核糖体DNA聚合酶链反应诊断新生儿败血症

目的比较１６ＳｒＤＮＡ高度保守区引物聚合酶链反应（ＰＣＲ）与血培养及非特异性诊断指标对新生儿败血症的诊断价值。方法对１３１例拟诊为败血症的新生儿血标本进行细菌ＤＮＡ检测。结果１３１例中，ＰＣＲ检测阳性５６例，阳性率为４３％，明显高于血培养的阳性率（血培养阳性２３例，阳性率１８％）。１３１例拟诊败血症中，发现２３例确诊败血症及３１例临床败血症，对这５４例败血症（血培养阳性２３例＋临床败血症３１例）作ＰＣＲ检查，结果阳性４８例，阴性６例；对１３１例中的７７例“非败血症”病例，ＰＣＲ检测阴性６９例，阳性８例。对血培养阳性的２３例进行ＰＣＲ，结果阳性２２例。以血培养作为确诊标准，ＰＣＲ检测的敏感性为９６％，并不受抗生素治疗的影响。３０例阴性对照组ＤＮＡ的ＰＣＲ分析均为阴性。结论在严格控制污染的条件下，细菌共同引物ＰＣＲ技术能为新生儿败血症提供可靠的病原菌诊断依据     

16S rRNA基因在临床上的应用进展

传统的细菌检测主要依靠血清学、生物化学、细菌形态学及细菌培养等方法进行分类鉴定，但前三者敏感性和特异性不高。后者费时且阳性率低。近10余年来分子生物学技术发展迅速，各种基因方法如DNA杂交、质粒图谱和16S rRNA序列分析等在临床上得到广泛应用。该文就近年来国外16S rRNA在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述。     

16S rRNA基因在临床上的应用进展

传统的细菌检测主要依靠血清学、生物化学、细菌形态学及细菌培养等方法进行分类鉴定,但前三者敏感性和特异性不高,后者费时且阳性率低。近10余年来分子生物学技术发展迅速,各种基因方法如DNA杂交、质粒图谱和16SrRNA序列分析等在临床上得到广泛应用。该文就近年来国外16SrRNA在细菌学研究及其应用的一些新进展作一综述。     

早期诊断新生儿败血症的研究进展

新生儿败血症临床症状无特异性,早期诊断非常困难,但新生儿败血症的预后与早期应用抗生素密切相关。所以,新生儿学科工作者近年来从临床和实验室方面做了大量研究工作,试图找出早期诊断的依据。本文主要对血培养、C反应蛋白、幼稚粒细胞与粒细胞总数的比值、血浆白介素-1受体拮抗剂、白介素-6、可溶性细胞间黏附分子、前降钙素的水平及心率变化特点等早期诊断新生儿败血症的研究进展作一综述。     

细菌16S-23S rRNA 基因特异DNA图谱的分子诊断

目的　应用聚合酶链反应 (PCR)、限制性内切酶片段长度多态性分析 (RFLP)及测序技术 ,建立检测不同属种细菌的 16S 2 3SrRNA基因区间的特异图谱。方法　对临床上常见的细菌进行PCR扩增、RFLP、分子克隆及序列分析 ,同时对临床标本进行培养与PCR RFLP比较。结果　 2 7株不同细菌行PCR扩增后 ,得到不同DNA图谱。其中 15种细菌经PCR扩增即可区分 ,另 10种经HinfI或AluI酶切后才能区分。肺炎克雷伯菌与坚韧肠球菌的差异只在第 779位碱基上不同 ,XmaIII酶能区别。 42例临床诊断为新生儿败血症者 ,15例培养阳性 ,阳性率 3 5 7% ;而PCR阳性者则为 2 7例 ,阳性率为 64 2 9% ,明显高于血培养 (P <0 0 1)。 6例脑脊液标本中 ,1例PCR及培养均阳性 (表皮葡萄球菌 ) ;2例培养阴性标本 ,其PCR也阳性 ;经图谱分析为葡萄球菌 ,1例培养为新型隐球菌的脑脊液标本PCR检测为阴性。另 2例PCR及培养均阴性。结论　建立了PCR RFLP技术快速检测细菌 16S 2 3SrRNA基因区间的方法 ,具有特异、敏感、快速、准确的特点 ,为临床细菌感染的病原诊断提供新的科学依据。     

