血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α（HIF-1α）促血管内皮祖细胞（EPCs）成血管活性的可行性。方法密度梯度法分离人外周血EPCs，电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs，RT-PCR法观察未转染／转染质粒在转染后3、12、20、72h，HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达含量的变化；免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异；ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶（eNOS）含量的改变。结果HIF-1α基因有效转染入EPCs；HIF-1α mRNA在未转染时即有表达，在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72h，含量较未转染时增加（P〈0．05）；HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调（P〈0．05）。Flk一1蛋白在常氧下有一定含量，在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加。VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加（P〈0．05）；HIF-1α诱导eNOS含量增加，并与时间、VEGF刺激量成正比。结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs，促进其下游靶基因及受体表达，引起相应的功能学改变，促EPCs向内皮细胞分化、扩增，可进一步应用于基因治疗。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及与活性测定

目的：探讨人血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法：制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞，收获转染后24h至6d的转染上清和细胞，采用RT－PCR技术，免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达，用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165，其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖，具有很强的生物活性。结论：VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

缺氧诱导因子及其抑制因子调控肾癌细胞生长的实验研究

目的 检测缺氧诱导因子抑制因子（FIH-1）在肾癌细胞中的基因和蛋白表达情况,以进一步了解FIH-1对肾癌细胞生长调控的机制。方法 选取人肾癌细胞株786-0及OS-RC-2,运用real-time PCR（RT-PCR）和Western blot方法检测细胞株中FIH-1、缺氧诱导因子1α（HIF- 1α）、 缺氧诱导因子2α（HIF- 2α）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。并人工构建FIH-1过表达质粒,将其转入上述的两种细胞株中,运用RT-PCR和Western blot方法观察转染后FIH-1、HIF及VEGF的表达情况;同时运用MTT方法分析转染后两种肿瘤细胞的增殖情况。结果 RT-PCR和Western blot检测结果都显示,786-0和OS-RC-2细胞中都能检测到FIH-1和VEGF的表达;OS-RC-2细胞中同时存在HIF-1α和HIF-2α表达,而786-0细胞中只有HIF-2α的表达;786-0细胞中FIH-1表达比OS-RC-2细胞高,VEGF的表达比OS-RC-2低; 转染FIH-1过表达质粒后,OS-RC-2细胞内的FIH-1表达量明显升高,下游蛋白HIF-1α的表达量降低,VEGF的表达量也降低,而HIF-2α的表达量前后不变;在786-0细胞内的FIH-1表达量明显升高时,HIF-2α的表达量不变,VEGF的表达量也不变。在OS-RC-2细胞中,转染FIH-1过表达质粒后细胞的增殖变缓,而786-0细胞的增殖则没有明显的变化。结论 在肾癌细胞中存在FIH-1/HIF-1α/VEGF信号通路,FIH-1反向调节HIF-1α的表达,HIF-1α正向调节VEGF的表达。在HIF-1α及HIF-2α都存在时,FIH-1可通过对HIF-1α调控影响HIF-1α下游基因表达,抑制肾癌细胞的增殖。     

低氧诱导因子-1α对毛囊细胞的作用

目的探讨外源性人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）在成纤维细胞中表达的可行性及其对毛囊周围细胞活性的影响。方法通过脂质体将含有HIF-1αcDNA的真核表达载体pcDNA3.0稳定转染成纤维细胞,应用RT-PCR及Westernblot方法检测HIF-1α在成纤维细胞中的表达,ELISA法检测转染细胞上清液中血管内皮细胞生长因子（VEGF）的表达,RT-PCR方法检测转染后细胞中成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。将该上清加入成纤维细胞及真皮鞘细胞中,MTT法检测加入上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。结果RT-PCR及Westernblot可检测出转染后细胞中HIF-1α的表达,MTT检测加入转染上清后成纤维细胞及真皮鞘细胞活性增强（P〈0.05）,并且该上清液VEGF的表达显著高于未转染组（P〈0.01）。转染后成纤维细胞的bFGF的mRNA表达显著高于未转染组（P〈0.01）。结论应用脂质体能够成功地将外源性人HIF-1α基因转染成纤维细胞,并进行有效表达,其表达的HIF-1α可增强细胞活性且可诱导转染细胞上清液中VEGF的表达,并增加bFGF的mRNA表达,且转染细胞上清可增强成纤维细胞及真皮鞘细胞活性。推测HIF-1α通过其下游因子VEGF及bFGF促进毛囊相关细胞的活性,为HIF-1α对毛囊作用的进一步研究打下了基础。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因修饰的兔骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性.方法制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VEGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VEGF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性.结果VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性.结论VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF.     

