p38丝裂原活化蛋白激酶调节急性淋巴细胞性白血病CEM细胞株糖皮质激素受体功能的分子机制研究

目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）对地塞米松（DEX）诱导急性淋巴细胞性白血病CEM细胞株凋亡过程中糖皮质激素受体α（GRα）功能的影响。方法台盼蓝拒染法绘制增殖曲线;流式细胞仪解析细胞凋亡;Western blot检测糖皮质激素受体蛋白及磷酸化p38MAPK蛋白表达。结果（1）p38MAPK特异阻滞剂SB203580预处理后继续培养24-72h,细胞的增殖率分别由单用DEX时的62．3％、35．5％、11．6％升至82．8％、54．7％和48．1％（P〈0．01）;（2）5μmol／LDEX处理CEM细胞36h时,亚二倍体细胞为26．2％,显著高于对照组（P〈0．01）。SB203580预处理后,亚二倍体细胞由26．2％降至7．1％（P〈0．01）;（3）5μmol／L的DEX处理CEM细胞后,GRα总蛋白的表达水平从12h开始分别上调至117％（12h）、121％（24h）、122％（36h）、125％（48h）。未与DEX结合的GRα主要存在于细胞浆中,细胞核GRα与细胞浆GRα之比为0．27。从6-48h,GRα的胞核与胞浆之比分别为0．48、0．59、0．95、2．16、4．08;（4）5μmol／LDEX处理CEM细胞后,p-p38MAPK蛋白在15min时即隐约可见,1h开始表达增强并持续增强至6h,之后减弱至48h仍可见。SB203580预处理后,未检测到p-p38MAPK蛋白的表达;（5）SB203580预处理后,GRα的核浆比例由4．08降至0．43（P〈0．05）,GRα总蛋白无明显变化。结论DEX在诱导CEM细胞凋亡时上调GRα的蛋白表达水平并促进转位人核。p38MAPK信号转导通路的活化促进了GRα转位人核。     

采用Calcein-AM评价白血病细胞膜P-gp泵功能及其逆转剂合理应用的研究

目的通过荧光染料Calcein—AM（C—AM）在K562及其耐长春新碱（VCR）的细胞系K562／VCR细胞中的变化以及异搏定（VER）、环孢霉素A（CSA）对C—AM在K562和K562／VCR细胞中摄取与排出的影响,研究C—AM在评价P—gP泵功能的作用,评价两种逆转剂的逆转作用,为临床合理应用逆转剂提供实验依据。方法以K562及K562／VCR为实验对象,以流式细胞术测定两种细胞系内不同时间点（0、30、60、90和120min）的C—AM荧光强度来反映P—gP泵功能以及CSA、VER对其的影响。结果C—AM在K562和K562／VCR细胞中的变化以24h内最为明显,24h后K562细胞和K562／VCR细胞内C—AM荧光强度分别下降至14．57％和15．64％。其在K562细胞内各时间点的平均荧光强度（MFI）明显高于K562／VCR细胞（各时间点差异P值均〈0．05）;CSA、VER和CSA＋VER对K562细胞内C．AM的摄取和外排无明显影响,但各组逆转剂、C—AM与细胞共孵育120min后,对照组、CSA、VER和CSA＋VER组的K562／VCR细胞MFl分别为3251±106．7、4014±219．0、3879±116．1和4158±302．6,与对照组相比,后三组细胞对CAM的摄取明显增加（P均〈0．05）。当外排120min后,对照组、CSA、VER和CSA＋VER组的K562／VCR细胞MFl分别为1622±191．0、2237±155．2、1932±233．0和2231±146．7,与对照组相比,后三组的CAM残余量也明显增加（P均〈0．05）,表明CSA、VER和CSA＋VER能增加K562／VCR细胞对C—AM的摄取和减少细胞内C—AM的外排。结论P—gP的表达能减少K562／VCR细胞对C．AM的摄取和增加其对C—AM外排,逆转剂CSA与VER的联合应用对K562／VCR细胞摄取和外排C—AM的影响并不比单独使用CSA或VER明显,通过使用C—AM和流式细胞术,可以比较迅速、简便评价白血病细胞P—gP的泵功能以及逆转剂的逆转作用。     

