检测结核分枝杆菌两种不同方法的比较

目的比较实时荧光定量PCR法与细菌培养法检验结核分枝杆菌的能力。方法收集2013-2014年天津市某三甲医院痰涂片抗酸染色阳性肺结核患者的痰液标本200份,分别应用细菌培养法与实时荧光定量PCR法,对上述患者的痰标本进行检测。结果痰涂片抗酸染色阳性结核病患者的痰标本中,应用实时荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌的阳性率为58.5%,应用结核分枝杆菌培养法检测的阳性率为42.0%,差异有统计学意义(P0.05)。结论荧光定量PCR技术与细菌培养法尚不能取代痰涂片抗酸染色检测结核分枝杆菌。     

两种结核分枝杆菌快速检测方法的比较

目的比较荧光定量PCR检测和直接扩增检测两种方法对结核分枝杆菌检测的敏感性、特异性,及在国境口岸卫生检疫工作中的应用前景。方法应用结核分枝杆菌荧光定量PCR和直接扩增检测47份疑似或确诊活动性肺结核空腹痰标本,并与液体培养结果进行比较。结果荧光定量PCR法与直接扩增法对结核分枝杆菌检测敏感性分别为46.7%和100%,特异性分别为81.2%和84.4%。结论结核分枝杆菌直接扩增检测是一种较为敏感而特异的快速检测方法,在国境口岸卫生检疫部门具有重要的应用价值。     

PCR-荧光探针法快速诊断分枝杆菌属感染临床应用研究

目的探讨PCR-荧光探针法相对于传统分枝杆菌属培养及抗酸染色在辅助诊断分枝杆菌属感染中的应用价值。方法回顾性分析2013年2-10月北京协和医院563份送检标本采用PCR-荧光探针法检测结核/非结核分枝杆菌核酸,将其检测结果与培养及镜检结果进行比较。结果 563份不同临床标本PCR-荧光探针法检出分枝杆菌属阳性60份,阳性率10.66%,其中结核分枝杆菌(MTB)54株、非结核分枝杆菌(NTM)6株;培养和镜检检出阳性率分别为7.46%、7.64%,PCR-荧光探针法阳性检出率略高于传统培养及镜检方法,差异无统计学意义;PCR-荧光探针法将检出时间缩短至3h,且可以区分结核或非结核分枝杆菌,具有一定的优越性;以培养为金标准,PCR-荧光探针法阳性预测值为43.33%、阴性预测值为96.82%。结论 PCR-荧光探针法灵敏度高、操作简便、耗时短,可作为实验室辅助诊断分枝杆菌属感染的有效方法之一。     

荧光定量PCR在肺结核临床诊断及疗效评估中的应用

目的建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法,评估其在肺结核的t临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针,建立荧光定量PCR方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养法和抗酸染色法检测168份疑似肺结核和5例确诊病人随访的痰标本,比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果该荧光定量PCR法能扩增巧6l1O基因片段（107bp）,序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列,方法的检测灵敏度为4copies／反应;而对偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟茵的样本扩增结果均为阴性,荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64．29％（108／168）、35．12％（59／168）和12．50％（21／168）,前者高于后两者（P〈0．叭）。对抗酸染色法和集菌培养法阳性的样本,荧光定量PCR法的灵敏度分别为100．00％（21／21）和96．61％（57／59）。对20份非结核病人来源的痰标本．荧光定量PCR方法检测结果均为阴性,符合率为100．00％。用荧光定量PCR检测方法对5例活动性肺结核病例治疗期间进行了动态检测,结果显示病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势（即0值增加）。结论该荧光定量PER方法具有快速、敏感和特异性高的特点,可以快速、及时获取病人服菇詹的治府时票曲瞑辟的詹蛙督导妊井撂蚀饺摇臣者舌亚拍I性J妻音、;,     

2种核酸扩增荧光方法用于临床痰标本的结核分枝杆菌检测

目的 评价核酸恒温扩增实时荧光法与荧光定量PCR法检测临床痰标本结核分枝杆菌的效果.方法 收集疑似结核病患者的痰标本,分别进行痰标本染色显微镜检查、分离培养菌株鉴定、核酸恒温扩增实时荧光法及荧光定量PCR检测,以培养为金标准获得2种方法的灵敏度和特异性,并比较2种方法的检测效能.结果 收集322例疑似结核病患者样本,经...     