dn HIF-1对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用。方法将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较。结果重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05)。转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达。提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用。     

dn HIF-1α对宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的 研究抑制性缺氧诱导因子-1α(dn HIF-1α)对人宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响,探讨HIF-1α在SiHa细胞的血管生成、缺氧保护、凋亡、增殖过程中的作用.方法 将表达dn HIF-1α的重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染入SiHa细胞,采用免疫细胞化学法和Western Blotting检测dn HIF-1α转染SiHa细胞后其HIF-1α与血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化;CoCl2化学缺氧法处理细胞,MTT法测定细胞增殖情况,原位缺口末端标记法检测细胞凋亡情况.同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果 重组质粒pcDNA3.1-dn HIF-1α转染SiHa细胞后,其HIF-1α蛋白表达水平与其它两组相比差异无统计学意义,而VEGF蛋白表达水平有较明显的降低(P<0.05).转染dn HIF-1α的细胞,常氧培养和CoCl2诱导的化学缺氧条件下其增殖能力均低于其他两组(P<0.05),CoCl2处理后细胞凋亡增加,与其他两组相比,差异具有统计学意义(P<0.05).结论 dn HIF-1α抑制SiHa细胞的增殖并促进CoCl2化学缺氧引起的细胞凋亡,同时能降低VEGF蛋白的表达.提示dn HIF-1α可望在宫颈癌治疗中发挥作用.     

雷帕霉素对缺氧条件下 Hep-2细胞增殖及 VEGF、HIF-1α表达的影响

目的：探讨雷帕霉素对缺氧条件下人喉癌Hep-2细胞增殖及VEGF、HIF-1α表达的影响。方法：在缺氧条件下,采用MTT法检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理12、24、36、48、60、72 h后Hep-2细胞的增殖活性,ELISA检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理24 h细胞培养上清液VEGF蛋白含量的变化,Western blot 检测0、5、10、20 nmol／L雷帕霉素处理16 h细胞HIF-1α蛋白表达的变化。结果：缺氧条件下雷帕霉素对Hep-2细胞仍具有明显的增殖抑制作用,且呈浓度和时间依赖性（F浓度＝253．132,F时间＝213．945,P＜0．05）。缺氧条件下雷帕霉素可抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达（F＝7．045、16．218,P＜0．05）。结论：雷帕霉素可抑制缺氧条件下Hep-2细胞的增殖,其机制可能与抑制Hep-2细胞VEGF的分泌及HIF-1α蛋白的表达有关。     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(HIF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性.方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变.结果HIF-1α基因有效转染入EPCs;HIF-1αmRNA在未转染时即有表达,在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P＜0.05);HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P＜0.05).Flk-1蛋白在常氧下有一定含量,在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加.VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加(P＜0.05);HIF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比.结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗.     