川崎病患儿血清可溶性血管细胞黏附分子-1、肿瘤坏死因子-α水平变化的意义

目的探讨可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在川崎病（KD）发病中的意义。方法采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）分别测定确诊为KD34例患儿急性期血清sVCAM-1、TNF-α水平,测定其中32例恢复期患儿血清sVCAM-1、TNF-α水平,26例健康儿童为健康对照组。结果KD组血清急性期sVCAM-1、TNF-α[（97.8±35.6）、（73.9±21.7）μg/L]均高于健康对照组[（41.2±8.9）、（2.7±1.8）μg/L],差异有显著性（Pa〈0.01）;KD患儿恢复期血清sVCAM-1、TNF-α水平[（46.9±16.8）、（4.3±2.9）μg/L]下降显著与急性期比较差异有显著性（Pa〈0.01）;而KD恢复期患儿与健康对照组无显著差异（P〉0.05）,且sVCAM-1与TNF-α呈正相关（r=0.798P〈0.001）。结论sVCAM-1、TNF-α可能参与KD发病的病理过程,血清sVCAM-1、TNF-α检测有助于对KD病情发展作出判断。     

急性白血病患儿血清铁指标的变化

目的 探讨白血患儿血清铁指标变化，了解白血病患儿铁代谢状况。方法 血清铁蛋白（SF）测定采用化学发光法；转铁蛋白（Tf）测定采用比浊法；血清铁（SI）测定采用火焰法。结果 1．SF在急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）初治组显著地正常对照组（P＜0．01）；经4周化疗完全缓解组ALL、AML与初治组无显著差异（P＞0．05）；ALL长期缓解组接受正常（P＞0．05），AML缓解前后SF高于ALL（P＜0．05）。2．ALL、AML初始组Tf显著低于正常对照组（P＜0．01），ALL与AML间无显著差异（P＞0．05），经4周化疗完全缓解组ALL、AML与初治组无显著差异（P＞0．05）；ALL长期缓解与正常对照组无差别（P＞0．05）。3．ALL、AML及缓解前后SI均无明显变化。4．上述各项指标与患者血红蛋白之间无显著相关关系。结论 白血病患儿存在体铁代谢紊乱，而不存在铁缺乏。     

新生儿脐血Toll样受体变化及其意义

目的观察新生儿脐血单个核细胞（MNC）rrLR4、TLR2mRNA的表达。方法将46例无窒息新生儿及40例窒息新生儿根据胎龄分组,分离脐血MNC,测定其TLR4／2mRNA表达及上清中TNF-α水平。另外将TLR4／2mRNA表达水平与TNF-α水平进行相关分析。结果无窒息新生儿中足月儿TLR4／2mRNA及TNF-O／．水平分别为0．75±0．12、0．63±0．08、2502．6±273．1ng／t,胎龄≥32周但〈37周早产儿分别为0．37±0．04、0．32±0．03、1218．8±145．7ng／t,胎龄〈32周早产儿分别为0．26±0．03、0．20±0．03、811．8±105．2ng／t;窒息新生儿中足月儿TLR4／2mRNA及TNF-α．水平分别为0．58±0．07、0．50±0．06、1946．4±244．2ng／t,胎龄≥32周但〈37周早产儿分别为0．29±0．03、0．26±0．03、970．0±94．3ng／t,胎龄〈32周早产儿分别为0．17±0．02、0．14±0．02、652．6±60．3ng／t;成人TLR4／2mRNA及TNF-α水平分别为2．71±0．75、2．61±0．33、9270．1±1098．3ng／t。早产儿、足月儿TLR4／2mRNA及TNF-α水平均低于成人,胎龄越低,TLR4／2mRNA及TNF-α水平越低。窒息新生儿TLR4／2mRNA及TNF-α的表达水平均低于同胎龄无窒息新生儿（P〈0．01）。TLR4／2mRNA表达水平与TNF-O／．水平呈正相关关系。结论新生儿,特别是早产儿,TLR水平低下,可能是新生儿天然免疫能力低下,容易患败血症等严重感染性疾病的重要原因之一。     

