人免疫球蛋白受体FcγRIIa的基因克隆及在K562细胞的表达

目的将外源人免疫球蛋白IgGFc段Ⅱ型受体CD32a分子表达于K562细胞表面,为构建人工抗原递呈细胞提供重要前提。方法自U937细胞RT-PCR得到CD32a的cDNA基因,与T载体连接后亚克隆入表达载体pcDNA3.1(+)。经测序后利用脂质体介导的转染将CD32a分子表达在K562细胞的表面。结果构建的T载体测序后,Genebank比对证实为CD32a的cDNA分子,免疫荧光和流式细胞仪结果均说明CD32a分子在K562细胞得到表达(96.9%)。结论获得的人工构建的表达人免疫球蛋白IgGFc受体的K562细胞,完成人工抗原递呈细胞制备的首要步骤。     

HLA-E真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达与鉴定

本研究旨在亚克隆HLA-E真核表达载体，并使其在HLA-I类阴性的靶细胞K562细胞上获得稳定表达。首先采用PcR方法从多顺反子表达载体(pG/A2E)扩增出目的片段A2／ E cDNA，与真核表达载体pcDNA3．1( )重组，构建成HLA—E真核表达载体pcDNA3．1( )／A2E，然后采用脂质体转染的方法将重组质粒转入K562细胞，最后经G418筛选及有限稀释，利用抗HLA-E特异的单克隆抗体K0126-3进行FACS检测，以观察HLA—E分子在靶细胞表面的表达情况。结果显示，HLA-E分子在经pcDNA3．1( )／A2E转染的靶细胞表面获得表达(27．76％)，而经空载体pcDNA3．1( )转染的靶细胞则未获得表达。结论：成功构建了pcDNA3．1( )／A2E真核表达载体，并使HLA-E分子在HLA-I类阴性的K562细胞表面表达，为进一步研究HLA-E作用的分子机制以及探索HLA-E与NK受体之间的相互作用和HLA-E体外表达对NK细胞功能的影响奠定了基础。     

K562细胞定向分化时Bcl-6的表达

Bcl 6 (Bcelllymphoma 6 )是原癌基因bcl 6的表达产物 ,决定着正常淋巴细胞的发育及淋巴组织生发中心形成[1] 。最近研究表明 ,Bcl 6还在其它许多正常及肿瘤细胞的增殖、分化过程中发挥着十分重要的生物学功能[2 ,3 ] 。人红白血病细胞株K5 6 2具有在不同诱导剂作用下分别向红细胞系、巨核细胞系及巨噬细胞系定向分化的特征[4] ,是研究白血病细胞分化及其机制的理想细胞系 ,了解Bcl 6在K5 6 2细胞定向分化过程中的表达及功能 ,对进一步了解白血病的发病机制 ,揭示Bcl 6新的生物学功能有重要意义。材料和方法1　材料　白血病细胞系K5 6 2…     

鱼藤素对K562细胞nup98表达的影响

本研究观察鱼藤素对白血病细胞株K562细胞核孔蛋白nup98表达的影响。用MTT比色法检测细胞增殖活性;流式细胞术及RT-PCR法分析鱼藤素作用K562细胞后nup98蛋白及mRNA含量的变化。结果表明:鱼藤素能显著抑制K562细胞的增殖,并与作用时间和鱼藤素浓度呈依赖关系;空白对照组K562细胞nup98蛋白表达的平均荧光强度为34.22±1.63,显著高于阴性对照组(2.83±0.02,P<0.01),10nmol/L鱼藤素即能显著抑制nup98蛋白的表达;10nmol/L鱼藤素对nup98mRNA表达的抑制作用不显著,20、40、80、160nmol/L鱼藤素能显著抑制nup98mRNA的表达,并且呈剂量依赖性。结论:鱼藤素可通过抑制核孔蛋白nup98的表达进一步抑制K562细胞的增殖。nup98可能成为急性白血病治疗的基因靶点。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的机制探讨

