PTPeta介导生长抑素对SMMC7721生长抑制作用的实验研究

目的:采用生长抑素抑制人肝细胞肝癌细胞株SMMC7721增殖,检测细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶eta(PTPeta)的表达情况,观察使用正钒酸钠抑制PTPeta活性后肿瘤细胞增殖变化。方法:应用免疫荧光/RT-PCR法检测SMMC7721细胞中PTPeta的表达;RT-PCR、MTT法检测生长抑素作用后及正钒酸钠抑制PTPeta活性后,PTPeta的表达变化及肿瘤细胞增殖变化。结果:SMMC7721细胞中PTPeta表达为阳性,并定位于细胞壁;生长抑素作用后SMMC7721细胞内PTPeta表达增加,细胞增殖受抑,正钒酸钠可取消这一作用。结论:PTPeta在SMMC7721细胞中表达,并介导生长抑素对SMMC7721细胞生长抑制作用。     

干扰素γ诱导肝癌HepG2细胞表达B7分子的实验研究

目的研究干扰素γ(IFN-γ)对人肝癌细胞B7分子表达的影响。方法选用人肝癌HepG2细胞进行体外培养,经过不同浓度的IFN-γ干预后,采用MTT法检测细胞增殖作用,RT-PCR检测B7-1和B7-2mRNA的表达。结果不同浓度的IFN-γ对HepG2细胞体外生长有明显抑制作用;干预后HepG2细胞的B7基因表达明显增加。结论IFN-γ能直接抑制HepG2细胞增殖,显著上调HepG2细胞B7基因的表达,具有一定的抗肿瘤效应。     

葛根素对γδT细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的影响

目的探讨葛根素对人γδT细胞杀伤肝癌SMMC-7721细胞的影响及机制。方法异戊烯焦磷酸法(isopentenylpyrophosphate,IPP)体外扩增人外周血γδT细胞,不同浓度葛根素作用于γδT细胞24,48,72 h,CCK8法检测葛根素对γδT细胞增殖率的影响,FCM检测γδT细胞穿孔素(perforin,PFP)、颗粒酶B(granzyme B,Gra B)及CD107a的表达情况,LDH释放法检测γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性,Western blot法检测γδT细胞中P-ERK1/2和Bcl-2的表达情况。结果葛根素作用人γδT细胞48 h后,葛根素1.6~100μmol·L?1浓度组的γδT细胞增殖明显(P<0.05),葛根素12.5~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞PFP、Gra B及CD107a表达明显高于对照组(P<0.05),葛根素3.125~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞P-ERK1/2和Bcl-2表达显著增高(P<0.05),且葛根素3.125~50μmol·L?1浓度组人γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞杀伤活性较对照组明显增强(P<0.05)。结论葛根素能够促进人γδT细胞增殖,并能够提高γδT细胞对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤活性,其机制可能与上调γδT细胞表面的PFP,Gra B和CD107a的表达及活化P-ERK1/2和Bcl-2的表达有关。     

人乳腺癌B7-H3分子的高表达及其抑制T淋巴细胞活化增殖作用的机制

目的 探讨乳腺癌组织及细胞中高表达协同刺激分子B7-H3对T淋巴细胞作用的机制.方法 RT-PCR及流式细胞仪方法分析乳腺癌组织及细胞中B7-H3基因的高表达,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,采用脂质体法转染乳腺癌细胞株MCF-7.采用免疫荧光标记和流式细胞术分析在MCF-7细胞上的表达.继而,利用CCK8法和酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析B7-H3基因干扰细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌.结果 乳腺癌组织和细胞中高表达B7-H3分子.成功通过RNAi技术构建低表达B7-H3基因乳腺癌细胞株.体外生物学功能分析表明,与转染空载体的MCF-7/mock细胞相比,B7-H3表达干扰细胞能有效增强T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌.结论 乳腺癌中高表达协同刺激分子B7-H3能有效逃避T淋巴细胞对其的作用和杀伤.     