评估PCR-荧光探针法在临床标本诊断中的应用价值

目的评估PCR-荧光探针法在临床标本中快速检测结核分枝杆菌(MTB)和非结核分枝杆菌(NTM)的临床价值。方法收集贵阳市肺科医院2012年4月-2013年2月住院及门诊的2 403例患者送检标本,包括痰液、纤维支气管镜刷检物、胸水标本、脓性分泌物,对标本涂片抗酸染色检测,同时采用PCR-荧光探针法,即用双重PCR技术和Taqman探针技术相结合,提取患者标本中的分枝杆菌核酸进行定性检测,比较两者结果。结果 2 403例患者临床标本经萋尼抗酸染色涂片镜检阳性696例,抗酸染色涂片镜检阴性1 707例,其中非肺结核患者539例,菌阴肺结核患者1 168例;在696例涂片阳性的标本中,应用PCR-荧光探针法,MTB核酸阳性标本635例和NTM核酸阳性9例;1 707例抗酸杆菌涂片阴性标本中MTB核酸阳性264例和NTM阳性6例,539例非肺结核患者标本中检测出MTB核酸假阳性4例;MTB感染患者标本经抗酸染色涂片与PCR-荧光探针法检测,阳性率分别为37.3%及48.8%,即PCR-荧光探针法检测灵敏度较高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用PCR-荧光探针法可快速在临床标本中检测和区分MTB和NTM,具有较高的敏感性和特异性,值得在临床中推广应用。     

糖尿病合并结核感染诊断中结核分枝杆菌检测方法的比较

目的比较糖尿病合并结核感染诊断中四种结核分枝杆菌检测方法,包括金胺O荧光染色涂片法,BacT/ALERT3D快速培养法,噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR法。方法收集糖尿病合并结核感染患者的痰标本,分别采用上述四种方法进行结核分枝杆菌检测。结果涂片法、快速培养法、噬菌体法和PCR法的阳性率分别为27.5%,38.3%,36.7%和39.2%。结论在糖尿病合并结核感染诊断中,与传统的涂片法和培养法相比,噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR法检测结核分枝杆菌具有快速、敏感性高、特异性高等特点。     

分子信标荧光定量PCR法在结核病临床诊断中的应用

[目的]评价分子信标荧光定量PCR法检测临床标本中结核分枝杆菌的应用价值.[方法]分别采用分子信标荧光定量PCR法、抗酸染色法和集菌培养法检测272例肺结核临床标本,比较3种方法的检出率,分析有无差异.[结果]分子信标荧光定量PCR法的检出率显著高于抗酸染色法和集菌培养法,阳性率分别为66.91%、10.75%和43.01%.[结论]分予信标荧光定量PCR法检测临床样本中结核分枝杆菌具有快速、敏感和特异性高的特点,可为结核病的临床诊断提供一种快速、准确的病原学诊断手段,具有重要的临床意义.     

巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线检测奶粉中的结核分枝杆菌

目的建立一种PCR方法检测市售奶粉中是否存在结核分枝杆菌及其亚型。方法根据人型及牛型结核分枝杆菌硝酸还原酶基因启动子区215位上T-C的转换,以卡介苗菌液、人型结核分枝杆菌标准株(H37Ra)、人型/牛型临床分离株与奶粉混悬液混合物为标本,与商品化结核分枝杆菌基因荧光PCR定量试剂对比,设计建立巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线方法检测结核分枝杆菌及其亚型,并调查20种60批次品牌市售奶粉中是否存在结核分枝杆菌及其亚型。结果巢式荧光PCR特异性地检出结核分枝杆菌nar GHJI基因,其敏感性比荧光定量PCR可高1个数量级;人型及牛型结核分枝杆菌nar GHJI基因PCR产物的高分辨熔链温度分别为83.08℃±0.08℃和83.96℃±0.09℃,两者差异有统计学意义(P0.05)。结论成功建立巢式荧光PCR结合高分辨熔链曲线方法敏感、特异地检测分析结核分枝杆菌及其人型或牛型亚型,在调查的20种60批次奶粉中未检出结核分枝杆菌。     

