不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性

目的 观察不同代数软骨细胞及其在支架上的生物学特性，为软骨组织工程提供理想的种子细胞，方法 将2周齿的新西兰大白兔软骨细胞置盖玻片上进行原代和传代培养，同时，把相应代数的软骨细胞种植于明胶海绵上，应用倒置显微镜和电镜观察不同代数细胞形态学变化和增殖能力。以及不同代数软骨细胞种植于支架后的生长和黏附情况，应用HE染色鉴别及免疫组化观察Ⅱ型胶原的分泌情况。结果 （1）软骨细胞在体外单层培养，传5代后细胞形态由多角形变成梭形，逐渐丧失表型。（2）第4代软骨细胞在单层培养时，增殖能力最强，分泌功能旺盛。（3）传代细胞贴壁时间短于原代。（4）第4代软骨细胞种植于支架上形成软骨细胞-支架复合体所需的时间最短，软骨细胞于海绵支架上的黏附最紧密。结论 软骨细胞在体外培养第4代左右可以作为组织工程的最佳种子细胞，其形成的软骨细胞-支架复合体的质量最佳，时间最短。     

几丁糖作为软骨细胞培养支架的实验研究

目的：探讨几丁糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法：采用几丁糖无纺网作为细胞培养支架,使用前首先用10%多聚赖氨酸包埋以增加其对软骨细胞的吸附性,然后把几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起进行体外培养,在倒置显微镜下观察几丁糖对软骨细胞生长的影响。结果：包埋后的几丁糖支架与软骨细胞一起体外培养10d,软骨细胞数目增加约6倍,并且与几丁糖支架牢固结合不易丢失。结论：几个糖无纺网经10%多聚赖氨酸包埋后,对软骨细胞吸附性增强,并且几丁糖具有良好的生物学特性,因此几丁糖符合组织工程对细胞培养支架的要求。有可能成为组织工程中一种良好的细胞培养支架。     

Cathepsin K在人软骨细胞体外培养去分化过程中的表达研究

目的通过基因芯片技术研究在体外培养的去分化人软骨细胞的基因改变，从中筛选出目标基因，并对其在各代软骨细胞中的表达进行研究。方法取体外培养的P1代和去分化的P4代软骨细胞进行8300点基因芯片的DNA微阵矩杂交，筛选出差异最明显的基因，并通过RT-PCR和Western-blot方法检测各代软骨细胞中该基因的表达水平。结果体外培养的P1、P4代软骨细胞间共140个基因差异表达，其中Cathepsin K基因表达差异水平最明显，P4与P1的比值平均为29．72，RT-PCR显示在596bp的条带处，随传代次数增加逐渐增亮，半定量分析P4／P1为3．21，差异有统计学意义（P〈0．05）。Western-blot检测显示在相对分子质量为40000的蛋白条带随体外传代蛋白浓度增加，灰度分析P4／P1为3．39，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论基质降解半胱氨酸蛋白酶Cathepsin K在去分化软骨细胞中表达强烈，提示其与软骨细胞去分化过程中的基质降解有关。     

软骨细胞在异体脱细胞软骨基质上的体外培养实验

目的 探讨脱细胞软骨基质对软骨细胞全外生长的影响。方法 以脱细胞异体兔耳软骨基质为支架材料，以脱细胞异体兔耳软骨膜为对照。体外种植兔耳软骨细胞进行常规培养，观察软骨细胞的生长状况和增殖情况。结果 软骨细胞进入脱细胞异体软骨基质构架裸露的空穴，生长旺盛。而在脱细胞异体软骨膜上，软骨细胞不易生长。结论支架材料的表面性状对细胞生长有显著影响，异体脱细胞软骨基质可提供适宜于软骨细胞生长的良好环境，有可能发     

软骨细胞培养的影响因素研究进展

体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况,但要维持正常表型则受到众多复杂因素的调控。这些因素的作用不是单一的,而是存在一个复杂的网络调节作用,它们之间复杂的相互作用需要去了解。本文就这些复杂的影响因素的研究进展作一综述。     