基因检测在新生儿脓毒症早期诊断中的价值

目的 分析16S rRNA基因检测在新生儿脓毒症早期诊断中的临床价值,探讨快速、可靠地诊断该症的试验方法.方法在16S rRNA基因保守区选择一对通用引物,收集临床常见的致病菌株37株,提取细菌DNA并进行PCR检测,采用琼脂糖凝胶电泳法观察扩增结果,同时对该引物的灵敏性及特异性进行检验.对106例临床疑诊为脓毒症的新生儿于入院24 h内,在严格无菌条件下采集血标本,提取DNA进行PCR扩增,同时行血培养、血常规检查及CRP及ESR水平检测,并与同期住院的20例非感染性疾病患儿进行比较.结果 PCR检测细菌DNA均得到预期的约371 bp大小的扩增产物,该引物仅扩增细菌DNA,与病毒及人基因组DNA无交叉反应,其扩增下限为104CFU·L-1的大肠埃希菌.106例疑诊为脓毒症的患儿,血培养阳性15例,PCR检测阳性36例,PCR的阳性检出率显著高于血培养(P<0.005),20例非感染组患儿PCR结果均为阴性.依据新生儿脓毒症诊断标准,PCR的敏感性、特异性及诊断指数分别为82.93%、96.92%和179.85,优于血培养及5项非特异指标至少2项异常的诊断方法.PCR方法6～8 h即能检测出结果,改良核酸提取技术可以将检测时间缩短至4～6 h.结论 PCR方法检测细菌16S rDNA能迅速判断临床标本中是否存在细菌,对于早期诊断新生儿脓毒症具有较高的敏感性及特异性.     

应用荧光定量聚合酶链反应动态观察新生儿巨细胞病毒感染

目的：探讨新生儿先天性巨细胞病毒感染后病毒转阴的规律及抗病毒治疗的效果。方法：经外周血定量CMVPCR检测确定CMV感染的37例足月新生儿，分为阿昔洛韦组和对照组，并每4周1次进行定量CMV-PCR动态观察以确定病毒转阴时间。结果：37例CMV感染中12周内阴转25例，占 67.6%，阿昔洛韦治疗组和对照组阴转时间差异无显著性。结论：先天性CMV感染多数在4周内血中病毒转阴，阿昔洛韦治疗无明显的疗效。     

应用巢式聚合酶链反应和测序检测肺炎支原体23S rRNA中点突变

目的 建立快速检测肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,MP)耐药性的实验方法并应用于临床以了解MP耐药现状.方法 应用巢式PCR直接检测咽拭子标本MP-23S rRNA基因并对扩增产物进行电泳检测或DNA测序分析;通过MP培养及体外药物敏感性试验测定临床分离株的红霉素最小抑菌浓度,以验证23S rRNA基因检测结果的可靠性.结果 200例临床标本经MP-IgM抗体、咽拭子MP种特异性16S rRNA基因巢式PCR扩增和MP分离培养测定证实为MP 64例.应用巢式PCR技术扩增MP-23S rRNA基因,并对扩增产物进行测序,将基因序列与基因库中MP标准株基因序列进行比较,与标准株序列相同的共计26例,其余38例存在23S rRNA点突变:35例在2063位点发生了A到G的点突变,1例在2063位点有A到C的点突变,2例在2064位点有A到G的点突变;耐药率为59.4%.MP耐药基因检测方法灵敏度达102 ccu/ml,MP培养及药物敏感性试验证实23S rRNA基因检测结果可靠.结论 建立的MP耐药基因检测方法能直接检测临床标本中的MP耐药基因.59%的受检标本23S rRNA基因发生点突变.     

新生儿败血症早期诊断标志物研究新进展

新生儿败血症是导致新生儿死亡和致残的重要疾病,早期诊断具有重要意义。近年来,细胞因子、降钙素原、中性粒细胞表面抗原、细胞间黏附分子、中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂及纤维连接蛋白等生物学参数被作为败血症的早期标志物来进行研究。现将其作用机制及临床应用作一综述。     

荧光定量PCR在肺炎衣原体感染中的诊断评价

目的 探讨肺炎衣原体荧光定量PCR在小儿肺炎衣原体感染中的诊断价值.方法 对象为诊断为肺炎,且采用肺炎衣原体荧光定量PCR方法检测其深部呼吸道分泌物中肺炎农原体DNA呈阳性的患儿(阳性阈值1.0×103 copy/ml)248例.分析患儿临床资料,并进行血清学肺炎衣原体特异性抗体(Cpn-IgM)检测,用定量资料受试者工作特征曲线下面积,评价肺炎衣原体荧光定晕PCR的诊断价值.结果 肺炎衣原体荧光定量PCR诊断方法在受试者工作特征曲线下面积=0.625;Cpn-IgM阳性组的PCR拷贝数[log(Cpn-DNAcopy/ml)]为5.31±1.25,阴性组为4.76±1.27,差异有统计学意义(P<0.05);Cpn-IgM阳性组患病年龄为65(26.2～96.5)个月,阴性组患病年龄为7(2.0～41.5)个月(P<0.001);Cpn-IgM阳性组病程为7(5～13)d,阴性组病程为7(5～10.8)d,两组差异无统计学意义(P>0.05).结论 肺炎衣原体荧光定量PCR单独用于诊断肺炎衣原体感染准确性较低,但是对于免疫系统尚未发育完善的婴幼儿具有一定的诊断价值;且荧光定量PCR的拷贝数越大,越支持肺炎衣原体感染的诊断.     