口腔三用气枪煮沸消毒的实验研究

目的 评价煮沸消毒法对口腔科三用气枪的消毒效果. 方法 用乙型肝炎病毒及结核分枝杆菌对三用气枪进行污染,用煮沸方法对污染气枪消毒,用聚合酶链反应(PCR)荧光定量核酸扩增技术进行乙型肝炎病毒DNA及结核分枝杆菌的检测,评价消毒效果. 结果 对气枪煮沸消毒10 min,乙型肝炎病毒及结核分枝杆菌均无检出,消毒合格率均达100.0%,与消毒2、5 mim比较差异有统计学意义(P<0.01);消毒10 min和15 min对乙型肝炎病毒及结核分枝杆菌的灭菌效果差异无统计学意义;煮沸消毒10 min,生理盐水和血清中结核分枝杆菌与HBV DNA的阳性检出率均为0. 结论 煮沸消毒可达到与2%戊二醛浸泡消毒、高压蒸汽灭菌同样可靠的消毒效果,对口腔科三用气枪消毒,方法简单、有效.     

旋转式荧光定量PCR在临床应用中的价值

目的：探讨旋转式荧光定量PCR仪在检测临床标本中的应用价值。方法：通过旋转荧光定量-PCR技术鉴定1132株临床分离株,进行结核分枝杆菌的菌种鉴定和定量分析,同时进行抗酸染色和培养法。结果：总阳性检出率为48.64%,其中菌阳检出率为96.56%（253/262）,阴性符合率为77.85%（369/474）,菌种鉴定特异性实验符合率为100%。结论：旋转氏荧光定量PCR仪改进后更加快速、敏感,与其配套使用的试剂特异性强,是在检测结核分枝杆菌复合群的同时,又能进行非结核分枝杆菌鉴定辅助诊断的好方法。     

荧光定量PCR对血及痰培养物中结核分枝杆菌DNA的检测

目的 评价荧光定量PCR(FQ-PCR)检测血及痰培养物中结核分枝杆菌的临床价值.方法 81例临床诊断为结核病的痰涂片阴性患者中,单纯肺结核40例(肺结核组),合并HIV感染的患者41例(合并感染组).患者的血、痰样本分别进行结核分枝杆菌及其L型培养,采用FQ-PCR技术检测血及痰培养液中结核分枝杆菌DNA.结果 肺结核组结核分枝杆菌痰培养FQ-PCR阳性率为54.1%(20/37);血培养阳性率为27.5%(11/40),血培养FQ-PCR阳性率为22.5%(9/40),血培养及其FQ-PCR总阳性率42.5%(17/40).合并感染组10例痰样本培养后2例FQ-PCR阳性;血培养阳性率为7.3%(3/41),血培养FQ-PCR阳性率为17.1%(7/41).合并感染组血培养物FQ-PCR阳性率(17.1%)与肺结核组(22.5%)相比,差异无统计学意义(P>0.05).两组痰与血培养物FQ-PCR总阳性率分别为65.0%(26/40)和22.0%(9/41),差异有统计学意义(χ2=15.305,P<0.01).结论 痰或血培养物FQ-PCR检测有助于提高结核或结核合并艾滋病患者的诊断,同时显著提高了痰涂片阴性肺结核患者的诊断.     