软骨细胞体外培养支架材料研究进展

软骨组织损伤后自身修复能力有限,组织工程构建对软骨缺损的修复意义重大,为功能软骨的修复提供了新希望,而软骨细胞体外培养支架的研究是重要一环.运用于骨组织工程的人工合成支架材料来源广、可批量生产、可控降解速度,力学强度好、易于塑形;天然支架材料亲水性强,细胞粘附性、生物相容性好;人工合成材料复合天然材料取各自所长,克服各自缺陷,支架性能提高.通过对材料表面进行修饰,可改善细胞与支架材料的相互作用.通过模拟细胞生长微环境,制备仿生材料,可提高材料的亲水性、对细胞的粘附性,促进细胞的分化增殖.纳米材料的出现为细胞体外培养支架的研究提供了新选择.该文就软骨细胞体外培养支架材料近年的一些新进展作一综述,并预测今后研究的主要方向.     

兔软骨细胞在可注射温敏型壳聚糖/聚乙烯醇凝胶中生长的研究

目的 探讨以壳聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)制备的可注射温敏型凝胶作为兔软骨细胞生长支架的可行性.方法 将壳聚糖和聚乙烯醇溶液混合制成温敏型凝胶,取第三代软骨细胞接种于凝胶支架,于接种后24、48和72 h采用MTT测定细胞活性及毒力;于1、2及3周后采用扫描电镜及共聚焦激光扫描荧光显微镜观察软骨细胞在凝胶中的形态及生长状态.结果 MTT结果显示接种细胞数量随着接种细胞生长时间的推移而明显增加,各组之间差异有统计学意义(P＜0.05).扫描电镜及激光共聚焦荧光显微镜观察表明软骨细胞在CS/PVA凝胶支架中生长良好.软骨细胞在凝胶支架中保持了很高的增殖能力,材料对细胞无明显不良反应.结论 壳聚糖/聚乙烯醇混合凝胶可作为兔软骨细胞培养的生长支架,应用于软骨组织工程.     

软骨细胞在异体脱细胞软骨基质上的体外培养实验

目的探讨脱细胞软骨基质对软骨细胞体外生长的影响。方法以脱细胞异体兔耳软骨基质为支架材料,以脱细胞异体兔耳软骨膜为对照,体外种植兔耳软骨细胞进行常规培养,观察软骨细胞的生长状况和增殖情况。结果软骨细胞进入脱细胞异体软骨基质构架裸露的空穴,生长旺盛。而在脱细胞异体软骨膜上,软骨细胞不易生长。结论支架材料的表面性状对细胞生长有显著影响,异体脱细胞软骨基质可提供适宜于软骨细胞生长的良好环境,有可能发展成为软骨组织工程的一种天然支架材料。     

软骨细胞在异体脱细胞软骨基质上的体外培养实验

目的探讨脱细胞软骨基质对软骨细胞体外生长的影响。方法以脱细胞异体兔耳软骨基质为支架材料,以脱细胞异体兔耳软骨膜为对照,体外种植兔耳软骨细胞进行常规培养,观察软骨细胞的生长状况和增殖情况。结果软骨细胞进入脱细胞异体软骨基质构架裸露的空穴,生长旺盛。而在脱细胞异体软骨膜上,软骨细胞不易生长。结论支架材料的表面性状对细胞生长有显著影响,异体脱细胞软骨基质可提供适宜于软骨细胞生长的良好环境,有可能发展成为软骨组织工程的一种天然支架材料。     

人负重关节软骨细胞的体外分离与培养

目的　研究人负重关节软骨细胞的分离培养技术。方法　对 10例手术切除的负重关节软骨进行0 2 %Ⅱ型胶原酶分离、10 %DMEM中培养 ,观察软骨细胞获得率、贴壁率、增殖状况及形态学改变。结果　① 0 2 %Ⅱ型胶原酶消化尽 2 0 0～ 70 0mg软骨标本需 4～ 14h ,细胞获得率 (1 82± 0 5 7)× 10 6/g ,存活率(79 4± 9 9) %。②细胞可传 6～ 12代 ,前 4代培养时间平均 (33± 10 )d ,生长倍数平均 198倍 ,倍增时间(4 13± 1 34)d。③第 3、4代细胞呈多角形、部分梭形 ,8、9代后细胞梭状铺平。结论　 30 0～ 5 0 0mg软骨标本 ,经该方法培养 3～ 4周后可达第 4代 ,细胞数可达 (0 6～ 1 0 )× 10 8个 ,可满足临床上修复 15～ 2 5cm2软骨缺损的需要。     

