嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段序列分析和比较

目的 分析和比较不同地区中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2区段的基因特征。方法 采用特异性ITS2引物对嗜人按蚊和中华按蚊江苏实验株以及从湖北省和越南现场捕获的嗜人按蚊和中华按蚊进行PCR扩增、克隆并对ITS2区段序列进行分析。结果 嗜人按蚊实验株的ITS2区段序列有452bp，与嗜人按蚊现场株的ITS2区段序列相同，中华按蚊实验株的ITS2区段序列有472bp，与中华按蚊现场株的ITS2区段序列也相同；但嗜人按蚊和中华按蚊的ITS2区段基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶位点。结论 可依据中华按蚊和嗜人按蚊的ITS2基因序列内限制性内切酶切位点不同的基因特征，采用PCR-RFLP技术建立中华按蚊和嗜人按蚊基因鉴别技术。     

我国嗜人按蚊和雷氏按蚊分类地位的探讨

我国嗜人按蚊和雷氏按蚊的分类地位虽经多次修订,其存疑问题迄今未获解决,蚊媒分子鉴别研究的发展为澄清问题提供了有利条件。本文综合国内外文献作历史性回顾评述,并根据分子鉴别研究新进展对我国嗜人按蚊和雷氏按蚊的分类地位和正确命名修订作探讨。     

PCR-RFLP技术用于鉴别赫坎按蚊复合体近缘种按蚊的研究

目的区别赫坎按蚊种团内近缘种.方法应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术,对辽宁省现场捕获的按蚊用特异性ITS2引物进行PCR扩增,限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ消化,琼脂糖凝胶电泳分析.结果中华按蚊的PCR扩增产物能被限制性内切酶RsaⅠ酶切成350 bp和200 bp两条酶切DNA条带;嗜人按蚊核糖体DNA(rDNA)的PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfⅠ酶切成410 bp的酶切DNA条带; 雷氏按蚊的ITS2基因PCR扩增产物能分别被限制性内切酶RsaⅠ和HinfⅠ酶切,分别显示350 bp和400 bp的酶切DNA条带;八代按蚊的PCR扩增产物没有显示明显的限制性内切酶RsaⅠ或HinfⅠ酶切条带.结论依据rDNA的ITS2区段基因特征建立的PCR-RFLP技术可用于鉴别赫坎按蚊种团的中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4个近缘种按蚊.     

一种简便的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别新技术

目的 建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内不同近缘种按蚊的基因鉴别技术。方法 依据赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊ITS2区段的基因序列特征设计特异性引物，建立一种能鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊的简便的PCR基因鉴别技术，并采用传统的形态学分类方法和新建立的基因鉴别技术对从辽宁、河南省以及在朝鲜现场捕获的按蚊分别进行了形态学和基因鉴别及比较。结果与结论 新建立的基因鉴别技术能准确鉴别赫坎按蚊种团内中华按蚊、嗜人按蚊、雷氏按蚊和八代按蚊4种近缘种按蚊。具有比传统的形态学分类方法准确，比已有的PCR-RFLP蚊种基因鉴别技术更简便、价廉和省时的特点。适用于不同的复合媒介地区的疟疾媒介调查和监测。     