核酸扩增检测结核杆菌DNA方法在肺结核诊断中的临床价值

目的确定核酸扩增结核杆菌DNh检测与抗酸杆菌涂片镜检两种方法在临床诊断上的应用价值。方法选取2009年11月至2011年5月肺结核病例208例为结核组,同期36例非结核病患者作为非结核组,对两组患者晨起痰液进行核酸扩增荧光定量聚合酶链反应（polyerasechainreaction,PCR）和涂片抗酸杆菌镜检,对痰检结果阳性率进行,检验。结果208例结核病患者的痰液中,FQ—PCR法和涂片抗酸染色法检出的阳性率分别为51．92％和25．96％,FQ—PCR法痰检患者结核杆菌DNA的阳性率明显高于涂片法,两种方法相比差异有统计学意义（x2=29．48,p〈0．01）：对两组方法的特异性及敏感性进行分析,两种方法特异性无统计学差异（x2=2．35,p〉0．05）,敏感性有统计学差异（J2=9．447,p〈0．01）。结论荧光定量PCR检测技术对临床上肺结核病的诊断和鉴别诊断有较高的应用价值。     

荧光定量PCR技术在霍乱弧菌检测中的应用

目的：建立霍乱弧菌荧光定量聚合酶链反应检测方法，评价其优越性。方法：根据霍乱弧菌NhaA基因保守序列，设计合成霍乱弧菌FQ-PCR诊断试剂盒，比较该方法与常规检测方法在外环境、海产品及临床病例霍乱弧菌检测上的灵敏度和特异性。结果：在临床患标本霍乱弧菌的检测上，FQ-PCR与常规方法灵敏度主、特异性一致，但在含菌量少、菌株易发生变异（外环境疫水、海产品及霍乱越冬）标本的检测上，FQ-PCR显示出其独特的优越性。结论：FQ-PCR方法用于霍乱弧菌的检测，不仅可避免常规PCR引起的假阳性污染，同时可实现对含菌量少、变异菌株的定量定时检测，对临床检验及卫生检测有较大的指导意义。     

Molecular detection and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis complex from cattle at a dairy farm in the Nkonkobe region of South Africa: a pilot study

Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) causes tuberculosis (TB) in humans and animals. We investigated the presence of MTBC in cattle milk and its drug resistance using polymerase chain reaction (PCR). Two hundred samples (100 mL each) were obtained from a dairy farm in the Nkonkobe region of South Africa. The samples were processed using the modified Petroff method. DNA was isolated using a Zymo Bacterial DNA kit and amplified using Seeplex(?) MTB Nested ACE assay. The Genotype(?) Mycobacterium tuberculosis-multidrug resistantplus (MTBDRplus) assay was used to perform drug susceptibility and detection of mutations conferring resistance to isoniazid (INH) and rifampicin (RIF). Eleven samples tested positive for MTBC DNA using the Seeplex(?) MTB Nested ACE assay. The Genotype(?) MTBDRplus assay showed that 10/11 samples were resistant to both INH and RIF i.e., multi-drug resistant (MDR). The most and least frequent rpoB mutations detected in RIF resistant samples were H526Y (9/10) and D516V (2/10) respectively. None of the INH resistant samples harbored mutations in the katG gene. However, all of them harbored the T8A mutation in the inhA gene. These results have clinical and epidemiological significance and calls for further studies and necessary actions to delineate the situation.     

干血斑样本用于HIV-1基因序列测定和亚型分析的研究

目的 将干血斑样本用于HIV-1基因序列测定和哑型分析。方法采集20例静脉吸毒HIV-1感染者的EDTA抗凝静脉全血2ml，80μl制备干血斑样本。QIAamp Blood Mini试剂盒，10％Chelex 100树脂分别提取全血和干血斑中细胞DNA。HIV-1enu基因Gp41区2对外侧和内侧引物，按照巢式PCR方法，扩增Gp41区，PCR产物用内侧正反向引物测序。MEGA3．0等软件完成序列比对及亚型分析。结果18对符合要求的干血斑和全血样本进入研究。16对经序列分析归为中国流行的BC重组亚型，样本间的基因平均离散率为5．79％，与中国流行的BC重组业型的基因离散率为491％，与C亚型代表序列基因离散率为8．89％，与其他几个国际亚型代表株的基因离散率在15％～20％之间。另2对样本分别归属于泰国B’亚型和欧美B亚型。结论干血斑样本与全血样本HIV-1 DNAPCR产物亚型分析一致，氨基酸序列比对同义和非同义替换比例、位置和类型基本一致，其易采集，便于运输，保存条件和生物危险性低，费用低廉的优点适合作为实验条件较差的偏远地区HIV-1分子流行病学研究的一种样本采集手段。     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌检测中的应用价值

