子CXCL1通过整合素β1调控胃癌转移的机制研究

目的探讨过表达趋化因子CXCL1促进胃癌细胞迁移及相关分子机制。 方法应用胃癌细胞株（SGC-7901、BGC-823）,重组慢病毒方法构建过表达CXCL1细胞株,siRNA敲低胃癌细胞表达整合素β1（integrin β1）。Western blotting法检测CXCL1、integrin β1、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、FAK、SRC和ERK的表达,Transwell实验评估胃癌细胞的迁移能力。 结果过表达CXCL1的SGC-7901和BGC-823细胞中integrin β1表达水平高于对照细胞,siRNA干扰CXCL1表达后,胃癌细胞integrin β1表达水平下降。外源性CXCL1分别增强SGC-7901和BGC-823细胞迁移能力（2.40±0.44）倍（P=0.002）和（2.08±0.30）倍（P=0.001）。此外,CXCL1还增强FAK、SRC和ERK的磷酸化水平。integrin β1-siRNA可以阻断CXCL1所引起的SGC-7901和BGC-823细胞迁移能力增强（P<0.05）及FAK、SRC和ERK的磷酸化水平。CXCL1调控SGC-7901和BGC-823细胞的MMP-2、MMP-9表达,而敲低integrin β1后MMP-2、MMP-9表达随之下调。MMP抑制剂GM6001抑制7901-CXCL1和823-CXCL1细胞的迁移能力（P<0.05）。 结论CXCL1通过integrin β1激活FAK-SRC-ERK通路和调控MMP-2、MMP-9的表达,最终调控胃癌细胞迁移。     

RNA干扰逆转人胃癌细胞多药耐药的研究

目的：研究RNA干扰沉默多药耐药（multidrug resistance,MDR）基因对胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-Fu生长的影响。方法：构建靶向MDR1的shRNA干扰质粒转染人胃癌多药耐药细胞株BGC-823/5-FU,噻唑蓝（MTT）法检测耐药细胞对5-Fu的敏感性,实时荧光定量PCR（Real-time-PCR）检测MDR1 mRNA表达的变化,Western blot检测各组细胞P-gp表达的变化,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况。结果：与RNAi-control组和normal组相比,RNAi-MDR1组细胞干扰质粒细胞的IC50明显降低,为2.104±0.242（P〈0.05）,敏感性的相对逆转率为76.8%;MDR1 mRNA表达明显下调（P〈0.05）;P-gp的表达水平降低（P〈0.05）;凋亡率明显升高至（5.757±0.684）%。结论：应用RNA干扰有效抑制了MDR1的表达,使P-gp的表达降低,增强了BGC-823/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性,为寻找逆转胃癌细胞多药耐药有效方法奠定了基础。     

RNA干扰下调midkine基因表达对人乳腺癌细胞粘附和侵袭力的影响

目的 探讨中期因子(midkine,MK)基因siRNA对乳腺癌细胞生物学行为的影响.方法 培养人乳腺癌Bcap-37、LCCI、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468及ZR75-1细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测MK基因mRNA表达;筛选出MK表达最高者.采用MK siRNA...     

CCL22-CCR4轴在胃癌腹膜乳斑转移的机制研究

目的 探讨巨噬细胞衍生因子MDC/CCL22-CCR4反应轴在胃癌腹膜乳斑转移中的作用.方法 用RT-PCR和Western blot方法检测CCR4在5种胃癌细胞系中的表达;MTT法测定不同浓度CCL22对胃癌细胞株BGC-823增殖率的变化;Transwell小室体外侵袭实验检测CCL22对胃癌细胞株BGC-823趋化活性的影响;免疫组化检测标本中CCR4表达;单变量分析CCR4表达与胃癌临床病理参数的关系.结果 CCR4mRNA和CCR4蛋白在5种胃癌细胞系中均有表达.CCL22可以促进BGC-823细胞的增殖和趋化.CCR4在胃癌中有表达,CCR4表达水平与胃癌分化程度相关(P<0.05),而与患者的年龄、肿瘤大小、位置、分期以及淋巴结转移等均无关(P>0.05).结论 CCL22-CCR4反应轴可能在胃癌腹膜乳斑转移中起作用.CCR4可能成为预防和治疗胃癌腹膜转移的潜在靶点.     