重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α转染大鼠内皮祖细胞

目的：研究含缺氧诱导因子（HIF-1α）及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒（Ad-EGFP/HIF-1α）感染大鼠内皮祖细胞（EPCs）的可行性.方法：采用percoll密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓单个核细胞,VEGF,bFGF,EGF诱导培养,观察其形态学变化,免疫细胞化学染色鉴定其表面抗原.Ad-EGFP/HIF-1α在HNK293细胞中进行扩增,之后转染体外培养的EPCs,分别于24,48,72,96h采用倒置荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）情况.MTT检测细胞生长活性;流式细胞术检测转染率并用RT-PCR法测定HIF-1α在EPCs中的表达.结果：倒置荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光,随着时间的延长,绿色荧光逐渐增多.MTT法检测细胞在24,48,72,96h的存活率分别为99.83%,99.70%,99.32%,99.57%;流式细胞仪计数随时间的延长,转染率逐渐升高,24,48,72,96h的转染率分别为23.05%,45.94%,78.91%,85.64%.RT-PCR可检测到被感染细胞HIF-1α的表达.结论：重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α能够有效地感染EPCs,转染后在mRNA水平可检测到EPCs中有HIF-1α的表达,并对EPCs活性无明显影响,为进一步研究转基因的EPCs移植促血管新生奠定基础.     

tPA和VEGF165基因共表达质粒对人血管细胞增殖的影响和纤溶作用

目的：观察组织纤溶酶原激活物（tPA）和血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）基因共表达质粒在血管平滑肌细胞（VSMC）中的表达,并研究表达产物对血管内皮细胞（VEC）和VSMC增殖的影响和纤溶作用。方法：用脂质体转染法将tPA和VEGF165的共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC,逆转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附实验（ELISA）分别从mRNA水平和蛋白质水平检测tPA和VEGF165的表达;纤溶蛋白板法检测转染基因的VSMC培养基中tPA的纤溶活性;取转染pBudCE4.1/tPA-VEGF165质粒的VSMC培养基培养VEC和VSMC,用四甲基偶氮唑盐（MTT法）和流式细胞技术检测转基因VSMC的细胞培养基对VEC和VSMC增殖的影响。结果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165转染VSMC后,RT-PCR和ELISA检测发现,tPA和VEGF165在mRNA和蛋白质水平均有表达;转基因培养基有明显促进纤溶和促VEC增殖作用,而对VSMC增殖无作用。结论：tPA和VEGF165基因共表达质粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表达有生物学活性的tPA和VEGF165,为tPA和VEGF165基因转染防治移植心脏内血管狭窄奠定了基础。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

shRNA抑制survivin基因表达对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响

目的：研究靶向存活素（survivin）的短发夹 RNA真核表达质粒（shRNA）对脐静脉血管内皮细胞增殖与凋亡的影响。方法合成靶向survivin的shRNA真核表达质粒及阴性对照质粒,用脂质体法将质粒转染至经 VEGF（50 ng／mL）处理的HUVEC细胞;转染48 h后,采用实时定量聚合酶链反应（PCR）和蛋白印迹法检测 HUVEC中survivin的mRNA表达及蛋白水平。四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖;TUNEL 法检测细胞凋亡。结果（1）survivin‐shRNA 质粒试验组与阴性对照shRNA质粒组及空白对照组比较,转染48 h后人脐静脉血管内皮细胞survivin的mRNA及蛋白表达水平明显下降（P＜0．05）。（2）与阴性对照shRNA组及空白对照组比较,转染后的人脐静脉血管内皮细胞增殖能力明显下降。转染后24、48、72 h生长抑制率分别为（13．53±3．91）％、（38．97±1．82）％、（65．75±1．83）％,于转染后72 h最为显著。（3）试验组凋亡率为（28．07±1．71）％,较阴性对照组（11．45±1．52）％和空白对照组（10．04±1．46）％显著增高（P＜0．05）。结论靶向survivin的shRNA质粒能通过下调survivin表达,进而抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖并促进其凋亡。     