16SrRNA基因PCR加基因芯片杂交快速诊断新生儿败血症

目的　探讨新生儿败血症的快速诊断方法。方法　 (1)以 16SrRNA基因为靶序列 ,设计引物及寡核苷酸探针 ;将探针固定在特制的玻片上制作成基因芯片 ;(2 )对临床疑为细菌感染的 2 85例新生儿抽取静脉血分别做血培养和细菌 16SrRNA基因检测 :于血标本及脑脊液中抽提DNA后采用聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,将扩增产物加样在基因芯片上杂交后进行激光扫描及读片。结果(1)PCR检测阳性率 5 96 % (17/2 85 )明显高于血培养的 2 81% (8/2 85 ) ,差异有显著意义 (P <0 0 1)。若以确诊败血症作为对照 ,PCR的诊断敏感性为 10 0 % ,特异性为 96 75 % ,正确诊断指数为 0 96 8。(2 )对 17份PCR阳性标本进一步做基因芯片杂交 ,结果通用探针均阳性 ,其中G 探针阳性 12份、G-探针阳性 5份 ;8份PCR和血培养均阳性的标本 ,基因芯片杂交探针阳性菌株与血培养细菌阳性结果完全一致。结论　基因芯片杂交技术检测临床标本中 16SrRNA基因能快速诊断新生儿败血症 ,除较血培养等方法有更好的敏感性和特异性外 ,还能快速明确系何种病原菌感染 ,因此有较大的推广及应用价值     

Detection of bacterial DNA by PCR and reverse hybridization in the 16S rRNA gene with particular reference to neonatal septicemia

AIM: The clinical diagnosis of sepsis is difficult, particularly in neonates. It is necessary to develop a rapid and reliable method for detecting bacteria in blood and cerebrospinal fluid (CSF). Polymerase chain reaction (PCR) and reverse hybridization of the 16S rRNA gene would permit fast and sensitive determination of the presence of bacteria and differentiate gram-positive bacteria from gram-negative ones in clinical specimens. METHODS: We developed a pair of primers according to the gene encoding 16SrRNA found in all bacteria. DNA fragments from different bacterial species and from clinical samples were detected with PCR, and with reverse hybridization using a universal bacterial probe, a gram-positive probe and a gram-negative probe. RESULTS: A 371 bp DNA fragment was amplified from 20 different bacterial species. No signal was observed when human DNA and viruses were used as templates. The sensitivity could be improved to 10(-12) g. All 26 culture-positive clinical samples (22 blood samples and 4 CSF samples) were positive with PCR. The gram-negative and gram-positive probes hybridized to clinical samples and to known bacterial controls, as predicted by Gram's stain characteristics. CONCLUSIONS: Our results suggest that the method of PCR and reverse hybridization is rapid, sensitive and specific in detecting bacterial infections. This finding may be significant in the clinical diagnosis of sepsis in neonates.     

Real-time PCR of the 16S-rRNA gene in the diagnosis of neonatal bacteraemia

Abstract Objective: To evaluate a real-time PCR assay for the diagnosis of neonatal bacteraemia. Patients and methods: Two hundred ninety-five plasma samples from 288 newborns with suspected neonatal sepsis were collected prospectively for the purpose of polymerase chain reaction (PCR)-based bacterial detection. A real-time PCR targeting the bacterial gene for 16S-rRNA gene combined with four specific probes designed to detect Gram-negative bacteria, Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci (CoNS) was developed. All samples positive in the universal PCR were further sequenced for bacterial identification. Results: When applied to a material from 50 patients with positive blood culture and 245 patients with negative blood culture, the universal PCR showed a sensitivity of 42% (28-57), a specificity of 95% (92-97), a positive predictive value of 64% (45-80), and a negative predictive value of 89% (84-92) (95% confidence intervals in brackets). Conclusion: A new real-time PCR technique was for the first time applied to a well-defined prospectively and consecutively enrolled material of newborns with suspected sepsis, combining the benefits of real-time PCR with specific probes and sequencing. The method managed to detect bacteraemia with high specificity even though the sensitivity was low. Factors causing the low sensitivity are identified and further strategies to develop the method are described.     