本研究旨在探讨三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)诱导P210^Bcr-Abl K562细胞凋亡的发生机制。采用细胞培养、细胞形态观察、流式细胞术(FCM)测定凋亡细胞和细胞周期，应用半定量逆转录一-合酶链反应(RT—PCR)分析ATO作用不同时间后K562细胞bcl—Xl和bcr-abl基因的改变，并检测胞浆细胞色素C(cyt C)、半胱天冬酶3(caspase-3)蛋白的表达。结果表明：2．5μmol／L ATO作用48小时可诱导K562细胞凋亡，凋亡进程中细胞胞浆内cyt C蛋白浓度增高，caspase-3活性增强；RT—PCR显示ATO对bcr-abl基因表达无明显影响，但12小时可下调bcl-XL基因。结论：ATO通过激活胞浆线粒体下游的cyt C和caspase-3激酶活性而诱导K562细胞凋亡，bcl—XL基因下调也促进了细胞凋亡。     

款冬花粗多糖体外诱导人白血病K562细胞的凋亡

目的:观察款冬花粗多糖对体外培养人白血病K562细胞有无凋亡诱导作用。方法:实验于2006-06-25/2006-09-08在河北北方学院实验中心细胞生物学实验室、分子生物学实验室、药物研究实验室完成。①款冬花粗多糖的提取:称取已干燥粉粹的款冬花417.0g,加入1000mL体积分数0.85乙醇回流提取1h,滤过,滤渣加入1000mL三蒸水回流提取2h,过滤,滤渣再加入1000mL三蒸水回流提取2h,合并2次滤液,减压浓缩至适量,四倍体积无水乙醇醇沉,静置过夜,过滤,沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤,即得款冬花粗多糖。苯酚-硫酸法测定款冬花粗多糖含量以生药计算为122.9mg。制成102.5g/L粗多糖溶液。②人白血病K562细胞的生长抑制实验:体外培养的K562细胞经10,30,50,70,90mg/L的款冬花粗多糖作用48h后,通过Hoeehst33258染色在荧光显微镜下进行形态学观察、采用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术检测细胞凋亡。结果:①经款冬花粗多糖作用后,荧光显微镜下发现体外培养的K562细胞中出现核固缩、凋亡小体。②经不同质量浓度款冬花粗多糖处理的K562细胞DNA电泳均出现相差约200bp的DNA梯子状条带。③流式细胞仪检测发现,经不同质量浓度款冬花粗多糖处理的K562细胞,有凋亡峰。结论:款冬花粗多糖可诱导体外培养人白血病细胞K562凋亡。     

人K562白血病细胞来源的树突状细胞低温冻存方法的研究

本研究的目的是探讨经低温保存的树突状细胞 (dendriticcell,DC)的生物学特性 ,寻找一种较为简便有效的冻存方式 ,为DC的临床过继回输提供保存方法。将由K5 62细胞诱导培养产生的DC(K5 62 DC) ,用含 10 %二甲亚砜 (DMSO)及 2 0 %胎牛血清 (FCS)的RPMI 1640作为冻存剂 ,利用分步法分别将其冻存于 - 80℃冰箱及- 196℃液氮中 ,然后于不同时间将K5 62 DC复苏 ,复苏后检测两组细胞的存活率、表面分子表达、刺激指数及其介导CTL对K5 62细胞的杀伤率 ,比较冻存前后及两组间的差异。结果发现 ,冻存前后K5 62 DC (K5 62 DC于- 80℃或液氮冻存 1月 )细胞形态无明显变化 ,表面分子表达及刺激T细胞增殖的能力无明显差别 (P >0 .0 5 )。此外 ,在 - 80℃冰箱及 - 196℃液氮中冻存的K5 62 DC ,在冻存后 1月以内复苏 ,细胞的存活率、刺激T细胞增殖的能力及其介导的杀伤效应无差别 ;但当冻存时间超过 1月时 ,两组间有明显差别。结论 ,两种冻存方式冻存K5 62 DC ,冻存时间较短时 ( 1月以内 ) ,其刺激淋巴细胞及其介导CTL的杀伤能力相同 ;冻存时间较长时 ( >1月 ) ,- 196℃液氮效果明显优于 - 80℃超低温冰箱。     