VEGF基因在兔骨髓基质细胞中的表达及活性测定

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子(VECF)基因修饰的免骨髓基质细胞对VEGF基因的表达及表达产物的生物学活性。方法 制备真核表达质粒pAdCMV-VEGF165,以Superfect转染试剂介导VFGF基因转染兔骨髓基质细胞,收获转染后24h至6d的转染上清和细胞,采用RT-PCR技术、免疫组化SABC法检测转染细胞中外源性VECF165基因的转录及表达,用血管内皮细胞增殖试验测定转染细胞培养上清中VEGF的生物活性。结果 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效转录VEGF165,其分泌于培养上清中的表达产物可促进血管内皮细胞增殖,具有很强的生物活性。结论 VEGF基因转染的兔骨髓基质细胞可有效表达具有生物活性的VEGF。     

腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察突变体HIF-1α基因在体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内的表达以及对其增殖的影响.方法 以LacZ为对照,用野生型HIF-1α、单突变体HIF-1α564和双突变体HIF-1α564 803转染体外培养的大鼠VSMCs,Western blot测定HIF-1α蛋白表达:MTS/PES法确定大鼠VSMCs的增殖状态.结果 Western blot结果显示以LacZ组的密度扫描结果为1,HIF-1α564(3.284±0.582),HIF-1α564 803(4.026±0.445)与野生型HIF-1α(2.429±0.765)相比差异有显著性(P＜0.05),HIF-1α564与HIF-1α564 803组之间差异无显著性(P＞0.05).MTS/PMS比色结果显示:转染的第1天HIF-1α(0.242±0.020),HIF-1α564(0.234±0.021),HIF-1α564 803(0.223±0.020)3组均可抑制VSMCs增殖,与对照LacZ组(0.256±0.020)相比差异有显著性(P＜0.05),但是各组间差异无显著性(P＞0.05).转染第3,5,7天HIF-1α564,HIF-1α564 803组较HIF-1α组相比,差异有显著性(P＜0.05),尤以HIF-1α564 803组抑制大鼠VSMCs增殖能力最显著(P＜0.05).第7天HIF-1α564 803组Hoechst 33258与TUNEL双重荧光染色提示大鼠VSMCs发生了凋亡.结论 腺病毒介导的突变体HIF-1α基因能抑制大鼠VSMCs的增殖,突变体较野生型HIF-1α抑制作用更强,且双突变体HIF-1α564 803能诱导大鼠VSMCs发生凋亡.     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞对慢性肾衰竭大鼠血管新生的影响

目的：探讨血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor , VEGF）基因转染骨髓间充质干细胞（ mesenchy-mal stem cells,MSCs）对慢性肾衰竭（chronic renal failure, CRF）大鼠肾小球内皮细胞修复和血管新生的影响。方法体外分离、培养大鼠MSCs,Ad5-hVEGF-EGFP转染MSCs并观察转染对细胞增殖,分泌VEGF的影响。50只雄性SD大鼠按数字表法随机分为假手术组、慢性肾衰竭组、MSCs移植组、Ad-VEGF注射组和VEGF基因转染的MSCs移植组,每组10只。采用分阶段5／6肾切除术制备大鼠慢性肾衰竭动物模型。假手术组与慢性肾衰竭组于切除右肾之前从该侧肾动脉注射不含血清的改良杜氏伊格尔（DMEM）培养液,其余3组分别给予MSCs,Ad-VEGF和VEGF基因转染的MSCs。8周后检测各组大鼠肾功能,并用免疫组化检测肾小球CD31表达情况。结果 Ad5-hVEGF-EGFP转染后对MSCs细胞增殖无影响,转染后分泌VEGF蛋白较空质粒转染组明显增加（P＜0.05）。 MSCs移植组和VEGF基因转染的MSCs移植组血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）均较慢性肾衰竭组降低（P＜0．05）;与MSCs移植组比较,VEGF基因转染的MSCs移植组Scr和BUN降低更显著（P＜0．05）。慢性肾衰竭组肾小球中CD31表达较假手术组显著降低（P＜0．05）,应用MSCs和VEGF165基因转染的MSCs干预后肾小球中CD31表达有所增加,VEGF基因转染的MSCs组增加更明显（P＜0．05）。结论慢性肾衰竭大鼠给予转染VEGF基因的MSCs移植后毛细血管内皮细胞数量增多,肾脏功能改善;其作用可能与基因转染增加VEGF表达及有利于肾小球毛细血管内皮修复、血管新生有关。     