新生儿败血症病原学特征分析

目的 探讨本院新生儿败血症病原菌的分布及耐药情况,指导临床合理使用抗生素,促进医院感染的有效防控.方法 对2006年1月至2011年5月我院新生儿科收治的败血症患儿进行回顾性分析,按照发病时间分为早发型败血症及晚发型败血症,并根据发生感染的地点分为社区获得性感染及医院感染.结果 研究期间共收治新生儿败血症121例.早发型败血症50例(41.3％),病原菌以革兰阴性杆菌为主,共40例(80％),其中含产超广谱β内酰胺酶(ESBLS)株5例(10％),革兰阳性凝固酶阴性葡萄球菌10例(20％).晚发型败血症71例(58.6％),其中社区感染56例(78.9％),病原菌以革兰阳性球菌为主,共30例(42.2％),革兰阴性杆菌26例(36.6％);医院感染15例(21.1％),革兰阴性杆菌7例(9.9％),其中产ESBLs株4例(5.6％),革兰阳性凝固酶阴性葡萄球菌4例(5.6％),真菌4例(5.6％),均为白色念珠菌.结论 早发型败血症及晚发型败血症、社区获得性败血症及医院感染败血症病原谱不同,均有多重耐药菌产生.     

组织因子途径抑制物及前降钙素在新生儿败血症诊断中的价值

目的 了解组织因子途径抑制物(TFPI)、前降钙素(PCT)在新生儿败血症诊断中的价值.方法 通过检测48例败血症新生儿及30例健康新生儿血TFPI、PCT、C-反应蛋白(CRP)浓度,比较各炎症指标对诊断败血症的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数,评价它们对该病的早期诊断价值.结果 (1)以TFPI≥30μg/L、CRP≥8 mg/L、PCT≥2 ng/ml为阳性标准,三指标对诊断败血症的灵敏度分别为86.92%、89.83%、87.50%,差异无显著性(P＞0.05),其中PCT的特异度96.67%、阳性预测值97.50%、阴性预测值83.32%、约登指数0.84;(2)在败血症组中,20例血培养阳性患儿的TFPI值为(35.5±4.5)μg/L,28例血培养阴性患儿的TFPI值为(34.3±3.2)μg/L,差异无显著性(P＞0.05);但是相对于正常对照组(26.9±5.24)μg/L,败血症组的TFPI值明显升高(P＜0.05).结论 TFP≥30μg/L对诊断新生儿败血症是一个具有较高灵敏度(86.92%)、中度特异度(59.3%)的指标;TFPI对新生儿败血症早期诊断有一定的价值,但均不及PCT及CRP,所有检测指标中PCT特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数均最高.     

细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立

目的：细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法是目前亟待解决的关键问题。方法：分析细菌16S rRNA 基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测, 分析三种探针检测结果的相关性。结果：细菌16S rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测：通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针（G+Probe探针）检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针（G-Probe探针）检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100％。结论：建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法。其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值     

晚发型新生儿败血症院内感染和社区感染的病原菌对比与分析

目的 晚发型败血症是新生儿期常见的感染性疾病,也是新生儿死亡的常见原因之一.新生儿一旦感染,病情可以迅速恶化,故早期有效的抗菌素治疗至关重要.该研究的目的 就是通过回顾性地分析晚发型新生儿败血症(LONS)的病原菌及其药敏,以指导临床早期对可疑LONS患儿合理用药.方法 对2002年1月1日至2005年12月31日温州医学院附属育英儿童医院NICU收住的具有临床表现以及至少一次血培养阳性的LONS临床特点、药敏进行回顾性分析.结果 102例LONS多通过皮肤、消化道、呼吸道等途径感染,临床表现无特异性.其中院内感染22例,社区感染80例,院内感染组与社区感染组比较,患儿胎龄小,体重轻,发病早(t=2.255、P＜0.01,t=8.818、P＜0.01,t=7.581、P＜0.05),差异有统计学意义.两组患儿血培养共检出110株病原菌,以凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)居首(50/103,48.5%),其次为肺炎克雷伯杆菌(16/103,15.5%)、金黄色葡萄球菌(9/103,8.7%).社区感染主要病原菌为葡萄球菌属和大肠埃希菌,院内感染则为肺炎克雷伯菌.大部分(＞80%)的葡萄球菌尤其是CNS对青霉素类、红霉素及头孢唑啉耐药,MRSA达66.7%(6/9),但对万古霉素未发现耐药,大部分对利福平亦敏感.几乎所有(15/16)的ESBLS肺炎克雷伯菌具多重耐药性,仅对碳青霉烯类、氨基糖苷类以及喹诺酮类等少数抗菌药物敏感.发现1例对万古霉素耐药的粪肠球菌,然而,未发现B组链球菌感染的病例.结论 LONS临床表现非特异性,B组链球菌不是温州地区社区感染LONS的主要致病菌.由于医院和社区抗菌素的滥用,出现越来越多的多重耐药菌.对于可疑败血症患者应常规进行血培养以确定病原菌,并根据最可能的病原菌选用相关抗生素.为减少多重耐药菌感染的发生,应尽量减少第三代头孢菌素的使用.