过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株的建立

本研究目的建立过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株(K562-HMGB1)及不表达该蛋白的对照细胞株(K562-pcDNA3.1),为研究hm gb1基因在白血病发生及进展中的作用与机制建立基础。从U937白血病细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA。以cDNA为模板应用PCR技术扩增hm gb1编码基因,将其连接入PMD18-T vector(PMD18-T-HM BG1vector),并转化至大肠杆菌DH5a中。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用限制性内切酶KpnI/XhoI酶切鉴定,最终应用DNA测序得到序列正确的阳性克隆;然后将PMD18-T-HM BG1vector克隆中的hm gb1基因应用限制性内切酶KpnI/XhoI切出,并连接入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到重组质粒pcDNA3.1-HM BG1。将pcDNA3.1-HM BG1、pcDNA3.1质粒分别电转染至K562细胞,电转染后48小时后加入终浓度800μg/m l的G418进行药物加压筛选,2周后得到有效转染pcDNA3.1-HM BG1及pcDNA3.1载体的K562细胞株(K562-HM BG1,K562-pcDNA3.1)。通过RT-PCR和W estern b lot技术分别在转录及蛋白表达水平检测K562稳定细胞株中HMGB1蛋白过表达情况,验证建立的K562稳定株的功能。结果表明,成功构建pcDNA3.1-HM BG1表达载体,并转染至K562细胞中,建立了过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株(K562-HM BG1)。在转录及蛋白水平上验证了该稳定细胞株过表达HMGB1蛋白。结论:已成功建立了过表达HMGB1蛋白的K562稳定细胞株及对照细胞株即K562-HM BG1细胞及K562-pcDNA3.1细胞,为研究hm gb1基因在白血病发生及进展中的作用及机制建立了基础。     

生长抑素对K562细胞的调控作用

生长抑素是一类广泛存在于人体不同组织器官的多肽类激素,研究发现生长抑素及其类似物不仅能抑制多种激素的分泌,还能抑制神经内分泌肿瘤和普通实体肿瘤的增殖。本研究采用~3H—TdR掺入法和液体闪烁技术研究八肽生长抑素(奥曲肽,octreotide,SMS)对K_(562)细胞增殖的影响,以探讨生长抑素对白血病细胞的调控作用。     

孤啡肽诱导白血病细胞K562凋亡

本研究探讨孤啡肽对白血病细胞K562增殖的影响及诱导凋亡的作用，采用MTT（四唑氮蓝）法检测不同浓度的孤啡肽对K562细胞生长的影响，应用瑞氏染色、电子显微镜观察药物作用后K562细胞形态的改变，流式细胞术检测孤啡肽对K562细胞细胞凋亡作用，DNA琼脂糖凝胶电泳观察孤啡肽作用后K562细胞内DNA的损伤程度。结果表明：10^-6～-10^-13mol／L孤啡肽明显抑制K562细胞的生长，且存在时间依赖性，而剂量依赖性不明显；10^-6-10^-7、10^-9、10^-12mol／L孤啡肽作用72小时后显示明显的细胞毒作用。与对照组相比，10^-9mol／L孤啡肽作用72小时后K562细胞出现典型凋亡特征；流式细胞术检测发现：0、10^-7、10^-8、10^-9mol／L孤啡肽作用72小时后出现凋亡峰，凋亡率分别为0％、22．8％、23．8％、26．5％；DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的梯状条带。结论：孤啡肽能够抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡。     

K562细胞中氯化血红素诱导性表达基因的研究

目的 鉴定K562细胞中氯化血红素(hemin)诱导性表达基因。方法 分别提取经hemin诱导培养的K562细胞(tester)和未加诱导剂培养的K562细胞(driver)mRNA,逆转录合成双链cDNA。采用抑制性消减杂交（SSH)技术构建正向消减cDNA库。筛选出阳性克隆。PCR扩增阳性克隆插入片段。反向Northern点杂交确定hemin诱导后表达上调的cDNA片段并测序后与GenBank序列进行Blast,同源性比较分析。结果 发现15个cDNA片段在he加n诱导后表达上调,其中大部分与GenBank中已知功能蛋白质的mRNA序列同源,包括珠蛋白epsion l(globinε1),类谷胱甘肽巯基转移酶Omega(GSTTLp28),含硒蛋白X1(SEPX1),磷酸丙糖异构酶(TP11),核糖体蛋白L7(RPL7),核糖体蛋白S13(RPSl3),铁蛋白轻链(ferritin L polypeptide),珠蛋白gamma A(globin Aγ),RAD51同系物C(TSF51C),铁蛋白重链(ferritin L polypeptide),X盒结合蛋白(XBPl)。受hemin诱导性表达的基因克隆中的部分cDNA片段则同源于GenBank中已登录的mRNA序列,但相应蛋白质的功能尚不清楚,包括cDNA DKFZp4341116,假定蛋白HSPCO14及NOLIR2蛋白质。结论 hemin主要诱导K562细胞红系分化、蛋白质合成及代谢相关基因表达,这些发现为hemin诱导造血祖细胞红系分化的差异基因表达及其进一步功能研究提供了综合性信息。     