VEGF165和VEGF121在MC3T3-E1细胞中的表达及生物学功能

目的：构建一个能在MC3T3-E1细胞中稳定表达，并具有生物学活性的VEGF165和VEGF121基因表达载体。方法：采用RT—PCR技术从HL-60细胞中扩增人VEGF165和VEGF121基因，将获得的基因定向插入pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，测序正确后用脂质体将表达质粒转染入MC3T3-E1细胞。细胞经G418加压有限稀释筛选，采用ELISA法、Western blot法及免疫荧光法检测VEGF蛋白表达，并用MTT法检测表达的蛋白对血管内皮细胞株（HUECV304）的增殖活性影响。结果：通过基因测序表明获得的yEGF165和VEGF121与GeneBank登录的序列一致，构建的质粒分别为VEGF165／pcDNA3．1（＋）质粒和VEGF121／pcDNA3．1（＋）质粒，ELISA及Western blot检测结果均表明VEGF165和VEGF121基因转染MC3T3-E1后能在细胞中稳定表达，表达产物能明显促进HUECV304细胞生长。结论：基因转染的MC3T3-E1细胞能稳定、高效表达具有生物学活性的VEGF165和VEGF121重组蛋白。     

AKT对低氧模型细胞的促增殖作用

目的验证转染丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT/PKB)基因对缺氧损伤内皮细胞的生物学作用。方法首先构建人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氯化镍(NiCl2)模拟低氧模型,Western blot检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达以鉴定模型是否构建成功。然后,分别转染血管内皮生长因子(VEGF)、AKT及两种基因联合转染模拟低氧模型。继续培养转染后细胞1、2、3、4d,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验检测细胞增殖率。结果转染VEGF组、转染AKT组、转染VEGF与AKT双质粒组细胞增殖能力较单纯NiCl2组(模型组)均有增高,转染AKT组高于单独转染VEGF组,转染VEGF与AKT双基因组最高。结论转染AKT基因能够促进缺氧损伤的内皮细胞增殖,单独转染AKT比单独转染VEGF的作用强,同时转染AKT、VEGF促内皮细胞增殖作用最强。     

蜂毒素对骨肉瘤Saos-2细胞系HIF-1α及VEGF表达的影响

目的：研究低氧条件下蜂毒素（melittin）对骨肉瘤Saos-2细胞缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响,探讨蜂毒素抗骨肉瘤细胞血管生成的机制。方法：分别设空白对照组和低氧对照组,以及加入终浓度为2、4、8μg/ml的蜂毒素组;采用免疫印迹试验（Western—blot）检测细胞HIF-1α蛋白表达,逆转录RT—PCR检测HIF-1α和VEGFmRNA转录水平的变化。结果：与空白对照组比较,低氧对照组细胞中HIF-1α的蛋白表达及VEGF的mRNA表达均明显升高（P〈0．05）;蜂毒素组细胞的HIF-1α蛋白表达明显低于低氧对照组（P〈0．05）,并具有剂量依赖性;蜂毒素组细胞的VEGF mRNA水平明显低于低氧对照组（P〈0．05）,且有剂量依赖性。结论：模拟的低氧条件可以诱导骨肉瘤Saos-2细胞系中HIF-1α通路的激活;蜂毒素通过抑制HIF-1α蛋白水平的表达、影响其通路中下游基因VEGF mRNA水平的表达而抑制骨肉瘤Saos-2细胞中低氧诱导的HIF-1α通路的激活。由此推断蜂毒素可能通过此途径抑制骨肉瘤血管的生成,达到抗肿瘤的效果。