结核分枝杆菌H_(37)Rv株菌体抗原及分泌抗原分析

目的对比分析人型结核枝杆菌(结核菌)H37Rv株固体培养菌、液体培养菌及分泌蛋白中抗原成分的差异,寻找结核菌的主要免疫抗原。方法应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术、免疫印迹技术及单克隆抗体技术分析人型结核菌H37Rv株固体培养、液体培养及其分泌蛋白中的抗原成分。结果固体培养菌与液体培养菌具有基本一致的多肽抗原成分,其主要成分分子量为79000、64000、54000、50000、28000～38000、23000等,而分泌蛋白差异稍大,其主要成分分子量为66000、63000～65000、55000、42000、32000～34000、24000、16000等。单克隆抗体进一步证明66000、55000、16000为分泌蛋白。多克隆抗体免疫印迹分析表明,菌体主要免疫原有79000、54000、38000～50000、28000蛋白成分,而分泌蛋白主要免疫原为分子量66000、55000～64000、30000～34000、24000、16000成分。结论人型结核菌H37Rv株菌体蛋白和分泌蛋白具有不同的主要免疫原,将有助于认识HRv株的总体蛋白组成及寻找与结核病相关的特异性抗原成分。     

结核分枝杆菌抗原Rv0173的克隆、表达与纯化

目的 在大肠杆菌中表达、纯化结核分枝杆菌Rv0173抗原,为研制新型结核病疫苗打下基础.方法 将结核杆菌抗原Rv0173的全长cDNA插入到原核表达载体pGES-4T-1中,构建成Rv0173重组质粒.将重组质粒转入大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组表达蛋白.结果 获得了pGEX4T-Rv0173 重组子,Rv0173蛋白在BL21菌中获得表达,表达的蛋白条带大小约45KD,与预期结果相符.结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Rv0173进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

麻疹病毒多肽抗原免疫原性分析

目的分析麻疹病毒(measles virus,MV)主要多肽抗原成分,筛选可用于麻疹病毒特异性抗体诊断的抗原成分。方法应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹技术(immunoblots,IB)对比分析细胞抗原与麻疹病毒抗原,确定病毒多肽抗原的存在,利用不同时期免疫动物的多克隆抗体分析病毒多肽抗原免疫原性的强弱。结果SDS-PAGE和多克隆抗体免疫印迹结果表明,麻疹病毒分子量为60 kD和55 kD抗原的免疫原性最强,72 kD抗原性较弱,200 kD抗原性最弱。结论针对麻疹病毒60 kD和55 kD抗原成分的抗体检测可以作为麻疹病毒感染的早期诊断指标。     

结核分枝杆菌Rv3671c基因的克隆表达及免疫印迹检测

摘要：目的:构建结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的重组质粒,在大肠埃希菌中表达并纯化重组蛋白Rv3671c,并评价结核分枝杆菌Rv3671c结构域多肽的免疫学特性。 方法：将编码结核分枝杆菌Rv3671c蛋白的基因克隆到pET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组Rv3671c蛋白,透析复性和Lowry法测定蛋白质浓度。对蛋白质悬液进行SDS-PAGE分析并进行免疫印迹检测。 结果：结核分枝杆菌Rv3671c蛋白在大肠埃希菌中成功表达,层析纯化获得纯度为95.0％的重组Rv3671c蛋白,免疫印迹检测显示重组表达蛋白与结核病患者混合血清具有良好亲和性。 结论：Rv3671c结构域多肽可作为新的结核病血清学检测方法的候选抗原肽组分。     

结核分枝杆菌蛋白抗原诊断试剂的临床价值研究

目的研究和评估基于结核分枝杆菌蛋白抗原(TB-SA)研制的结核诊断试剂盒在结核病诊断中的应用价值。方法运用胶体金法分别检测结核组、非结核其他呼吸系统疾病组、健康对照组血清TB-SA结核抗体。结果 TB-SA结核抗体检测结核的灵敏度为72.2%,特异度95.8%,检测结核病患者阳性率(72.2%)明显高于涂片法(44.9%)和培养法(37.1%),差异均有统计学意义(P0.05)。结论 TB-SA抗体检测具有较好的敏感性和特异性,对结核病诊断和鉴别诊断有较高的临床应用价值。     

