PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术,以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板,在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP),经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN_2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN_2型特异性,可检出0.1Pg DEN_2-RNA。PCR扩增标记只用10 ng模板DNA,数小时内可制备约Iug标记的cDNA探针,而用六聚核苷酸随机引物(RHP)标记,从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针,至少需数10 h。可见PCR技术直接制备地高辛配基标记的cDNA探针较方便,快速、标记率高、特异性强,具有一定的应用前景。     

载脂蛋白CⅢcDNA克隆的筛选、鉴定及其探针的制备

用载脂蛋白(apo)CⅢ抗体探针对正常人肝cDNA库进行筛选,得到4个阳性克隆。经限制性内切酶谱对其cDNA插入片段及Western blot杂交时,其表达产物的鉴定表明筛选出的4个阳性克隆为apoCⅢcDNA克隆。以此克隆制备了含apoCⅢcDNA的重组DNA,经RNA-斑点杂交分析说明,此重组DNA可用来作为apoCⅢcDNA探针。     

猴D型逆转病毒Ⅰ型cDNA合成及其分子克隆的建立

利用随机引物法反转录合成SRV-1 ss-cDNA和ds—cDNA.将ds—cDNA平端连接到质粒pUC19中,转化E.Coli.DH5α菌.氨苄青霉素、X-gal培基和菌落杂交筛选,克隆阳性重组率为20.7%.EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切分析,12.7％的插入片段大于500bp。Southern杂交进一步确证,所选三株重组质粒(pSRV-127、pSRV-156和pSRV-169)的探针用插入片段(0.9kb、1.0kb和1.4kb),是SRV-1 cDNA片段.光敏生物素标记纯化pSRV-169DNA和pSRV-156cDNA片段制备探针,前者用于检测SRV-1病毒RNA,后者用于检测纯化病毒颗粒。碱性磷酸酶系统染色,灵敏度分别为18pg和4×10~5vp     

体外转录系统质粒pNI-11和pNI-12的构造

本文介绍将大鼠心房肽(ANP)前体的互补DNA(proANP—cDNA)的PstI片段再克隆到具有双向转录启动子的质粒pGEM—2中,构建了体外转录系统的质粒pNI—11和pNI—12。用限制性內切酶AccI消化重组的质粒,结合电泳比较酶谱,区别出插入段cDNA的方向。用这种质粒可以体外合成高灵度的探针,可供基因调控、原位杂交等多方面研究。判断插入基因在重组质粒中方向的方法有普遍意义。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达。方法采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo( )质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用L ipofectam ine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo( )-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性。结果经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo( )质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致。LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo( )-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中。结论实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达。     

蛋白激酶CK2α亚基cDNA的克隆与序列分析

目的构建人蛋白激酶CK2α重组质粒,研究CK2结构和功能.方法采用RT-PCR、定向克隆和DNA测序方法进行实验.结果通过BT-PCR从Hep-3B肝癌细胞中获得人蛋白激酶CK2α(Protein Kinase 2α)亚基编码区1136bp的cDNA片段,将扩增基因通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中,用PCR和限制性内切酶分析鉴定,表明获得重组质粒pUCm-T-CK2α.通过对CK2α编码区cDNA序列测序证实其与GeneBank中登记号为NM-01895的序列一致.结论成功构建了重组质粒pUCm-T-CK2α,为利用CK2αcDNA作为探针进行深入研究奠定了基础.     

PEGFP-C1-PHF6质粒的构建和鉴定

目的:构建含有PHF6基因的PEGFP-C1-PHF6重组质粒并对重组质粒进行鉴定,为进一步研究其在核仁中的定位和功能奠定基础。方法:野生型293细胞中提取总RNA,反转录为cDNA后采用聚合酶链反应从总cDNA中扩增出PHF6基因,上下游分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,双酶切后将其插入PEGFP-C1质粒中,构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌DH5α进行克隆,提取质粒进行酶切和测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至Hela细胞株中,Western blot检测PHF6基因蛋白的表达情况。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及DNA测序鉴定结果均证实PHF6基因已正确克隆到PEGFP-C1载体中,Western blot结果进一步证实PEGFP-C1-PHF6重组质粒构建正确。结论:成功并正确构建PEGFP-C1-PHF6重组质粒。     

