梅毒螺旋体Tp0319重组蛋白的表达及免疫活性研究

目的 克隆和表达梅毒螺旋体Tp0319基因,并对其表达产物进行免疫活性分析。方法 挑选并克隆出Tp0319免疫优势区基因,构建原核表达载体;诱导表达并纯化重组蛋白,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹法鉴定;用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔;间接ELISA法检测梅毒螺旋体参考血清及临床标本。结果 成功构建原核表达载体pQE32/Tp0319;高效表达和纯化出一相对分子质量约30 000的重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰兔,能刺激其产生高水平抗体滴度。Western印迹证明其能与梅毒患者血清发生特异性反应,阴性对照菌未见目的表达条带。间接ELISA法检测80份梅毒螺旋体参考血清（阴性、阳性各40份）,阳性和阴性结果的符合率均为100%。检测200份临床梅毒血清标本及200份正常人血清,结果与梅毒螺旋体明胶凝集试验相比,灵敏度和特异度分别为92.6%和100%,符合率为96%。结论 制备的Tp0319重组蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用奠定一定的基础。     

梅毒螺旋体Tp0453重组蛋白的表达纯化及免疫活性研究

目的表达梅毒螺旋体膜蛋白Tp0453(28-288 aa),纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0453重组蛋白在梅毒血清学诊断中的应用提供实验依据。方法通过生物信息学分析,挑选Tp0453抗原的优势表位,进行诱导表达;以W estern-b lot和间接ELISA法检测重组蛋白的免疫反应性;用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性。结果纯化后获得了相对分子量约为32×103的融合蛋白。W estern-b lot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;同时以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,检测梅毒诊断试剂参考血清,其阴阳性符合率均为100%。用纯化的Tp0453重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导其产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶1280以上。结论基因重组表达的Tp0453重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为进一步研究其在梅毒血清学诊断中的应用和其生物学功能奠定了基础。     

梅毒螺旋体TP0993重组蛋白的表达、纯化及免疫活性分析

目的 探讨梅毒螺旋体重组蛋白TP0993在梅毒血清学诊断中的应用价值.方法 通过生物信息学分析,获取TP0993基因序列,构建原核载体进行诱导表达;Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白,Western印迹检测其免疫抗原性,用重组蛋白直接注射免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.用纯化的TP0993重组蛋白包被微孔板,建立间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,检测临床梅毒患者血清和健康体检者正常血清,同时与梅毒螺旋体明胶凝集试验(TPPA)进行比较,根据重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况,评价重组抗原在梅毒血清学诊断中的应用价值.结果 成功构建PET-28a(+)-0993原核表达载体,经表达、纯化后获得相对分子质量约为34 000的重组蛋白;Western印迹检测显示该重组蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的TP0993重组蛋白免疫新西兰兔,能诱导新西兰兔产生特异性免疫应答.以重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法,对TPPA法检测的480份临床血清进行检测,与TPPA法比较ELISA法的灵敏度为88.3％,特异度为85.8％,ELISA法与TPPA法符合率为86.5％.结论 重组表达的TP0993蛋白具有较好的免疫活性,可作为梅毒血清学诊断的候选抗原之一.     

梅毒螺旋体Tp0844重组蛋白的表达、纯化及免疫反应性研究

目的 克隆、表达梅毒螺旋体重组蛋白Tp0844,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,筛选与宿主具有高反应性的Tp主要蛋白。 方法 通过生物信息学分析,获取Tp0844基因序列,构建原核载体进行诱导表达;Ni-NTA亲合层析柱纯化重组蛋白,Western印迹法检测其重组蛋白与梅毒阴阳性血清的反应情况。结果 成功构建PET-30a（+）-Tp0844原核表达重组体,经诱导表达后发现该重组体可高表达出可溶性的重组蛋白,经亲和层析纯化后获得了相对分子质量为43 000的重组蛋白;以梅毒IgG抗体阴、阳性血清为一抗,采用Western印迹法检测发现,Tp0844重组蛋白与梅毒阳性血清能发生明显特异反应,而与健康阴性血清未出现反应条带。 结论 可溶性重组表达的Tp0844蛋白具有较好的免疫反应性,可作为梅毒发病机制研究的候选抗原。     

梅毒螺旋体Tp0821基因的克隆、表达、纯化及免疫活性研究

目的 构建梅毒螺旋体(Tp)膜脂蛋白Tp0821的重组质粒,表达、纯化其相应蛋白,研究其免疫活性.方法 构建重组质粒pQE32/Tp082l,诱导表达其相应蛋白,以纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并测定其效价.建立间接ELISA法,检测80份梅毒参比血清、临床经FTA-ABS确诊的阳性血清各150份.结果 成功构建重组质粒pQE32/Tp0821,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白分子量与预期结果相符.将亲和层析后所获高纯度重组蛋白免疫新西兰兔,制备的多克隆抗体效价达1:6400.间接ELISA法检测梅毒参比血清、临床梅毒患者血清,与间接免疫荧光螺旋体抗体吸附试验(FTA-ABS)法比较,其灵敏度、特异度分别为92.6%和98.6%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 Tp0821重组蛋白具有较好的免疫活性,可用于梅毒血清学检测.     