用PCR-RFLP技术鉴别嗜人按蚊和中华按蚊的研究

目的　依据嗜人按蚊和中华按蚊rDNA的ITS2区段基因特征 ,建立一种新的嗜人按蚊和中华按蚊基因鉴别技术。方法　对不同地区的嗜人按蚊、可疑嗜人按蚊和中华按蚊样本通过采用特异性ITS2 引物PCR扩增 ,限制性内切酶RsaI和HinfI消化 ,以及琼脂糖凝胶电泳分析进行PCR -RFLP基因鉴别。 结果　不同地区嗜人按蚊rDNA的ITS2 基因PCR扩增产物能被限制性内切酶HinfI酶切 ,并显示一条 4 5 0bp的酶切DNA条带 ;中华按蚊的ITS2 基因PCR扩增产物则能被限制性内切酶RsaI酶切 ,并显示 4 0 0bp和 2 0 0bp两条酶切DNA条带 ;辽宁可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与嗜人按蚊相同而广东珠海可疑嗜人按蚊的PCR -RFLP结果与中华按蚊相同。结论　依据rDNA的ITS2 区段基因特征建立的PCR -RFLP技术可用于嗜人按蚊和中华按蚊的基因鉴别。采用该PCR -RFLP基因鉴别技术发现辽宁可疑嗜人按蚊的基因与中国大陆的嗜人按蚊属同种 ,而广东可疑嗜人按蚊的基因与中华按蚊属同种。     

海南岛按蚊的鉴定和迷走按蚊的进化研究

目的 阐明海南岛某些按蚊的分类地位,探讨迷走按蚊与其近缘种的亲缘关系. 方法 对采自海南岛8个地点的按蚊依据形态和分子特征进行鉴别研究,应用的分子特征包括核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)第2内转录间隔区(second internal transcribed spacer,ITS2)和28S第3编码区(third domain,D3)序列,综合分析迷走按蚊及其近缘种的ITS2和D3序列,构建系统发育树. 结果 本研究共鉴定按蚊407只,其中84.9％的成蚊分子鉴定与依据形态鉴定的结果一致.在228条迷走按蚊的ITS2序列中,部分个体在2个位点存在单碱基套峰(G/A),出现的频率分别为57.9％、64.8％,同时有两个套峰的占样本数的57.0％,其他位点保守.迷走按蚊的D3序列,在种内无碱基差异.结合本研究和文献的迷走按蚊及其近缘种ITS2序列构建的ML树,显示迷走按蚊与浅色按蚊MC/D亲缘关系近,与另一支的浅色按蚊B、圣代克按蚊复合体的亲缘关系较远.关于未订名种NBC (Anophelessp.NBG)的分类地位,依据分子特征鉴定其为浅色按蚊B,可能是圣代克按蚊复合体新的成员种.结论 鉴定形态在个体间变异大的种类时,客观的分子特征更具重要性,迷走按蚊与浅色按蚊MC/D具较近的亲缘关系.     

我国昆明按蚊与凉山按蚊rDNA-ITS2序列和形态比较及分类地位的探讨

[目的 ]论证昆明按蚊 (Anopheles kunmingensis)和凉山按蚊 (An. liangshanensis)的分类地位。 [方法 ]比较两种按蚊 r DNA- ITS2序列差异和主要形态特征的变化幅度。 [结果 ]两种按蚊 8个样本 r DNA- ITS2序列同源性为 97.1%～ 99.8%。昆明按蚊雌蚊翅 V5 .2缘缨白斑、后跗 基白环 (斑 )及幼虫头毛 2 - C具叉枝等特征出现率分别为 43% (9/ 2 1)、 89% (17/ 19)及 40 % (4/ 10 ) ,而凉山按蚊则分别为 79% (34 / 43)、 44 % (17/ 39)及 2 0 % (4/ 2 0 ) ;如以不同群体作统计分析 ,各特征出现率波动幅度很大 ,交叉重叠 ;表明两蚊种间缺乏明确与稳定的鉴别特征 ,缺乏实质性的形态差异。 [结论 ]两种按蚊形态特征和分子序列差异极小 ,应属种内变异范围 ,可以确认两者是同一蚊种 ,昆明按蚊为凉山按蚊的同物异名。     