人巨细胞病毒多肽抗原的免疫原性分析

目的分析人巨细胞病毒多肽抗原的免疫原性强弱,寻求与早期诊断相关的抗原成分。方法应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术对比分析细胞抗原与病毒抗原的差异,确定病毒多肽抗原的存在,利用不同时期免疫动物的多克隆抗体分析病毒多肽抗原的免疫原性。结果SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和多克隆抗体免疫印迹结果表明分子量为65kD和72kD的人巨细胞病毒多肽抗原免疫原性较强,分子量为51kD和58kD的病毒多肽抗原免疫原性较弱,分子量为150kD的抗原免疫原性最弱。结论65kD和72kD的人巨细胞病毒多肽抗原可以应用于病毒感染的临床确诊。     

免疫色谱法抗-MPB64单克隆抗体检测结核分枝杆菌菌群方法学评价

目的 用免疫色谱法抗-MPB64单克隆抗体快速检测和诊断结核分枝杆菌结核菌群的方法学评价。方法 共收集20株临床标本分离菌株、11株参考菌株和1株结核分枝杆菌标准菌株，应用免疫色谱法检测在培养基上生长的细菌，并和传统鉴定方法、实时荧光探针定量PCR法（FQ-PCR）作比较研究。结果 用免疫色谱法检测1株标准菌株为阳性，检测11株参考菌株发现用该法能完全区分结核和非结核分枝杆菌。对20株临床分离的标本用免疫色谱检出11株结核菌菌群，检出率为55％；用传统鉴定方法检出10株，其中未能检出的一株为混合菌感染；用FQ-PCR法检出10株，其中未能检出的一株为牛结核菌。免疫色谱法能检测到的最低菌浓度为10^5CFU／ml。免疫色谱法、FQ-PCR法和传统鉴定方法的平均耗时分别为15min，1～2d和30d。结论 免疫色谱法是一种简便、快速、准确、敏感和特异性鉴别结核和非结核分枝杆菌的方法，适合在临床推广使用。     

结核分支杆菌16000抗原基因在大肠杆菌中的高效表达及其产物

目的：获得高效表达结核分支杆菌16000抗原的大肠杆菌工程菌，将培养物纯化后得到重组16000蛋白抗原纯品，并检测其免疫学特性。方法：用聚合酶链反应（PCR）方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析重组蛋白抗原的相对分子质量大小及表达形式。DEAE及PEI凝胶纯化重组蛋白。Western印迹及酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析重组蛋白的免疫原性。结果：构建了具有正确基因序列的重组表达载体，在大肠杆菌Bk。（DE3）中诱导表达，重组蛋白占菌体总蛋白的40％，Westem印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中，该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清。结论：实验中获得了能高效表达16000蛋白抗原的大肠杆菌工程菌，以可溶性形式存于胞浆内。该重组蛋白具有特异的免疫原性。结核病仍为危害全球健康的主要疾病之一，为了改进目前诊断试剂的特异性和研究筛选有价值的亚单位基因工程菌苗，近年来人们对其致病菌的基因及相关蛋白质进行更深入的研究，以期寻找到有应用价值的特异性蛋白质或相关基因，有目的地利用基因工程技术获得重组蛋白抗原为以上研究提供极大的便利。使用结核分支杆菌单克隆抗体TB68筛选出来的16000蛋白抗原，为结核分支杆菌主要的膜蛋白，对其天然提取物的研究结果表明，该蛋白不仅携带有结核分支杆菌特异性的B细胞表位，并能诱导细胞介导的免疫应答反应，具有潜在的诊断应用价值。大量获得重组16000蛋白抗原就为更深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性，开发其应用价值提供便利。     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌Rv3872基因的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌Rv3872蛋白。方法聚合酶链反应（PCR）技术从结核分枝杆菌标准株H37Rv全基因组中扩增出的表达Rv3872基因序列，将其克隆到pMD18-T载体后，测序分析。亚克隆该目的基因到pET28a表达载体，最终转化至大肠杆菌BL21（DE3），获得正确的阳性克隆子后大量表达重组Rv3872蛋白，再经纯化、定量后，通过Western blot分析其抗原性。结果扩增Rv3872基因经序列测定与GenBank公布的序列完全一致，表达蛋白经SDS-PAGE分析，在约15000kD处有表达条带，纯化后的重组蛋白占总蛋白的90％以上。免疫印迹分析显示重组的Rv3872蛋白具有抗原性。结论成功表达结核分枝杆菌的Rv3872蛋白，为结核病血清学诊断候选抗原筛选和开发应用打下基础。     