4-1 BBL在不同分化胃癌细胞株上的表达

目的 观察共刺激分子4-1 BBL在人胃高分化腺癌细胞株MKN-28、人胃中分化腺癌细胞株SGC-7901、人胃低分化腺癌细胞株BGC-823、人胃黏液腺癌细胞株MGC-803上的表达.方法 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法检测以上4种胃癌细胞株4-1 BBL mRNA和蛋白的表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测人淋巴细胞对不同胃癌细胞的体外杀伤活性;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测人淋巴细胞与不同胃癌细胞共培养上清液中自细胞介素(IL)-2、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量.结果 RT-PCR结果示4-1 BBL mRNA表达从高到低依次为MKN-28(46.63%)、SGC-7901(37.13%)、BGC.823(20.43%)、MGC-803(14.14%).免疫细胞化学结果示4-1 BBL着色程度由深到浅依次为MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803.MTT结果示不同时段不同效靶比下人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低为MKN-28、SGC-7901、BGC-23、MGC-803.ELISA结果示不同效靶比下人淋巴细胞与胃癌细胞共培养48 h上清液中IL-2、TNF-α的含量由高到低为MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803.而IL-10的含量由高到低为MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28.结论 人胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803中4-1 BBL基因在蛋白和mRNA水平均有表达,且胃癌细胞株的分化程度越高4-1BBL表达水平越高.淋巴细胞对高表达4-1 BBL胃癌细胞株的杀伤力较高,而且4-1 BBL可能通过促进细胞因子TNF-α、IL-2和细胞抑制因子IL-10的产生调节肿瘤免疫.     

趋化因子受体CXCR4、CCR7在胃癌细胞中的表达及其与胃癌细胞侵袭能力的关系

目的 观察趋化因子受体CXCR4及CCR7在不同侵袭能力人胃癌细胞株中的差异表达.方法 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot分析CXCR4及CCR7在人胃癌细胞株MGC803、AGS、BGC823、SGC7901的表达;体外侵袭实验测定4株胃癌细胞的侵袭能力.结果 MGC803、AGS、BGC823、SGC7901中CXCR4 mRNA相对表达量分别为:1.2556±0.1384、0.7943±0.0913、0.4749±0.0744、0.2463±0.0344,CCR7 mRNA相对表达量分别为:0.6071±0.1404、0.5355±0.0750、0.2549±0.0522、0.2466±0.0342,CXCR4及CCR7蛋白表达趋势同其相对应的基因表达趋势基本一致.4株胃癌细胞侵袭实验测定的侵袭细胞数分别为:400.0±18.2、310.0±4.0、110.0±13.9、85.0±9.5.CXCR4在不同侵袭能力的胃癌细胞株中存在差异性表达(P<0.05).结论 CXCR4的表达与胃癌细胞侵袭能力成正相关,CCR7的表达与胃癌细胞侵袭能力无明显相关.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体通过促进死亡相关蛋白3表达抑制人胃癌细胞株的生长

目的：观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对人胃癌细胞株的生长抑制作用及其作用前、后人胃癌细胞株中死亡相关蛋白3（DAP3）表达情况，探讨DAP3在TRAIL抑制人胃癌细胞株生长中的作用。方法：选择不同浓度（0、50、100、200ng／m1）TRAIL作用于人胃癌细胞株BGC-823和HGC-2748h后，用酸性磷酸酶法测定各组细胞株生长抑制情况，确定TRAIL的有效浓度：取有效浓度的TRAIL处理人胃癌BGC-823和HGC-27细胞株48h后，分别用Westem印迹法和RT—PCR检测TRAIL对DAP3蛋白和DAP3mRNA表达的影响。结果：①酸性磷酸酶法测得100ng／mlTRAIL可有效抑制人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27生长。②Western印迹法未能在人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27中测得DAP3表达．而100ng／mlTRAIL处理后48h，在BGC-823和HGC-27中均可测得DAP3表达：同样．RT—PCR法测得100ng／mlTRAIL处理48h后．两株胃癌细胞株中DAP3mRNA表达显著升高。结论：TRAIL能有效抑制人胃癌细胞株BGC-823和HGC-27的生长．其机制与促进DAP3表达有关。     

circ_0009910在胃癌细胞中作用机制初步研究

目的通过检测分析胃癌细胞中circ_0009910表达,初步探讨其在胃癌细胞中的作用机制。方法用qRT-PCR检测胃癌细胞系BGC823、SGC7901、AGS、MGC803、MKN45中的circ_0009910表达水平,在BGC823、AGS细胞中采用circ_0009910 siRNA转染敲降circ_0009910,验证转染效果;在circ_0009910敲降的BGC823、AGS细胞中,用MTT法检测细胞增殖、平板法检测集落形成、Transwell检测迁移和侵袭、western-blotting检测上皮间质转化(EMT),采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。结果BGC823、SGC7901、AGS、MGC803、MKN45中的circ_0009910相对表达水平为(7.238±0.895)、(5.023±0.786)、(4.184±0.356)、(8.561±1.026)、(3.478±0.301),较正常胃癌显著升高(P<0.01),siRNA转染敲降circ_0009910后,BGC823、AGS细胞活力、集落形成数目、迁移和侵袭能力与对照组相比均明显降低(P<0.01),N-cadherin、Snail蛋白的相对表达降低,而E-cadherin表达增加。结论circ_0009910在胃癌细胞中高表达,可促进胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭及EMT。