柱状分层的胶原-羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞体外培养

目的 观察具有柱状分层结构的胶原-羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）复合支架对软骨细胞的吸附作用及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性及价值。方法 以胶原复合HA逐层制备胶原-HA复合支架，体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原-HA复合支架材料上进行三维立体培养3周，通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。结果 胶原-HA复合支架为柱状，支架表层为胶原。平均孔径为147μm，孔隙率89％；中层为多孔胶原-HA复合；底层为HA，平均孔径为85μm，孔隙率85％。胶原-HA复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面24h后，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌细胞外基质，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论 具有柱状分层结构的胶原-HA复合支架其细胞相容性良好，较胶原纤维具有更强的力学性能，有望成为一种比较理想的软骨组织工程支架材料。     

关节游离体软骨细胞生物学特性的初步观察

目的观察关节游离体软骨细胞的生物学特性，寻找组织工程软骨种子细胞来源。方法分别取游离体软骨标本5例，正常软骨标本2例和骨关节炎软骨标本6例，组织学观察其细胞分布、尿嘧啶脱氧核苷末端转移酶介导的三磷酸脱氧核苷缺口标记法观察细胞凋亡，细胞分离培养观察原代软骨细胞形态，并进行比较。结果与正常软骨、骨关节炎软骨比较，游离体软骨细胞分布密度较高，细胞凋亡明显．体外培养时原代细胞已呈成纤维细胞样形态。结论游离体软骨细胞已具有成纤维细胞特性，不宜直接作为组织工程的种子细胞来源。     

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

人体肌卫星细胞培养的实验研究

目的 了解人体肌卫星细胞在体外培养条件下的生物学特性。方法 标本取自创伤病例的四肢骨骼肌,消化、提纯后,在生长培养液内培养10天,细胞生长至汇合后分化培养5天。倒置显微镜观察,绘制细胞生长曲线,计算细胞融合率,结蛋白免疫细胞化学方法（ABC）法鉴定肌卫星细胞。结果 细胞消化、提纯后纯度为90％。在生长培养液内肌卫星细胞分裂增生;在分化培养条件下,汇合状态的肌卫星细胞发生融合,形成肌管,分化培养24小时细胞融合率开始明显增加,分化72小时融合率达到高峰。结论 人体肌卫星细胞在适当的培养条件下可以增生、分化,形成肌纤维。结蛋白免疫细胞化学染色是早期鉴定肌卫星细胞的有效方法。     

明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠作为组织工程软骨支架的实验研究

目的探索明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架的制备方法和其作为组织工程软骨支架的可行性。方法光镜和扫描电镜观察-20℃、-80℃及液氮条件下冷冻抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠支架的孔径、孔隙率、交通孔和密度;测定不同条件制备的支架材料与正常软骨的压缩载荷-形变曲线;分离、扩增兔骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs),接种于不同条件制备的支架材料上培养,MTT检测MSCs在支架上的黏附率及多孔支架对细胞增殖功能的影响。结果在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料具有疏松多孔结构,孔径依次为300±45μm、230±30μm和45±10μm,孔隙率为81%、79%和56%,密度为9.41±0.25μg/mm3、11.50±0.36μg/mm3和29.50±0.61μg/mm3;-80℃和液氮条件下制备的支架材料,力学强度接近于正常软骨;MTT测得细胞在-20℃、-80℃及液氮条件下制备的支架材料,黏附率分别为85.0%、87.5%和56.3%;可轻度促进MSCs增殖。结论-80℃条件下抽真空干燥制备的明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠多孔支架,具有良好的孔径、孔隙率和抗压缩载荷能力,与MSCs具有较好的相容性,是软骨组织工程中的一种新型仿生支架材料。     

组织工程血管种子细胞培养的实验研究

目的：为血管组织工程的实验研究提供细胞来源，方法：分别采用消化法和和组织块法培养血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，并进行两种细胞的传代、纯化、鉴定以及形态学观察，结果：培养的两种细胞均符合血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的形态特征，结论：所培养的细胞可提供作进一步深入的血管组织工程的研究。     