单纯疱疹病毒DNA探针制备的研究

应用“Hirt上清法”直接从感染细胞中提取HSV-1(Sm44)标准株DNA,经BamHI酶切获得DNA片段混合物制备探针。实验结果表明,该探针可与HSV-1 (SM44)、HSV-2(SAV)标准株和HSV-1分离株以及重组质粒的DNA杂交,而不与ADV(8型)、CMV及人肺炎支原体和pBR322质粒的DNA提取物杂交,显示此DNA探针的特异性。为将HSV DNA探针用于临床标本检测建立了初步的实验基础。     

人α1微球蛋白/bikunin前体cDNA的克隆与鉴定

目的:从人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA中钓取α1微球蛋白/bikunin前体(AMBP)cDNA序列,构建其重组克隆载体。方法:采用Trizol法提取人胚胎肝、肾和胰腺组织RNA,以此为模板,应用RT-PCR技术扩增目的基因,构建重组载体pMD18-T-ambp。采用蓝白筛选,经限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。结果:RT-PCR显示,仅从肝组织RNA中扩增出ambp基因片段,而肾和胰腺组织中均未检测出其 mRNA的转录。构建的重组载体经SalⅠ/EcoRⅠ双酶消化得到1098bp大小的片段,与人AMBP cDNA片段大小一致。序列分析结果显示,克隆到载体中的目的基因与GenBank上登录的人AMBP cDNA序列完全一致。结论:从人胚胎肝组织RNA中成功钓取了AMBP cDNA序列,并正确构建其克隆载体pMD18-T-ambp。     

人脂蛋白脂酶基因重组质粒的构建及其表达

目的 研究野生型人脂蛋白脂酶(LPL)cDNA重组表达质粒的构建了及其在COS-1细胞中的表达.方法 采用RT-PCR法从人大网膜脂肪组织获取LPL cDNA基因,以pcDNA3.1Zeo(+)质粒作为载体,运用基因克隆技术构建野生型人LPLcDNA重组质粒,限制性内切酶酶切、PCR以及双向测序鉴定重组质粒;运用Lipofectamine 2000TM将重组pcDNA3.1Zeo(+)-LPLcDNA质粒导入COS-1细胞,RT-PCR法检测LPL mRNA,ELISA法和比色法分别检测细胞裂解液及细胞培养基中LPL浓度及活性.结果 经限制性内切酶酶切及PCR鉴定,证实LPL基因已被连接到pcDNA3.1Zeo(+)质粒中;DNA双向测序证实其产物与基因库中LPL基因序列完全一致.LPL mRNA和蛋白表达及其活性测定结果表明,pcDNA3.1Zeo(+)-LPL cDNA重组质粒已转染入COS-1细胞中.结论 实验成功构建野生型人LPL cDNA重组表达质粒,并证实其能在COS-1细胞中有效表达.     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体.方法eNOS的cDNA插入pcDNA3.1(-)中,进行DNA测序、酶切鉴定;插入片段用Xbal和AflⅡ双酶切后连接到pshuttle中,并予酶切鉴定;用P1-see I和I-ceu I双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体,通过PCR鉴定.结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统,并被目的基因的PCR鉴定证实.结论重组腺病毒表达载体构建正确,为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础.     

肝癌组织芭向性正义与反义表达载体pEBAF／N—ras的构建

目的：用分子克隆技术构建肝癌组织特异性N－ras cDNA正义与反义表达载体。方法：用BamHI酶切携带目的基因的质粒pZIP-NeoSV(X)1,获得1．06kb N-ras cDNA；同时以BamHI将载体pEBAF线性化，并行去磷酸化修饰，用T4 DNA连接酶将两者连接，转化感受态细菌DH5α。先以酶切和随机引物法标记的N－ras cDNA探针进行菌落原位杂交筛选阳性重组克隆，再以PvuⅡ酶切鉴定插入方向，同时进行DNA测序和同源性分析。结果：成功构建肝癌组织特异性正义与反义表达载体pEBAF/s-N-ras和pEBAF/as-N-ras。结论：成功构建的N－ras cDNA正／反义表达载体，为原发性肝癌的发生机理和基因治疗研究奠定良好的基础。     

人DNA甲基化转移酶3B1真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建人DNA甲基化转移酶3B1(DNMT3B1)真核表达载体pCMV-DNMT3B1.方法:根据Genebank中人DNMT3B1 cDNA序列设计并合成特异性引物,提取HCT116细胞总RNA,利用PCR技术扩增出DNMT 3B1,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中.结果:PCR扩增得到人DNMT3B1的cDNA片段大小为2.6 kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B1.结论:成功构建了人DNMT3B1真核表达载体,为进一步研究DNMT3B1提供了条件.     