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpG的克隆、表达、纯化及鉴定

目的 克隆、表达、纯化E型沙眼衣原体多形外膜蛋白（PmpG）,并鉴定其免疫原性。方法 用PCR技术扩增从E型沙眼衣原体中提取的PmpG基因片段,再将其定向插入到原核表达载体PET30a（+）中,构建重组表达质粒,将其转化入E.coli DH5α中,并用酶切分析、PCR扩增及基因序列测定等对重组质粒进行鉴定,诱导表达后用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,然后进行蛋白纯化,并免疫BALB/c小鼠鉴定其免疫原性。结果 PCR扩增出约1092 bp DNA片段,序列测定证实与基因库的E型沙眼衣原体一致;表达产物的相对分子质量为55 000,与预期分子量相符,Western印迹证实表达产物为特异性蛋白,纯化后的蛋白免疫小鼠获得抗原特异性抗体。结论 构建的PmpG原核表达载体在大肠杆菌中得到了表达,且具有免疫原性。     

梅毒螺旋体特异性抗原Tp0453及其截短蛋白的克隆、表达及活性检测

目的:克隆和鉴定梅毒螺旋体(Tp)特异性抗原Tp0453及其截短蛋白(Tp0453-s),并用梅毒患者血清检测抗原反应性。方法:PCR扩增Tp0453和Tp0453-s基因,分别构建重组表达质粒pGEX-6P1-Tp0453和pET-28a(+)-Tp0453-s,经测序鉴定正确后转染E.coli BL21(DE3),对表达产物进行SDSPAGE电泳和Western blot鉴定。用不同分期梅毒患者血清作为一抗,Western blot检测抗原反应性。结果:经鉴定,2个原核表达质粒均构建成功,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示2个蛋白大小与预期一致。Western blot检测显示2个蛋白均与梅毒患者血清特异性结合,而与非梅毒患者血清无交叉反应。结论:成功克隆、表达并纯化了Tp0453和Tp0453-s蛋白,2个蛋白均有良好的抗原反应性。     

D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3的克隆、表达、鉴定及其免疫原性初探

【摘要】 目的 获得D型沙眼衣原体质粒蛋白pgp3基因及其蛋白,并鉴定其免疫原性。 方法 PCR扩增目的基因,将其定向插入原核表达载体pGEX-6P-1中,连接产物转化入大肠埃希菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序、PCR鉴定。再将重组质粒转化入大肠埃希菌BL21并诱导表达,Western印迹鉴定目的蛋白,谷胱甘肽巯基转移酶（GST）磁珠纯化pgp3-GST融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫新西兰家兔,Western印迹检测抗体与pgp3蛋白的结合,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体效价。 结果 克隆目的基因序列长度为795 bp,与基因库中一致,Western印迹显示目的蛋白相对分子质量为54 000,并得到纯化蛋白。所得兔血清可识别pgp3蛋白,ELISA检测多克隆抗体效价达1 ∶ 25 600。 结论 成功表达具有强免疫原性的pgp3-GST融合蛋白,为进一步研究奠定基础。     

沙眼衣原体CT703蛋白原核表达及免疫原性鉴定

目的构建沙眼衣原体CT703原核表达质粒pGEX/CT703,在大肠杆菌BL21中表达CT703蛋白,并鉴定其免疫原性。方法从沙眼衣原体(chlamydia trachomatis,CT)L2血清型基因组中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出全长CT703基因,亚克隆到原核表达载体pGEX中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化到E.coli BL21感受态细胞中,IPTG诱导融合蛋白表达。融合蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA和Western blot实验检测CT703蛋白的免疫原性及免疫反应性。结果经酶切和测序鉴定,成功构建了原核重组表达质粒pGEX/CT703,IPTG诱导后,表达出相对分子量81kD的融合蛋白,Western blot检测免疫小鼠血清能与CT703蛋白特异性结合,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:32000。结论 CT703蛋白在大肠杆菌BL21中能有效表达,并具有较好的免疫原性。     