稳定表达hermap及hermap-siRNA的K562细胞系的建立

本研究分别建立可稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系。双酶切hermap的PCR扩增产物并与pEGFP-c1载体连接形成重组质粒;双酶切hermap-siRNA序列并与pRNAT载体连接形成重组质粒;使用电穿孔转染法将上述两质粒分别转染K562细胞,通过G418筛选建立可分别稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系。结果显示,hermap-pEGFP-c1质粒及hermap-siRNA-pRNAT质粒转染K562细胞的效率分别为10.0%和9.3%;两种K562细胞系通过G418筛选均能稳定生长并表达目的基因。结论:成功构建了含hermap和hermap-siRNA的真核表达质粒,建立了稳定表达hermap和hermap-siRNA的K562细胞系,这为进一步研究HERMAP在红细胞分化发育过程中的作用奠定了基础。     

Toll样受体7激动剂对K562细胞抑制作用的研究

本研究旨在探讨Toll样受体(TLR)7激动剂gardiquimod对人慢性髓系白血病细胞K562的抑制作用。以异戊烯焦磷酸法扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的gardiquimod处理γδT细胞和K562细胞48 h,用MTT法检测细胞增殖情况。以流式细胞术检测gardiquimod处理前后K562细胞内TLR7表达、细胞周期及凋亡的变化。用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对K562的杀伤活性。结果表明,gardiquimod 0.69-11.0μg/ml可明显促进γδT细胞增殖,在5.5-11.0μg/ml浓度下抑制K562细胞增殖;gardiquimod处理K562细胞后未检测到凋亡,但细胞周期有明显变化,而且处理后的K562细胞更易被γδT细胞杀伤。结论:gardiquimod能够抑制K562细胞增殖,阻滞细胞周期,并增强其对γδT细胞杀伤的敏感性。     

超声诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的本实验探讨超声体外诱导K562细胞凋亡的影响及其机制。 方法频率为1．8MHz的超声波辐照正常外周血单核细胞和体外培养的K562细胞，辐照后用光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变、流式细胞仪检测原位末端脱氧核苷酸转移酶（TUNEL）和p53、bcl-2、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达水平。 结果电压为10mV超声辐照细胞10min后12h和24h，光学显微镜下可见凋亡小体形成等典型形态学改变，K562细胞凋亡率及p53、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达水平分别显著高于对照组（P〈0．001）；而bcl-2蛋白表达水平明显低于对照组（P〈0．001）。 结论超声可以诱导K562细胞凋亡，其机制可能与p53、caspase-3、Fas、FasL蛋白表达增高及bcl-2蛋白表达降低有关。     

多药耐药K562/A02和敏感K562细胞来源的树突状细胞介导抗白血病效应对比研究

本研究探讨多药耐药(MDR)白血病K562/A02细胞和敏感K562细胞诱导树突状细胞(DC)分化及介导的抗白血病效应。采用慢性粒细胞白血病(CML)P170糖蛋白(Pgp)高表达的MDRK562/A02细胞、敏感K562细胞在含细胞因子GMCSF(1000U/ml)、IL4(500U/ml)和TNFα(100ng/ml)的RPMI1640完全培养液中诱导分化成DC,以光镜观察细胞形态、流式细胞术检测细胞表型,异基因混合淋巴细胞反应(alloMLR)检测T细胞增殖活性,MTT法测定细胞毒作用。结果表明:培养14天的K562/A02细胞和K562细胞均出现典型的DC形态特征,表达DC的相关分化抗原及共刺激分子CD1a、CD83、HLADR、CD80、CD86。alloMLR检测中,K562/A02DC较K562DC具有更强的刺激异基因T细胞增殖能力(P<0.05)。两种DC激活的CTL分别对K562/A02和K562细胞较HL60细胞具有显著的杀伤活性(P<0.01);更重要的是,K562/A02DC较K562DC激活的CTL对Pgp高表达的MDRK562/A02细胞、HL60/VCR细胞具有更强的细胞毒作用,杀伤活性分别为(40.7±1.3)%、(28.4±0.9)%(P<0.01)和(24.9±1.1)%、(8.2±0.7)%(P<0.01)。结论:Pgp高表达的MDR白血病细胞K562/A02和敏感K562细胞都可在GMCSF、IL4和TNFα作用下诱导分化为成熟DC,均可活化CTL产生特异的抗白血病效应;尤其K562/A02细胞来源的DC可介导针对Pgp高表达的多药耐药白血病的特异细胞毒作用。     