人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA的构建及鉴定

目的:构建人CyPA基因重组质粒pET30α(+)-CyPA.方法:根据CyPA基因设计引物,从人肺痛组织eDNA中扩增目的基因.pET30α(+)质粒、目的基因DNA经Nde I酶、Xho I酶双酶切,用DNA快速连接试剂盒连接得重组子pET30α(+)-CyPA.将重组子转化DH5α,经卡那霉素琼脂糖平板筛选,挑选阳性克隆进行PCR扩增并测序.结果与结论:快速PCR能从阳性克隆中扩增出目的DNA.将重组质粒测序,由起始密码ATG到终止密码TAG止,扩增得到的目的基因片段具有完整的阅读框;与人CyPA基因cDNA序列进行比较,同源性达到99.8%.重组质粒pET30α(+)-CyPA构建成功.     

内皮型一氧化氮合酶腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建重组内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达系统载体方法eNOS的cDNA插入pcDNA3．1(-)中，进行DNA测序、酶切鉴定；插入片段用XbaⅠ和AnⅡ双酶切后连接到pshuttle中，并予酶切鉴定；用PI—seeⅠ和I—ceuⅠ双酶切下pshuttle中eNOS的cDNA插入腺病毒载体，通过PCR鉴定，结果正确构建重组eNOS腺病毒表达系统，并被目的基因的PCR鉴定证实。结论 重组腺病毒表达载体构建正确，为其在预防经皮腔内动脉成形术术后再狭窄基因转染奠定基础。     

表达人血管内皮生长因子和血管生成素1的CHO细胞株的建立

目的：克隆人血管内皮生长因子(VEGFm)和血管生成素1(Ang1)基因，建立可分别表达VEGFm和Ang1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)株。方法：用PCR技术，分别从人心脏cDNA库中扩增VEGF165和Ang1 cDNA，并定向克隆人真核表达载体pSecTag2B中。用Lipofectamine2000将重组质粒转化入CHO细胞中，用Zeocin筛选并维持已转化重组质粒的CHO细胞株。在大肠杆菌DH10B中扩增转化入CHO细胞中的重组质粒，行DNA测序鉴定。用Westem-blot鉴定CHO细胞中重组VEGFm和Ang1的表达。结果：从人心脏cDNA库中扩增出VEGFⅢ和Ang1 cDNA片段，酶切和测序结果显示，已正确构建重组质粒pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1。用Zeocin筛选到候选的CHO细胞株，DNA测序结果表明，pSecTag-VEGF165和pSecTag-Ang1已分别成功转化入CHO细胞中。Western-blot结果显示，在CHO细胞中表达出可被VEGF和Ang1单抗识别的特异蛋白。结论：克隆了VEGFm和Ang1基因，并建立了表达VEGF165和Ang1的CHO细胞株。     

人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

β地中海贫血基因的克隆化分离和次级克隆的建立

从1例广东籍重型β地贫患儿的外周血白细胞中分离基因组DNA。回收用HindⅢ完全酶解产生的6～9kb长度的DNA片段,与λCharon 28噬菌体DNA插入重组,构建基因文库。用~(32)P标记的βIVSⅢ(0.9kb)DNA片段作为探针,从1.4×10~5噬菌斑中筛出3个带有β地贫基因的阳性克隆,对其中一个阳性重组体DNA进行限制酶谱分析,进一步分离得到带有β地贫基因的3.7kb DNA片段,与噬菌体M13mp19重组,采用斑点杂交法筛选出阳性次级克隆。制备阳性M13mp19单链重组体DNA,用作DNA序列分析。在国内完成了首例β地中海贫血基因的克隆化分离。