大劣按蚊和斯氏按蚊核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊核糖体基因内转录第二间隔区（rDNAITS2）的基因特征。方法对大劣按蚊和斯氏按蚊ITS2基因进行PCR扩增，PCR产物进行限制性片断长度多态性分析（RFLP）和基因测序，并采用相关在线程序及软件进行序列分析。测序结果与GenBank数据库中其它传疟按蚊的ITS2序列进行多序列比对，构建分子系统树。结果大劣按蚊和斯氏按蚊的ITS2基因PCR产物经限制性内切酶Xho I消化，产生不同的酶切图谱；测序结果表明大劣按蚊和斯氏按蚊ITS2序列分别为715bp和466bp，且两种按蚊ITS2序列的GC含量和简单重复序列等特征存在明显差异，两者碱基差异水平为53．5％；分子进化树显示，大劣按蚊和斯氏按蚊形成单独的支系。结论大劣按蚊和斯氏按蚊ITS2基因具有不同的基因特征，其遗传多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关，为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

我国多斑按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的建立我国多斑按蚊复合体5成员种的分子鉴别方法。方法测定并分析各成员种的rDNA-ITS2序列,并设计种特异引物,应用PCR法鉴别。结果多斑按蚊复合体5成员种的ITS2序列长度和GC含量分别为伪威氏按蚊328bp、58.54％、多斑按蚊330bp、57.85％、威氏按蚊337bp、59.05％、达罗毗按蚊334bp、58.68％和塞沃按蚊338bp、57.69％,各种内的ITS2序列保守,而种间的差异率范围为9.7％～18.9％。应用5.8S引物和5个种特异引物可以分别扩增出119、186、231、327和406bp等5条清晰不同的种特异条带,以鉴别各蚊种。结论基于ITS2序列差异建立的我国多斑按蚊复合体5成员种的PCR鉴别简便易行、可靠。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法，对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测，并对已检测的标本随机抽取数个样本，进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中，中华按蚊占90．85％(586／645)、雷氏按蚊占5．27％(34／645)，无扩增条带的标本占3．88％(25／645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451bp，经Blast比对分析，显示与已公布的序列完全相同；3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊，其它成员种有待进一步证实。     

PCRRFLP单酶切法鉴别赫坎按蚊复合体的研究

目的建立一种新的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别技术,应用于现场按蚊样本的鉴别。方法用分子生物学软件Vector NTI 9.0,对赫坎按蚊复合体的嗜人按蚊、雷氏按蚊、中华按蚊、八代按蚊4个近缘种按蚊rDNA基因的ITS2区段序列进行限制性内切酶酶切位点预测分析,选择特异性内切酶,建立一种能同时鉴别4种近缘种按蚊的聚合酶链反应限制性片段长度多态(PCR RFLP)单酶切法鉴别技术,并对现场捕获的452只按蚊样本进行基因鉴别。结果软件预测赫坎按蚊复合体近缘种4种按蚊的rDNA基因的ITS2区段可被限制性内切酶Dde I切成大小易于区分的不同片段,PCR RFLP单酶切实验结果和软件预测结果完全吻合。4个疟疾流行区捕获的452只按蚊样本经PCR RFLP Dde I单酶切法鉴定有20只嗜人按蚊、6只雷氏按蚊、391只中华按蚊、35只八代按蚊,与形态学鉴别结果符合率为93.4%,与PCR RFLP双酶切法结果符合率为100%。结论新建立的PCR RFLP Dde I单酶切法基因鉴别技术可准确鉴别赫坎按蚊复合体,比传统的形态学鉴别更为简便、可靠,适合用于复合媒介地区的媒介监测。     

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的 对浙江省传疟媒介种类进行鉴定，以指导疟疾防治工作。方法 针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2（rDNAITS2）区段基因特征，应用PCR基因鉴别技术，对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果 浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp，与实验室中华按蚊标本一致。结论 中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介，现场调查未发现嗜人按蚊。     