Accumulation of five fluoroquinolones by Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

The accumulation of ciprofloxacin, norfloxacin, moxifloxacin, levofloxacin and ofloxacin by Mycobacterium tuberculosis H37Rv was determined with a modified fluorescence method. The time to achieve a steady-state concentration (SSC) of each agent in M. tuberculosis was 60-240 s. Moxifloxacin was accumulated to the lowest concentration and ciprofloxacin to the highest. However, ciprofloxacin took longer to achieve an SSC than the other four agents; levofloxacin reached steady state in the shortest time. Larger fluoroquinolones accumulated to the lowest concentration and more slowly. Although all five agents had low hydrophobicity values (P(app) < or =0.11), those with the lowest values accumulated to the higher concentrations.     

结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性研究

目的 研究结核分枝杆菌Rv1009结构域多肽的免疫学特性.方法 用原核表达的Rv1009结构域多肽免疫BALB/c小鼠3次.每次间隔2周.用ELISA法检测免疫小鼠血清中特异性抗体滴度.分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数.ELISA方法检测淋巴细胞悬液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-10和IL-12的产生水平.另一部分免疫的小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv,4周后,计数脾脏细菌负荷数.结果 Rv1009结构域多肽免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1:12 800.淋巴细胞增殖指数为2.40±0.18,明显高于生理盐水对照组的0.90±0.21.ELISA方法检测Rv1009结构域多肽免疫组IFN-γ、IL-10和IL-12水平为(1432±30)ng/L、(503±11)ng/L和(311±11)ng/L,显著高于生理盐水对照组的(256±20)ng/L、(76±6)ng/L和(56±8)ng/L(P<0.01).与生理盐水免疫组(细菌负荷6.64±0.13)相比较,Rv1009结构域多肽免疫组小鼠,对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用(细菌负荷为4.86±0.14,P<0.05),但不及BCG免疫组的3.81±0.16.结论 Rv1009结构域多肽有可能作为新型结核疫苗的候选组分.     

结核病和肺癌患者痰及胸腔积液中结核分枝杆菌L-型的检测

目的探讨结核分枝杆菌L-型(MTB-L)在结核病和肺癌患者痰、胸腔积液两种临床标本中检出的意义。方法选取华北石油总医院2007年2～11月门诊及住院确诊为肺癌的患者110例为肺癌组,选择同期该院健康体检者42例为健康健康对照组,选择同期门诊及住院101例肺癌胸腔积液患者为结核病组,比较3组的MTB-L的资料。结果结核病组IK抗酸染色检测痰和胸腔积液标本中阳性率分别为42.9%、34.4%,均高于肺癌组(26.8%,21.1%,P<0.05);结核病组痰和胸腔积液标本中MTB-L阳性率分别为57.1%、40.6%,均高于肺癌组(24.4%,26.3%,P<0.05)。结论 MTB-L感染在肺癌的形成过程中可能起到一定的作用。     