慢性粒细胞白血病时NK及LAK细胞功能

各类恶性疾病患者自然杀伤(NK)细胞活性受抑已得到重复地证明。作者曾报告约50％缓解的慢性粒细胞白血病(CML)病人NK活性明显降低,淋巴因子如干扰素及/或IL-2能调节NK活性.淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞前体存在于几乎所有的淋巴样器官,LAK细胞易于在体外产生及扩张,能杀死广谱的肿瘤靶细胞,但有关CML病人LAK细胞活性的报告甚少。     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外扩增及生物学活性研究

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)是外周血淋巴细胞经多种细胞因子如γ-IFN、IL-2、CD3单克隆抗体等体外刺激、活化扩增出来的新型、广谱、杀瘤的免疫活性细胞，具有体外扩增能力强，杀伤活性高等优点而逐渐引起人们的研究兴趣。本实验通过对淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、CD3因子激活的杀伤细胞(CD3AK)、CIK细胞在体外培养。     

没食子酸诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡机制的探讨

目的探讨没食子酸(gallic acid,GA)抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖的作用,揭示其促凋亡的相关分子机制。方法体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,MTT法观察细胞在GA作用24、48、72 h后的增殖情况;用倒置显微镜观察细胞形态学的变化;透视电镜观察细胞内部结构变化;Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡;采用RT-PCR技术研究p53 mRNA的变化;应用Western blot法检测p53蛋白水平的表达。探讨GA对人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用及机制。结果剂量为6.25⁵0μmol·L-1GA作用SMMC-7721细胞48 h有明显的增殖抑制活性,引起核固缩、凝聚、碎裂,诱导细胞凋亡,并呈剂量依赖性;RT-PCR和Western blot结果显示,GA能升高p53 mRNA水平和p53蛋白表达。结论 GA可抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖,诱导凋亡,可能与其上调肿瘤相关抑癌基因p53有关。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的体内体外抗人肝细胞癌的作用

目的：研究Bcl-2蛋白的过表达对Trail诱导肝癌细胞凋亡的影响,以及Trail蛋白体内和体外对人肝癌细胞的杀伤作用。方法：克隆Trail基因并在大肠杆菌中表达Trail重组蛋白。检测Trail重组蛋白在体内和体外对肿瘤的杀伤作用。用台盼蓝拒染法检测细胞的凋亡率。将真核细胞表达质粒pcDNA3-Bcl-2转染到人肝癌细胞BEL－7404细胞中,并通过G418 400mg/L筛选得到Bcl-2蛋白稳定表达的细胞株。结果：重组蛋白Trail能够有效地杀死人肝癌细胞（包括BEL－7404,SMMC－7721,和BEL－7402等细胞）。在体外,过量表达的Bcl-2蛋白能抑制Trail重组蛋白对人肝癌细胞BEL－7404的杀伤作用。重组蛋白Trail能够有效地抑制人肝癌细胞BEL－7404在裸鼠中形成实体瘤。结论：在体内和体外,Trail重组蛋白能够杀死肝癌细胞,Bcl-2蛋白过表达可以抑制Trail重组蛋白对肝癌细胞BEL－7404的杀伤作用。Trail蛋白是一种潜在的肝癌治疗剂。     

源于健康人与乳腺癌患者CIK细胞的生物学特性及抗癌活性的研究

目的探讨健康人与乳腺癌患者CIK细胞在体外增殖能力及抗肿瘤作用的差异。方法分离健康人和乳腺癌患者外周血单个核细胞(PBMC)加入细胞因子,体外诱导CIK细胞,观察CIK细胞增殖能力,用MTT法检测其对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。结果与健康人CIK细胞相比,乳腺癌患者CIK细胞的增殖速度较慢,其最大增殖倍数低(P<0.05);健康人CIK细胞对乳腺癌细胞株(MCF-7)、肝癌细胞株(SMMC-7721)、肺癌细胞株(SPC-A-1)的杀伤活性明显高于乳腺癌患者来源的CIK细胞(P<0.05)。结论健康人CIK细胞的体外增殖力及对肿瘤细胞的杀伤活性均高于乳腺癌患者的CIK细胞。健康人CIK细胞对3种肿瘤细胞株均有较强的杀伤效果。     

TNF-α影响肝癌HepG2细胞表达B7-H1分子的研究

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人肝癌细胞B7-H1分子表达的影响。方法人肝癌HepG2细胞体外培养,经过不同浓度的TNF-α干预后,采用FCM检测细胞凋亡,RT-PCR检测B7-H1 mRNA的表达。结果不同浓度的TNF-α能促进HepG2细胞凋亡;干预后HepG2细胞的B7-H1基因表达明显增加。结论TNF-α能促进HepG2细胞凋亡,并且上调HepG2细胞B7-H1基因的表达。     

肿瘤坏死因子α对人肝癌细胞株SMMC-7721体外侵袭能力的影响

目的 探讨肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对人肝癌细胞株SMMC-7721体外侵袭能力的影响及其相关机制. 方法不同浓度TNF-α作用于人肝癌细胞株SMMC-7721后,采用Transwell试验检测细胞侵袭能力的改变,采用划痕标记荧光传输试验显示缝隙连接细胞通讯功能的变化,采用Western blot法检测连接蛋白32(Cx32)在细胞膜的表达. 结果 不同浓度TNF-α作用于人肝癌细胞株SMMC-7721后,Transwell试验显示细胞侵袭能力较对照组提高,且随TNF-α浓度增加而升高. 同时,缝隙连接细胞通讯功能减弱,细胞膜上Cx32的表达减少. 结论 TNF-α可能通过影响Cx32在细胞膜的表达及细胞通讯促进人肝癌细胞株SMMC-7721的侵袭能力.     