山东省赫坎按蚊复合体成员种的分子鉴别研究

目的 进一步确认山东省赫坎按蚊复合体成员种。方法 采用鉴别PCR方法,对采自山东省8个地点经形态学初步鉴定的645只蚊虫进行检测,并对已检测的标本随机抽取数个样本,进行rDNA-ITS2序列测定。结果 645份样本中,中华按蚊占90.85％(586/645)、雷氏按蚊占5.27％(34/645),无扩增条带的标本占3.88％(25/645)。测定已鉴别的山东省中华按蚊、雷氏按蚊的ITS2序列长度分别为469bp和451hp,经Blast比对分析,显示与已公布的序列完全相同;3份无扩增条带标本的序列经核对为库蚊。结论 山东省分布的赫坎按蚊复合体成员种主要为中华按蚊、雷氏按蚊,其它成员种有待进一步证实。     

赫坎按蚊种群近缘种核糖体基因内转录第二间隔区序列分析

目的　分析赫坎按蚊种群内4个近缘种核糖体基因内转录第二间隔区(rDNAITS2)特征。　方法　采用特异性ITS2引物对中华按蚊和嗜人按蚊江苏实验株、辽宁省沈阳市和朝鲜开城现场捕获的嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2进行PCR扩增、基因测序和限制性内切酶酶切位点图谱分析。　结果与结论　赫坎按蚊种群近缘种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊和雷氏按蚊rDNAITS2分别为472、452、456和456bp,各基因序列存在明显差异并存在不同的限制性内切酶酶切位点     

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术，对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增，并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较，现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。     

四川省嗜人按蚊、中华按蚊的栖息习性和嗜血习性调查

目的　进一步了解嗜人按蚊和中华按蚊的栖息习性和嗜血习性及变化情况。　方法　选择不同类型栖息场所进行按蚊密度调查 ,在人房、牛房分别安装外逸窗阱观察蚊虫外逸情况 ,采取全捕法将人房、牛房、猪房内捕获的吸血蚊作胃血沉淀试验。　结果　人房、牛房、猪房中的嗜人按蚊密度分别为 3 .3 5、18.2 5和 9.3 8只 /人工小时 ;人房、牛房、猪房的嗜人按蚊平均数分别为 0 .63、9.5 5、1.68只 /间。人房、牛房及猪房中的中华按蚊密度分别为 2 .72、88.86、61.2 5只/人工小时 ;人房、牛房、猪房的中华按蚊平均数分别为 0 .3 2、3 3、3 .78只 /间。胃血沉淀试验 ,人房中的嗜人按蚊吸人血率为 94.5 7% (87/92 ) ,牛房为 5 .0 4% (6/119) ,猪房为 6.15 % (4 /65 )。中华按蚊吸人血率在人房、牛房和猪房分别为11.43 % (4 /3 5 )、3 .17% (2 /63 )和 0。　结论　嗜人按蚊和中华按蚊的主要栖息场所为牛房 ,其次为猪房和人房。嗜人按蚊主要嗜吸人血 ,中华按蚊则嗜吸其它动物血。     

西藏墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体种型鉴定

目的 鉴定西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体的种型。 方法 墨脱县捕获的5 190只按蚊经形态学鉴定为多斑按蚊复合体后,随机取575只,酚-氯仿法提取单蚊DNA作为模板,根据伪威氏按蚊、多斑按蚊、威氏按蚊、达罗毗按蚊和塞沃按蚊分别设计5对特异性引物,PCR扩增rDNA第二转录间隔区（ITS2）片段,进行种型鉴别。对目标片段进行测序、同源性比对,并运用MEGA（3.1）软件构建多斑按蚊复合体的系统进化树。 结果 575份DNA样本中有11份扩增出约231 bp的条带,即威氏按蚊（1.9%）;564份扩增出约119 bp的条带,为伪威氏按蚊（98.1%）。 PCR种型鉴定结果与同源性比对及系统进化树的结果一致。 结论 西藏林芝地区墨脱县疟疾流行区多斑按蚊复合体由伪威氏按蚊和威氏按蚊构成,伪威氏按蚊为优势蚊种。