苦瓜素对柯萨奇B3病毒所致病毒性心肌炎小鼠肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的观察苦瓜素对柯萨奇B3病毒（CVB3）所致病毒性心肌炎大鼠心肌组织TNF-α水平、基因转录及相应蛋白质表达的影响，探索苦瓜素治疗病毒性心肌炎的药理机制。方法50只Balb／c实验小鼠随机分为苦瓜素治疗组（20只）、病毒感染空白对照组（20只）、正常对照组（10只）。苦瓜素治疗组与病毒感染空白对照组分别予腹腔注射0．1mL内含1×10^5TCID。的PRIM1640液，而正常对照组予腹腔注射同等体积培养液。苦瓜素剂量为25mg／（kg·d），1次／d，疗程7d。第15天取小鼠心肌采用ELISA进行TNF-α测定，HE染色行心肌病理检查，RT-PCR检测TNF-αmRNA转录水平，免疫组织化学测定TNF-α蛋白表达。结果与病毒感染空白组比较，苦瓜素治疗组小鼠心肌病理积分明显减少[（3．26±0．84）m（1．56±0．48），t=3．90 P〈0．01]，大鼠心肌组织TNF—α水平明显降低[（85．6±16．7）vs（34．5±10．3），t=5．24P〈0．01]，大鼠TNF-α mRNA转录水平亦显著减少[（0．09±0．02）vs（0．41±0．06），t=7．37 P〈0．01]。结论苦瓜素通过抑制TNF—α基因转录与蛋白质表达、降低心肌TNF—α水平，对Balb／c小鼠CVB，致病毒性心肌炎具有明显的治疗作用。     

Ph-like急性淋巴细胞白血病

Ph-like急性淋巴细胞白血病(ALL)是具有和Ph+ALL相似的基因表达谱以及相似的临床预后的一组白血病。基因组学研究发现Ph-like ALL与细胞因子受体基因、酪氨酸激酶以及RAS家族基因的突变相关。针对这些信号通路的激酶抑制剂治疗已经使部分相应的患者获得了更好的疗效。     

急性病毒性心肌炎患儿血清肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6水平变化的意义

目的探讨急性病毒性心肌炎（AVM）患儿血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）水平变化的意义。方法应用放射免疫法（RIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测53例AVM患儿及20例健康儿童血清TNF-α及IL-6水平,分析TNF-α及IL-6血清水平与儿童AVM发生的关系。结果AVM组急性期血清TNF-α和IL-6水平分别为（526.7±32.9）和（3.23±0.53）mg/L,健康对照组分别为（383.1±27.5）和（1.63±0.22）mg/L,二组比较均有显著性差异（Pa〈0.05）;临床治愈后,AVM组TNF-α及IL-6分别降至（407.3±34.4）和（1.97±0.29）mg/L,与健康对照组比较均无显著性差异（Pa〉0.05）。结论AVM患儿急性期血清TNF-α和IL-6明显增高,心肌炎治愈后降至正常,检测TNF-α及IL-6血清水平及变化有助于判断AVM患儿病情及心肌损害程度。     

儿童急性淋巴细胞性白血病诱导化疗修正方案的近期临床评估

目的比较上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心1999年开始使用的儿童急性淋巴细胞性白血病（ALL）治疗方案（以下简称99方案）,和在99方案基础上减轻治疗强度并从2005年开始使用的修正方案（以下简称05方案）诱导治疗的疗效、安全性,以提高儿童ALL的疗效。方法纵向对比1999年1月1日至2006年3月1日初治的311例ALL患儿临床资料;以2005年5月1日为分界线分为99方案组和05方案组。99方案组243例,05方案组68例。对两组患儿起病时临床资料、治疗反应、缓解情况、治疗相关的感染情况等进行统计分析。结果两组病例起病时各项临床资料（性别、年龄、诊断时外周血白细胞计数）差异均无统计学意义（P均〉0．05）,两组的缓解率（91．8％弧95．6％,P=0．29）和缓解时微小残留病（MRD）监测结果（P=0．17）差异也无统计学意义,99方案组与05方案组达到缓解所需时间（34．18±4．96d vs．32．34±3．36d）、治疗相关的感染率（54．7％伽．23．5％）、重症感染的发生率（9．1％vs.0）和病死率（3．7％vs.0）差异均有统计学意义。结论05方案和99方案在儿童ALL的诱导缓解治疗上都能取得良好的疗效,而05方案在疗效确切的同时具有更高的安全性。     