以珊瑚转化羟基磷灰石为支架材料构建组织工程骨的实验研究

目的 探讨以珊瑚转化羟基磷灰石（CHA）作为骨组织工程支架材料的可行性。寻找最佳支架材料,为组织工程研究开辟新的途径。方法 取4周龄兔骨髓,分离骨髓基质细胞,体外培养,诱导分化为成骨细胞,胰酶消化后离心收集细胞,接种至高温灭菌的CHA材料,无菌条件下植入8只裸鼠皮下组织中,对照组为同体单纯植入CHA,分别于6、8周取材,行大体观察、X线摄征及组织学染色,观察新骨形成情况。结果 实验组6周时大体标本浅红色,X线片有较高密度阻射影像,组织学检查可见有新骨形成,8周时大体标本呈红色,质硬,X线阻射影像密度更高,镜下可见大量新骨形成并相互连接成骨小梁样结构。骨细胞位于陷窝中,对照组8周大体标本均为白色,周围软组织包裹,X线片仅见CHA阻射影。组织学检查无新骨形成,为大量纤维组织长入CHA孔洞内。结论 CHA可作为骨组织工程的支架材料,具有广阔的应用前景。     

人骨髓间质干细胞的优化培养

目的探索人骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的优化培养条件.方法应用不同条件,研究原代培养方法、接种密度、首次换液时间、培养基、血清浓度及种类对细胞生长的影响,并以选定的条件培养、扩增MSCs,扩增后向成骨细胞和软骨细胞诱导.结果在其它条件不变的前提下,密度梯度分离法优于全骨髓法,2.5×105/cm2是人MSCs原代培养的适宜接种密度,原代第5天首次换液为最佳换液时间,DMEM培养基优于α-MEM培养基,血清C为适宜的血清,10%为适宜的血清浓度.所选条件培养的MSCs可在体外扩增15代以上,形态保持不变,并具有良好的分化潜能.结论建立了人MSCs的体外优化培养条件,为其在组织工程方面的应用作出了新的探索.     

可降解聚合物在骨组织工程中的应用进展

目的 探讨理想的骨组织工程细胞外基质材料的选择和制备。方法 广州查阅了近期有关可降解聚合物作成骨细胞培养支架的文献,总结了各种可降解聚合物在骨组织工程研究中作为细胞外基质材料的优缺点。结果 理想的骨组织工程细胞外基质材料应由无机类材料、人工合成聚合物类材料和天然聚合物类材料组成,并含有最佳的生长因子缓释系统的多孔三维立体泡沫。结论 复合型细胞外基质材料的研制是骨组织工程研究中十分重要而迫切的任务。     

大鼠软骨细胞复制性老化的体外观察

目的对体外培养大鼠软骨细胞复制性老化行为进行观察,为进一步研究组织工程软骨退变机制,以及用药物干预并逆转其退变提供实验参考。方法4周龄SD大鼠,体重185～200g,断颈处死,分离培养软骨细胞,采用组织化学法检测传代培养的P1、P2、P3及P4代软骨细胞老化相关β-半乳糖苷酶,透射电镜观察细胞结构,免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达,阿力新蓝染色检测胞外基质硫酸糖胺多糖(sulfat-glycosaminoglycan,GAG)含量和分子结构,RT-PCR方法检测软骨细胞型胶原表达,流式细胞仪分析细胞周期及增殖指数(proliferative index,PI)。结果β-半乳糖苷酶检测:P1、P2代软骨细胞偶见阳性染色;P3代可见少数细胞阳性染色,与P1、P2代比较差异有统计学意义(P<0.01);P4代与P1～P3代比较,阳性染色显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。透射电静镜观察:P1、P2代细胞胞浆内细胞器较多,胞核及核仁清晰,无凋亡软骨细胞;P3代细胞核浆比较大,胞浆内细胞器减少,胶原网络结构模糊不清;P4代细胞核浆比例增大,核固缩。P4代细胞G0/G1期含量增加(83.8%),而P1、P2及P3代分别为79.1%,79.2%,80.8%。P4代细胞PI为16.2%,P1、P2、P3代PI分别为20.9%、20.8%、19.2%。PCNA表达、GAG含量、长链分子百分比、型胶原表达减少等指标P4代与前代比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论体外培养的大鼠软骨细胞P4代出现老化。