梅毒螺旋体体内诱生抗原Tp0462的表达鉴定及在临床血清学诊断中的应用评价

目的 筛选鉴定并评价梅毒螺旋体（Tp）体内诱生抗原Tp0462的临床血清学诊断价值。方法 提取Tp Nichols株全基因组,PCR扩增Tp0462,克隆构建重组质粒pET30a（+）?Tp0462,转化至E.coli Rosetta（DE3）菌,大量诱导表达重组蛋白Tp0462并纯化、鉴定。18只新西兰兔随机平均分为活Tp接种组、紫外线照射灭活Tp接种组和未接种对照组,接种后不同时间点抽血分离血清,用ELISA鉴定Tp0462蛋白的体内诱生性特点。ELISA法（Tp0462?ELISA）、梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）、梅毒初筛ELISA试验及快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）试验检测336份临床梅毒患者血清样本,初步评价该蛋白的诊断价值。结果 重组质粒Tp0462?pET30a（+）在E.coli Rosetta（DE3）中最适的表达条件为0.5 mmol/L IPTG,20 ℃,180 rpm摇床诱导培养4 h。活Tp接种组血清Tp0462特异性抗体水平从第2周起呈急剧上升趋势,至5周后趋于平稳,而灭活Tp接种组及未接种对照组血清Tp0462特异性抗体水平一直处于低水平。活Tp接种组Tp0462特异性抗体水平显著高于灭活Tp接种组及未处理组（P < 0.05）,而灭活Tp接种组与未处理组相比,差异无统计学意义（P = 0.256）。活Tp接种组、灭活Tp接种组Tp92抗体水平显著高于未处理组（P < 0.05）,而活Tp接种组与灭活Tp接种组差异无统计学意义（P = 0.127）。与TPPA相比,Tp0462?ELISA的灵敏度和特异度分别为91.7%和98.8%,符合率为95.2%,曲线下面积为0.997。Tp0462?ELISA与梅毒初筛ELISA试验的符合率为92.3%,Kappa值为0.846;与RPR试剂盒的符合率为83.9%,Kappa值为0.293。结论 Tp0462在梅毒血清学诊断中具有较高的灵敏度和特异度,可以作为潜在的梅毒诊断候选蛋白。     

基于TP0136蛋白异质性建立一种新的苍白密螺旋体分子分型方法

【摘要】 目的 基于苍白密螺旋体属（TP）TP0136蛋白的异质性,建立一种新的TP分子分型方法。方法 从GenBank中查询9株梅毒苍白密螺旋体（TPA）、3株雅司苍白密螺旋体（TPE）、1株未分类的类人猿密螺旋体（FB）和1株地方密螺旋体（TEN）的TP0136开放阅读框（ORF）氨基酸序列并进行多重序列比对,得出TP0136蛋白分子分型结果。利用建立的TP0136蛋白分子分型方法,对2015年 1月至2018年12月南方医科大学皮肤病医院收集的23株TPA临床分离株进行分类,并将分型结果与传统的Arp/ Tpr/ TP0548三基因分型方法进行比较。结果 TP0136蛋白在不同种TP株中具有高度异质性,根据TP0136氨基酸序列,TPE、FB和TEN分为Ⅰ~ Ⅳ 4个亚型,TPA分为Ⅴ~ Ⅹ 6个亚型,TPA临床株分为Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ 4个亚型。通过TPA传统的三基因分型方法可将23株TPA临床株分为13D/d、14D/f、14D/g、15D/f、16A/e 5型。将TP0136分型法与传统分型法相结合,可将上述临床株进一步细分为10型,其中14D/f型应用TP0136分型法可进一步分为3个亚型。结论 TP0136分子分型方法可用于TP种的区分,有助于传统TPA分子分型的进一步完善。     

梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136不同亚型重组蛋白在神经梅毒患者血清诊断中的应用

 目的 探讨不同亚型梅毒螺旋体（Tp）黏附素蛋白TP0136在神经梅毒（NS）患者血液中的诊断价值。方法比较60例NS患者与120例非神经梅毒的梅毒患者（NNS）一般情况。通过分子克隆技术构建表达和纯化Nichols Seattle TP0136（NST）和Nichols Houston TP0136（NHT）重组蛋白,采用ELISA方法检查NS和NNS患者血清中NST和NHT抗体水平。结果NS和NNS患者两组之间年龄、性别、来源地、职业无统计学差异（均P>0.05）,而婚姻状况、神经系统症状、血清或血浆TRUST和TPPA 滴度、血清或血浆TP-IgM阳性率、脑脊液TRUST和TPPA 滴度均有统计学差异（均P<0.05）。NST在NS组和NNS组血清或血浆中抗体水平无差异（t=0.15,P=0.920）;NHT在NNS组血清或血浆中抗体水平高于NS患者,差异有统计学意义（t=3.68,P=0.021）。结论Tp黏附素蛋白TP0136重组蛋白NHT或可作为NS诊断的潜在血液学标志物。     

新西兰兔感染梅毒螺旋体体内扩散模型构建

【摘要】 目的 构建新西兰兔梅毒螺旋体感染体内扩散模型。方法 新西兰兔睾丸内复苏梅毒螺旋体标准株（Nichols）,并连续分离传代,收集第2代梅毒螺旋体菌株悬液接种于新西兰兔背部皮肤。感染21 d后麻醉处死新西兰兔,收集血液,无菌分离感染部位组织以及肝脏、脾脏、睾丸和淋巴结。荧光实时定量PCR检测各组织器官梅毒螺旋体扩散情况。结果 新西兰兔梅毒螺旋体感染后第21天所有接种部位均出现皮肤损伤（硬结和溃疡）,病理检查显示感染部位出现大量炎症细胞,主要包括浆细胞、巨噬细胞和淋巴细胞,实时定量PCR显示肝脏、脾脏、睾丸等组织器官存在大量梅毒螺旋体。结论 新西兰兔背部皮肤接种梅毒螺旋体后能通过血液和淋巴结扩散到肝脏、脾脏、睾丸等组织器官,成功构建新西兰兔梅毒螺旋体感染体内扩散模型。