癌症的免疫生物疗法

一般认为生物疗法是癌症的第四种治疗方法。将原形淋巴细胞取出与IL-2共培养,不仅淋巴细胞的数量增加,而且产生淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK),LAK细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力。1986年从肿瘤中分离出一组细胞称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL_s),TIL_s已有激活的杀伤功能,其诱导肿瘤缩小作用比LAK细胞强50～100倍。用LAK/TIL细胞和IL-2对癌症患者进行的生物疗法仅在采取十分复杂的给药方案时,才使少数人的免疫应答能力提高。NCI一委员会最近临时批准将肿瘤坏死因子(TNF)或IL-2等的基因插入到从患者身上分离出的肿瘤细胞中,然后再将已改变的     

基因重组人白细胞介素21体外对NK细胞活性的影响

目的在原核系统中表达基因重组人IL-21,研究其在体外对NK细胞杀伤活性的影响。方法利用基因工程技术,获得人IL-21的编码基因,重组于表达载体pGEX4T-2中,转化E.coliDH5α进行诱导表达,纯化获得重组人IL-21,分别将0、10、20、40μg/L的IL-21与健康人外周血单核细胞共同孵育,改良的MTT法检测NK细胞对靶细胞K562的杀伤活性。结果在原核表达系统中成功表达了GST-IL-21的融合蛋白,一定剂量的纯化后IL-21(40μg/L)在体外具有增强NK细胞杀伤活性的作用。结论在大肠杆菌中表达的基因重组人IL-21在体外可增强NK细胞杀伤活性,为系统研究新型的免疫调节因子IL-21奠定基础。     

海洋真菌多糖(YCP)对小鼠淋巴细胞免疫功能的影响

目的研究海洋真菌多糖(YCP)促进小鼠淋巴细胞的免疫调节作用,探讨其抗肿瘤作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测YCP对淋巴细胞增殖的作用,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测白介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的含量,MTT法检测淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)的诱生及其细胞杀伤活性。结果YCP体外能显著提高淋巴细胞增殖反应;显著增加细胞上清液中IL-2和IFN-γ的浓度;与IL-2单独刺激相比,YCP体外能显著提高与IL-2协同诱导产生的LAK细胞对于NK不敏感的Hela细胞和NK敏感的K562细胞的杀伤作用。结论YCP能够增强小鼠脾淋巴细胞的免疫作用。     

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子在肝癌细胞7721中对多药耐药的调节作用

目的采用2种方法构建人肝癌多药耐药细胞模型,封闭其细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)(CD147)的表达,研究其生物学特性。探讨EMMPRIN在肝癌细胞中对多药耐药的作用。方法应用人肝癌细胞株7721,采用浓度梯度诱导法和高浓度阿霉素间接诱导法构建人肝癌多药耐药细胞模型(7721/Adm1和7721/Adm2细胞),应用RNAi技术封闭7721/Adm1和7721/Adm2细胞EMMPRIN的表达,构建封闭EMMPRIN的人肝癌多药耐药细胞7721/Adm1/RNAi和7721/Adm2/RNAi细胞。用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞技术检测EMMPRIN、细胞表面多药耐药基因(MDR-1)mRNA及其表达产物的表达水平。噻唑蓝(MTT)法检测上述各细胞的多药耐药性。结果 2种多药耐药模型可用于肝癌多药耐药研究。多药耐药细胞7721/Adm1和7721/Adm2中EMMPRIN,MDR-1的表达水平较7721细胞均升高,且增加了其对多种化疗药物的耐药性。而利用RNAi封闭EMMPRIN的7721/Adm1和7721/Adm2细胞可致MDR-1表达降低,增加了其对化疗药物的敏感性。结论 EMMPRIN是参与肝癌细胞7721多药耐药且为调节多药耐药的重要分子。     