过表达Src诱导K562细胞产生格列卫耐药

目的:探讨过表达Src激酶在诱导K562细胞产生耐药中的作用及机制.方法:应用质粒转染的方法在K562细胞中过表达Src激酶,WST方法检测对格列卫(Imatinib)的敏感性,并通过RNA干扰特异抑制Src激酶,检测其对耐药的K562/G细胞增殖的影响.结果:在K562细胞中过表达Src激酶,显著提高细胞对格列卫的耐药性;用siRNA方法抑制Src激酶,24 h就可以抑制约47％的K562/G细胞增殖.结论:Src激酶在诱导K562细胞耐药中发挥重要作用,抑制Src激酶可以抑制细胞增殖,Src激酶可以成为治疗耐药的慢性粒细胞白血病的新靶点.     

Stathmin和CrkL蛋白在耐阿霉素的K562白血病细胞中表达上调

本研究应用蛋白质组学方法比较白血病K562细胞及其耐阿霉素的K562/A02细胞中蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白。利用荧光差异双向电泳（2D-DIGE）技术分离K562细胞及K562/A02细胞的总蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）对差异表达蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息,并用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果显示,经过DIGE技术和质谱分析,鉴定出8个蛋白质在耐阿霉素的K562细胞中表达有差异,其中2个表达下调,6个表达上调,它们分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导和基因转录等。在表达上调的蛋白中挑选Stathmin和CrkL蛋白,在K562及其耐药细胞株中进行了蛋白免疫印迹实验,结果与双向电泳结果一致;实时荧光定量PCR显示,CrkL在mRNA水平变化与在蛋白质水平变化一致,而Stathmin在mRNA水平变化与蛋白质水平变化不完全一致。结论：白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱有差异,Stathmin和CrkL蛋白可能与耐药有关,值得进一步探讨。     

甲状腺激素T3影响K562细胞转铁蛋白受体和铁蛋白表达的分子机制研究

目的 探讨甲状腺激素T3对白血病细胞K562转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)表达的调控作用及其可能的机制。方法 采用流式细胞术和放射免疫法分别检测TfR和Fn的表达水平，用RNA/蛋白带移动分析法测定铁调节蛋白(IRP)与铁反应元件(IRE)的结合活性。应用RT—PCR方法半定量分析TfR和Fn的mRNA水平。结果 T3对K562细胞TfR的表达无明显作用，而以不同浓度的T3处理细胞后使Fn的表达增加，其中当T3为100nmol/L和200nmol/L时，与空白对照组相比，差异有显性(P＜0．05)。T3能减少IRP/IRE的结合活性，且以T3为50nmol/L时减少最为明显。不同浓度的T3在不同的作用时间内均能提高H—FnmRNA水平，而对TfRmRNA水平无显影响。结论 T3可增加细胞Fn的表达，而对TfR的表达无明显调控作用，其机制除包含转录后的调节外，可能还具有转录水平的调控作用。     

柔红霉素对K562细胞凋亡的影响

目的 研究柔红霉素(DNR)对白血病K562细胞细胞凋亡的影响.方法 对数生长期K562细胞随机分A、B两组,A组(对照组):加RPMI-1640培养液;B组 (DNR组):分别加DNR0.2、2、20 μmol/L分别作用1 、2 、6 、24 h后,用流式细胞检测术检测K562细胞的凋亡率.结果 在没有药物的作用下,K562细胞存在自然凋亡.DNR组: 0.2 μmol/L分别作用1、2、6、24 h,细胞凋亡率与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05);2 μmol/L作用于K562细胞1 h,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);作用2、6、24 h,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01);20 μmol/L作用1、2、6、24 h,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01).结论 DNR能促进K562细胞凋亡,并存在剂量、时间依赖性.