番禺地区结核分枝杆菌耐药状况及耐药谱分析

目的探析番禺地区结核分枝杆菌的耐药情况与耐药谱。方法选择2011年2月至2014年2月期间番禺地区就诊的结核病患者1 033例,并对其分离株进行菌种鉴定。检测其对利福平(RIF)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)及乙胺丁醇(EMB)的耐药性。并进一步分析对INH耐药的结核分枝杆菌的耐药谱分布情况。结果 1 033株结核菌株中,总耐药率为42.01%(434/1 033),其中,初始患者耐药率低于复治患者(40.32%比48.20%),两者耐药率具有统计学差异(χ2=4.440,P=0.035)。男性患者耐药率低于女性患者(37.18%比57.55%),两者耐药率具有统计学差异(χ2=31.826,P0.01)。30~60岁年龄段患者耐药率最高,30岁、30~60岁和60岁3个年龄段耐药率(28.78%比48.31%比27.68%)比较差异有统计学意义(χ2=48.852,P0.01)。所检测的RIF、INH、SM及EMB耐药顺序为INH(14.98%)RIF(13.36%)SM(9.11%)EMB(4.56%)。155株INH耐药株中,同时耐RIF的有46(29.68%)株,耐多药率为4.45%(46/1 033)。结论番禺地区结核分枝杆菌的耐药情况较严重,与患者年龄、性别等有关,应加强对耐药杆菌的检测,采取有效的防控措施。     

不同佐剂在ESAT-6亚单位结核基因疫苗中的研究

目的 结核分支杆菌ESAT-6抗原是在人或动物结核病早期细胞介导免疫的主要作用靶点，本研究旨在评价不同佐剂在ESAT-6作为试验性结核疫苗方向的潜能。方法 将溴化二甲基双十八烷基铵（dimethyl dioctadecyl ammonium bromide，DDA）和单磷酰脂质体A（monophosphoryl lipid A，MPL）联合应用作为佐剂，用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析干扰素γ（IFN-γ）和免疫球蛋白G（IgG）含量，并比较2种佐剂的免疫效果。结果 将ESAT-6为基础的实验性疫苗与含有已知的保护性抗原成分的抗原85B复合体（antigen 85B，Ag85B）和短期培养滤液（ST-CF）等的疫苗进行平行比较，以DDA为佐剂免疫小鼠可以对Ag85B和ST-CF产生强的保护性免疫应答，而DDA佐剂用于ESAT-6时则作用轻微，未见细菌负荷的明显下降。采用DDA和MPL联合应用效果比单用DDA或单用MPL效果显著（P〈0．05）。结论 DDA和MPL的联合应用使得ESAT-6疫苗的接种成为可能，作为诊断性工具鉴别结核感染和接种免疫等方面具有强大潜能，为结核控制和预防提出了新的思路。     

血清结核杆菌抗体检测在结核病的临床意义

目的：探讨血清结核杆菌抗体检测在住院患者结核病诊断中的临床价值。方法150例结核病患者,80例非结核病患者以及40例健康志愿者均应用以脂阿拉伯甘露糖（LAM）为抗原的 ELISA法进行抗体阳性率的检测。并应用痰涂片和PPD实验检查对150例结核患者进行检测。结果在150例肺结核患者中,结核杆菌抗体检测的阳性检出率为72．67％（109/150）,显著高于痰涂片的51．33％（77/150）和PPD实验的58．67％（88/150）,且差异均具有统计学意义（χ2＝14．49,6．52;P＜0．001,0．011）。结核病组抗体阳性率总数为72．67％（109/150）,显著高于非结核病组的17．50％（14/80）和健康对照组的10．00％（4/40）,且与二者比较,差异均具有统计学意义（χ2＝41．15,51．45;P＜0．001,0．001）。非结核疾病组与健康人群比较,抗体阳性率的差异无统计学意义（χ2＝1．18,P＝0．27）。结论结核抗体测定对结核病的阳性检出率较高,优于传统的痰涂片和PPD实验检测,临床上具有很大的应用价值。