急性淋巴细胞白血病患儿体内肿瘤细胞的凋亡及其临床意义

目的 检测急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿体内肿瘤细胞的凋亡情况,并初步探讨其临床意义。方法 用Annexin-V-FITC/PI双标记法检测22例初治ALL患儿化疗前后骨髓白血病细胞的凋亡情况并与患儿的近期化疗疗效及DNA倍性、免疫表型等临床特征进行相关分析。结果 化疗前无一例检出凋亡细胞,化疗后13／22例凋亡检测阳性。化疗后患儿白血病细胞的凋亡情况与其早期缓解、DNA倍性、免疫表型有关（P均＜0．05）,与WBC数、年龄、性别、髓外浸润情况无关（P均＞0．05）。结论 Annexin-V-FITC/PI双标记法是一种简单、敏感的检测体内凋亡细胞的方法;化疗后体内白血病细胞的凋亡情况与近期化疗疗效一致;DNA指数1．16－1．6的ALL患儿预后好,与其白血病细胞易于凋亡有关;成熟B－ALL、T－ALL患儿预后差,与其白血病细胞不易凋亡有关。     

Leukemic Cell Lysis by Autologous Lymphocytes in Childhood ALL: Generation of Cytolysis by Lymphocytes Activated With Cultured Non T Non B Leukemic Cell Lines

The lysis of leukemic cells by autologous lymphocytes was studied in the common type of acute lymphoblastic leukemia (ALL) in childhood using the 10-hour⁵¹Cr release assay. Peripheral blood lymphocytes (PBL) from common ALL patients lysed autologous leukemic cells (% lysis: 19–45%), when co-cultivated in vitro with cultured non T non B leukemic cell lines (NALM 16, Reh and NALL 1). The effector cells were cytotoxic T lymphocytes (CTL) possessing Leu-1 and Leu-2a antigens. The effector CTL were cytotoxic not only for autologous leukemic cells but for cultured non T non B leukemic cell lines, whereas they did not lyse human T cell (CCRF-CEM), B cell (Daudi) and natural killer cell lines (SPI-802). Cold target competition assays demonstrated that leukemic cells from childhood common ALL and several non T non B leukemic cell lines shared an antigenic determinant(s) recognized by CTL.     

氯丙嗪对白血病细胞株K562/AO2多药耐药逆转作用的实验研究

目的研究氯丙嗪对阿霉素诱导的K562耐药细胞株(K562/AO2)多药耐药的逆转作用及机制,以便为临床应用提供实验依据.方法 (1)以四氮甲基唑蓝(MTT)法检测氯丙嗪的细胞毒性及其对K562/AO2细胞的耐药逆转作用;(2)以流式细胞术检测氯丙嗪处理前后K562/AO2细胞内柔红霉素(DNR)的蓄积量;(3)以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测氯丙嗪处理前后后K562/AO2细胞中mdr-1 mRNA的表达水平.结果 (1)氯丙嗪在3 μg/ml时对K562/AO2增殖的抑制作用小,抑制率＜5%;(2)氯丙嗪明显增加DNR对K562/AO2的毒性作用(P＜0.05),耐药逆转倍数为1.901;(3)氯丙嗪可明显增强DNR在K562/AO2细胞内的蓄积(P＜0.05);(4)氯丙嗪对K562/AO2细胞mdr-1 mRNA的表达水平无影响.结论氯丙嗪通过增加K562/AO2细胞内DNR的蓄积显著提高 K562/AO2细胞对DNR的敏感性,其逆转白血病细胞多药耐药的机制与mdr-1基因无关,还有待进一步探讨.     