目的比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)与抗酸染色、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法对311例临床确诊的肺结核病患者和40例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌。结果FQ-PCR、抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的阳性率分别为47.0%(146/311)、28.3%(88/311)、35.4%(110/311),特异性分别为100.0%、100.0%、95.2%,以FQ-PCR检测的阳性率最高。结论FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立

目的 探讨结核分枝杆菌实时定量检测方法并进行评价.方法针对结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)16S rDNA基因设计引物,应用SYBR Green I建立荧光定量PCR( FQ-PCR)反应体系;提取Mtb基因组DNA,PCR扩增16S rDNA片段,构建重组质粒pMD-TB16S;检测11份肺结核患者痰标本;以甲型链球菌、大肠杆菌等基因组DNA作对照,检验方法特异性,对同一份Mtb DNA模板进行批内和批间检测,计算变异系数(CV).结果靶向Mtb 16S rDNA基因引物能够特异扩增Mtb 16S rDNA基因,对照组细菌基因未见扩增,灵敏度为(Mtb基因组DNA) 1.2 pg/μL,即(38.9 +3.54)拷贝/μL的16S rDNA基因,批内和批间Ct值变异系数分别为0.27％和1.26％.结论以16S rDNA为靶基因的FQ-PCR技术,能够对Mtb进行快速、敏感而特异的定量检测.     

荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌方法建立及价值

目的建立荧光实时定量PCR（FQ-PCR）定量测定铜绿假单胞菌的方法，检测该方法的灵敏度并与传统细菌培养比较其特异性吻合率。方法选择铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物，建立Taqman探针FQ-PCR体系定量检测5种标准菌株、3种病毒株、白色念珠菌、肺炎支原体、人基因组DNA及临床培养96株菌株。结果31株铜绿假单胞菌、铜绿假单胞菌与其它菌种或人全血的混合液均产生特异扩增信号，标准曲线的相关系数为0．997；其他菌种（76株）无扩增；乙肝病毒、巨细胞病毒及肺炎支原体及健康人全血均无扩增，与传统培养相比特异性吻合率达100％，铜绿假单胞菌标准株按等级浓度稀释后其拷贝数也呈等级梯度递减，实际可检测到的最小菌落数为100个／ml，全程检测〈4h。结论荧光实时定量法检测oprI基因可以运用于铜绿假单胞菌的快速检测。     

石蜡包埋组织中结核杆菌DNA不同提取方法比较

目的探讨结核患者石蜡包埋组织中简易有效的结核杆菌DNA提取方法并进行验证。方法 20份4%甲醛固定石蜡包埋的肺或淋巴结结核组织标本,分别以氯化钠盐析法、酚-氯仿抽提法、一步法、试剂盒法提取其DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)及膜芯片法分析所提取DNA的质量。结果氯化钠盐析法提取的DNA〔(19.338±6.270)μg〕和一步法提取的DNA〔(20.050±5.591)μg〕最多(P<0.001),一步法的A260/A280比值(1.044±0.137)明显低于其他3种方法(P<0.001);电泳结果显示4种提取方法均得到了基因组DNA;PCR与膜芯片验证显示除一步法外其余3种方法提取的DNA中均检测到结核杆菌DNA。结论氯化钠盐析法提取石蜡包埋组织结核杆菌DNA具有高效简便的特点,是较为理想的方法。