人剪切修复基因XPD对肝癌细胞生长及ERG基因的影响

目的探讨人剪切修复基因XPD转染人肝癌细胞SMMC-7721后对细胞自身生长及癌基因ERG表达的影响。方法将XPD基因通过LipofectamineTM2000转染入人肝癌细胞SMMC-7721。实验分为4组,分别为重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD组(XPD组)、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组)、脂质体转染细胞SMMC-7721组(脂质体组)、肝癌细胞SMMC-7721无转染空白对照组(空白对照组)。分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot法检测各组细胞中XPD、ERG的mRNA和蛋白质的表达量,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力及流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。结果与其他3组比较,XPD组中的ERGmRNA及蛋白表达量显著降低,而XPDmRNA及蛋白表达量明显升高(P<0.01)。转染了XPD的肝癌细胞SMMC-7721,其细胞增殖活性(0.455±0.009)显著降低,细胞凋亡率(42.06±0.01)%明显升高(P<0.001)。结论 XPD基因可以抑制癌基因ERG的表达,明显降低肝癌细胞的增殖活力并提高肝癌细胞的凋亡率。     

小檗碱对LAK细胞杀HepG2活性的影响

目的：研究小檗碱对IL-2诱导LAK细胞增殖及杀HepG2活性的影响。方法：分离人外周血单核细胞,用IL-2诱导生成LAK细胞,采用自身配对设计分成两组：小檗碱组和对照组。培养第8天计数两组LAK细胞数,并按LAK∶HepG2比为40∶1、20∶1、10∶1,将两组LAK分别与HepG2共同培养,用MTT法分别作用在12 h和20 h时检测LAK的杀伤活性。结果：培养第8天小檗碱组LAK细胞数较对照组多（P〈0.01）;LAK∶HepG2比例为40∶1,作用时间12 h和20 h时,小檗碱组LAK杀伤活性均高于相应的对照组（P〈0.05）;LAK∶HepG2比例为20∶1作用时间12 h时,小檗碱组LAK杀伤活性高于相应的对照组（P〈0.05）;LAK∶HepG2比例为40∶1对照组12 hLAK的杀伤活性高于20 h的杀伤活性（P〈0.05）。结论：小檗碱能促进IL-2激活LAK细胞增殖且能增强LAK细胞的杀伤活性。     

肝癌的基因治疗

1.1 免疫基因治疗：主要集中在细胞因子治疗和基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗两方面。细胞因子治疗既将IL-2、IL-12、IFN等细胞因子和（或）共刺激因子B7等到导入免疫活性或肿瘤细胞，增强免疫活性细胞的抗肿瘤活性。使肿瘤局部细胞因子浓度增高、MHC类抗原分子表达增加、肿瘤细胞的免疫原性增强，有效激活肿瘤特异性免疫反应。Jamagin等将带有IL-12基因的单纯疱疹病毒载体直接注入Buffalo鼠孤立肝癌灶内。1周后，切除癌灶，同时经门脉注入10^6个癌细胞攻击，结果显示64％的小鼠没有出现复发灶或仅一个复发灶，说明IL-12能降低肝癌术后的复发。     

白细胞介素2免疫治疗癌症的现状与展望

从带瘤宿主中分离的淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞,经体外培养于白细胞介素2(IL-2)进行选择扩增后可作为肿瘤特异性杀伤细胞。动物实验和临床试验表明,将这些非主要组织相容性(MHC)限制的杀伤细胞过继转移到带瘤宿主,可使所选患者的癌症消退。本文详述了作者进行的LAK细胞的治疗研究,并指出如何能够提高迄今所取得的临床效益。     

IFN-γ、IL-12对B7-1转染肝癌细胞诱导T淋巴细胞活化的影响

目的探讨B7—1基因转染肝癌细胞与IFN-γ、IL-12联合在体外诱导T细胞活化的能力。方法酶联免疫吸附反应(ELISA)检测联合诱导瘤苗刺激淋巴细胞IFN-γ、IL-12蛋白合成及细胞表面CD4、CD8、CD25的表达。MTT法检测瘤苗对淋巴细胞增殖作用的影响。结果HepG2／B7—1细胞诱导淋巴细胞表达IL-2、IFN-γ,其蛋白质含分别为875pg／ml和1246pg／ml;而联合IL-12、IFN-γ后能进一步诱导IL-2、IFN-γ的蛋白质合成,较各自无细胞因子组明显提高(P＜0．05)。细胞表面CD4、CD8、CD25的表达显著增加。两者联合促进了淋巴细胞的增殖,在E／T=10：1时,较HepG2组明显增大。结论IL-12、IFN-γ增强经B7—1基因转染的肝癌细胞(HepG2／B7—1)诱导淋巴细胞产生IL-2、IFN-γ的能力;IL-12、IFN-γ可能通过调节B7—1分子的生物学活性影响其对T细胞的活化。