端粒酶活性与儿童急性淋巴细胞白血病相关性的研究

目的了解端粒酶在儿童急性淋巴细胞白血病中的表达情况。方法采用端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ）检测了１４例儿童急性淋巴细胞白血病骨髓单个核细胞端粒酶活性水平，并与１０例正常健康儿童外周血和骨髓单个核细胞端粒酶活性相比较。结果白血病细胞端粒酶活性显著升高，可高达Ｋ５６２白血病细胞端粒酶活性的７５％～９８％，而正常外周血和骨髓单个核细胞具有适度低水平的酶活性，其相对活性为Ｋ５６２细胞的１．３％～５．７％。结论端粒酶的激活在急性淋巴细胞白血病的发生发展中可能具有重要作用。     

促红细胞生成素增加K562细胞转铁蛋白受体的表达及其对细胞周期的影响

目的探讨重组人促红细胞生成素(recombinant human erythroipoitin,rhEPO)和铁对白血病细胞K562转铁蛋白受体(transferrin receptor, TfR)即CD71抗原表达的影响,及其相同处理因素对K562细胞周期变化的影响.方法体外培养K562细胞并加rhEPO等处理因素,分别在24 h和72 h终止处理,各处理组细胞分别与FITC荧光标记的CD71单抗孵育,或与DNA染料碘化丙啶作用.通过流式细胞分析技术检测CD71抗原的表达和细胞周期,观察各组TfR表达情况和S期细胞百分率.结果 (1)不同浓度的rhEPO培养K562细胞72 h,均可使TfR表达增加,与同期空白对照组相比差异有显著意义(P＜0.05).(2)单独使用rhEPO(5 U/ml)或rhEPO(5 U/ml)+FeCl3(100 μmol/L)培养细胞72 h可使S期细胞百分率上升,且与空白对照组相比差异有显著意义(P＜0.05).结论 rhEPO可通过增加白血病细胞转铁蛋白受体的表达而增加DNA的合成.     

去铁胺诱导K562细胞凋亡研究

目的：探讨铁螯合剂去铁胺（DFO）诱导白血病细胞凋亡的分子机制。方法：实验分为DFO组(终浓度分别为10、50、100 μM)、DFO+FeCl3（各10 μmol/L）组及空白对照组。用钙黄绿素检测K562细胞可变铁池。锥虫蓝活细胞拒染实验进行活细胞计数及细胞存活率测定;光镜形态学观察及流式细胞仪方法检测K562细胞凋亡;比色法检测caspase-3活性。结果：（1）DFO作用于K562细胞后,随培养时间延长及DFO浓度的增加,动态铁池降低,细胞生存率逐渐下降,凋亡率增加,显示一定的时间剂量依赖性;而DFO+FeCl3组细胞凋亡率与空白对照组差异无统计学意义。（2）50 μmo/L、100 μmol/L DFO作用于K562细胞24 h时,caspase-3酶活性升高明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);相关分析结果显示,K562细胞铁池的荧光改变与caspase-3活性变化呈负相关(r=-0.894, P<0.05)。结论：DFO诱导白血病细胞凋亡的作用可能与螯合细胞内铁,降低细胞可变铁池,激活caspase-3有关。     

K562细胞诱导分化过程中早期生长反应基因mRNA表达的研究

目的 通过12-0-十四酰基咐哌醇-13-乙酸酯(TPA)诱导K562细胞分化,探讨白血病细胞早期生长反应基因(EGR-1)的表达及与细胞分化的关系。方法应用体外细胞培养技术通过细胞形态、细胞化学染色观察细胞分化的情况;用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应等技术检测细胞周期、纽咆表面分化抗原CD33、CD14及EGR-1 mRNA的表达。结果 TPA作用后K562细胞形态趋向成熟分化,非特异性酯酶(NSE)染色阳性,多可被氟化钠抑制;多数细胞被阻滞在G0 G1期,S期细胞减少;随处理时间的延长细胞表面抗原CD33,表达有所减少,CD14表达逐渐增多;EGR1 mRNA仅在TPA诱导K562细胞分化过程中表达。结论 TPA可诱导K562细胞向单核或巨噬细胞分化;EGR1-mRNA在TPA诱导K562细胞分化过程中才有表达,它可能参与K562细胞向单核或巨噬细胞分化的过程,并在诱导和维持细胞分化方面可能发挥重要作用。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞诱导分化的研究

目的采用反义寡核苷酸技术研究survivin与白血病细胞K562分化的关系。方法实验分为反义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组、脂质体组、空白对照组,转染后48h观察细胞形态及超微结构的变化;转染后24、48h分别进行联苯胺染色、过氧化物酶染色及硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验检测细胞功能;流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD33的表达;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平。结果反义寡核苷酸作用后,K562细胞出现向成熟红系及粒系分化的形态学及超微结构的改变,联苯胺染色阳性率、过氧化物酶染色阳性率、NBT还原实验阳性率均高于无义寡核苷酸组、脂质体组及空白对照组(P<0.01);细胞表面分化抗原CD33的平均荧光强度在反义寡核苷酸组降低(P<0.01);反义寡核苷酸作用24h后细胞内survivin蛋白的表达水平低于空白对照组(P<0.05),但与无义寡核苷酸组、脂质体组比较差异无统计学意义(P>0.05),而48h后survivin蛋白表达水平进一步降低,与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论survivin反义寡核苷酸能诱导K562细胞向成熟红系及粒系方向分化。     

Myelopoiesis in immunologically classified subgroups of childhood acute lymphocytic leukemia

Soft agar culture studies of 43 immunologically characterized patients with childhood acute lymphocytic leukemia (ALL) are presented. The immunologic subsets studied include “null”-cell, pre-B-cell, and T-cell leukemias. Abnormal myelopoiesis, including high peripheral blood and low marrow, colony-forming cell numbers, low colony-stimulating activity, and normal maturation of colony-forming cells in vitro was noted in each group as previously described for immunologically uncharacterized ALL. We conclude that immunologic subsets of childhood lymphoblastic leukemia cause similar abnormalities of myelopoiesis. Lack of differences in growth characteristics among immunologic subsets of ALL make it impossible to use this tissue culture technique in sub-classification of these leukemic disorders.     

苦参碱对急性淋巴细胞性白血病细胞Bcl-2表达的影响

目的　苦参碱是苦参的主要成分 ,具有抗K5 6 2细胞、HL 6 0细胞增殖的作用。本文主要探讨苦参碱抗儿童急性淋巴细胞白血病 (ALL)细胞增殖作用及可能机制。方法　MTT法检测苦参碱对ALL细胞的生长抑制作用 ,流式细胞仪 (FCM)检测苦参碱对ALL细胞Bcl 2表达的影响。结果　 0 .1mg/ml～ 1.0mg/ml浓度的苦参碱对ALL细胞的增殖有抑制作用。培养 4 8h后 ,与未处理组相比 ,其OD值 (MTT法 )由 0 .84± 0 .2 7分别降低为 0 .1mg/ml时的 0 .73± 0 .16 ,0 .2mg/ml时的 0 .5 8± 0 .15 ,0 .5mg/ml时的 0 .32± 0 .16 ,1.0mg/ml时的 0 .2 4± 0 .14 ,差异有显著性。苦参碱可下调ALL细胞Bcl 2的表达 ,培养 4 8h后 ,Bcl 2阳性率由 (2 5 .0± 5 .8) %降低至0 .1mg/ml时的 (2 1.3± 6 .1) % ,0 .2mg/ml时的 (18.2± 3.7) % ,0 .5mg/ml时的 (14 .5± 4 .0 ) % ,1.0mg/ml 时的(10 .0± 3.2 ) %。与对照组相比差异有显著性。结论　苦参碱具有抗ALL细胞的增殖作用 ,其可能机制可能与其下调ALL细胞Bcl 2的表达有关。