pcDNA3-Bfgf真核表达载体的构建和鉴定

目的构建pcDNA3碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达质粒,为进一步开展bFGF基因治疗中枢神经疾病奠定基础.方法建立SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增脑细胞中bFGF基因;载体和RT-PCR产物经BamHI和EcoRI酶切,纯化,T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌,抗生素筛选重组质粒.结果 RT-PCR产物为649bp特异片段,pcDNA3咄FGF重组体菌落PCR产物为649 bp特异片段,测序分析为bFGF基因片段.结论经RT-PCR反应得到特异的bFGF基因片段,并成功构建了大鼠bFGF真核表达载体.     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

pcDNA3.1- Bcl-2真核表达载体构建

目的 克隆大鼠Bcl-2基因（B cell lymphoma）全长cDNA,构建含大鼠Bcl-2基因的重组真核表达质粒。方法 采用RT-PCR的方法从大鼠脾脏组织中扩增全长Bcl-2cDNA,将扩增产物克隆至pMD18-T载体, 测序证实后,再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒。结果: RT-PCR获得长度为720 bp的阳性产物,经T载体和pcDNA3. 1(+)真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实真核表达质粒pcDNA3.1- Bcl-2构建成功。结论 成功克隆了Bcl-2基因,并构建了pcDNA3.1- Bcl-2重组质粒,为进一步研究Bcl-2基因的功能及应用Bcl-2进行基因治疗奠定基础。     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

大鼠SOCS-3基因真核表达载体的构建

目的:构建大鼠的细胞因子信号转导抑制因子-3(SOCS-3)真核表达载体,为慢性肝损伤建立相应的基因治疗途径提供基础。方法:从大鼠的肝脏中提取总RNA,通过RT-PCR法获得大鼠SOCS-3基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3,并进行酶切鉴定和测序分析。结果:通过RT-PCR法克隆大鼠SOCS-3基因为696bp,与目的基因大小片段一致,经酶切鉴定及测序证实大鼠SOCS-3真核表达载体与设计完全一致。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-SOCS-3,为进一步研究其在慢性肝损伤中的作用及基因治疗提供基础。     

重组人脂联素真核表达载体的构建及表达

目的为进一步研究脂联素(ADPN)的功能提供实验基础,构建含重组人脂联素(hADPN)真核表达载体的3T3-L1细胞株。方法酶切载有人脂联素cDNA的重组克隆质粒pMD18-T和真核表达质粒pcDNA3.1 ,回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒,经连接、转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,经酶切和核苷酸序列测定鉴定。脂质体法转染3T3-L1细胞,G418筛选阳性细胞克隆扩增,通过RT-PCR的方法逆转录合成脂联素基因片段。结果重组真核表达质粒酶切后获得5.4kb和800bp两个片段,大小与理论值一致。并经核苷酸序列测定证实。RT-PCR产物经凝胶电泳后于紫外分析仪下可见在250bp前有一清晰条带,和扩增目的基因片段长度234bp一致。结论成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒并在3T3-L1细胞中稳定表达。     

降钙素基因相关肽真核表达载体pcDNA3．1／CGRP的构建

目的构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因（rCGRP）的重组真核表达载体pcDNA3．1（＋）／rCGRP。方法应用Trizol试剂从SD大鼠脑组织提取总RNA，RT—PCR扩增rCGRPeDNA（PCR引物上加上双酶切位点），产物通过Hindm和BamHI酶切、纯化、连接，将目的基因插入真核表达质粒载体peDNA3．1（＋），再将重组质粒转化感受态细菌，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，再经PCR、酶切和测序鉴定所得克隆。结果（1）RT-PCR产物电泳分析扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合；（2）重组克隆鉴定①PCR鉴定。PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片段，和rCGRPeDNA大小相吻合；②酶切鉴定，抽提质粒经双酶切，酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带，分别和pcDNA3．1（＋）和rCGRPcD-NA大小相吻合；③DNA测序，测序结果经BLAST分析，与rCGRP基因编码区全长序列完全一致。结论（1）大鼠脑组织中有rCGRP的表达；（2）通过RT—PCR及基因重组技术成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）／rCGRP。     

牛pcDNA3-bFGF真核表达重组体的构建与鉴定

【目的】构建并鉴定牛碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)基因真核表达质粒。【方法】设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的bFGFcDNA引物 ,采用PCR法从原核pET3c bFGF中扩增bFGFcDNA片段 ,纯化PCR产物 ,EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并连接至 pcDNA3 ,转化感受态大肠杆菌DH5α ,酶切鉴定阳性重组子 ,并进行序列测定。【结果】经PCR能扩增出 4 83bp的片段 ,与预期片段大小相符 ,构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段 ,测序结果与预期序列完全一致。【结论】成功构建了牛bFGF真核表达重组体bFGF pcDNA3 。     

人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体.方法:从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FD domain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和 pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定.结果:从人肝cDNA文库中扩增出1 473 bp的angioarrestin目的片段及其C-端560 bp FD domain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD 经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功.结论:成功构建了angioarrestin 和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础.     

亚细胞定位PTEN基因真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建人野生型亚细胞定位PTEN基因真核表达载体,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。 方法：以胎盘组织RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-PTEN质粒,进行酶切鉴定和测序。以T-PTEN质粒为模板,利用PCR技术将核定位信号（NSL）加入PTEN序列。PCR产物与T载体连接,转化大肠杆菌,获得T-NSL-PTEN质粒。真核表达载体pcDNA3.1及T-NSL-PTEN质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌,获得重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN,进行酶切和测序鉴定。结果：重组质粒PUM-PTEN酶切在1　200　bp处见目的片段,与预期结果符合。测序结果显示基因序列与目的基因完全一致;重组质粒PUM-NSL-PTEN酶切在1　200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与设计一致,核定位信号成功加入;重组质粒pcDNA3.1-PTEN酶切在1 200 bp处见目的片段,测序结果显示基因序列与目的基因相同;重组载体pcDNA3.1-NSL-PTEN经双酶切和测序证实了其正确性EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切在1　200 bp处见目的片段,与预期结果一致。测序结果显示,核定位信号成功加入,其后是阅读框架正确的PTEN基因序列。结论：成功构建可表达亚细胞定位PTEN的真核表达载体pcDNA3.1-NSL-PTEN。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的：对HSN1亚型禽流感病毒株(A/Qa／ST/852/01)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法：用RT-PCR方法扩增A/Qa／ST／852／01的ns1基因。之后以扩增产物为模板，采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰，将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中，并将其克隆到真核表达载体，构建pcDNA3．1/ns1重组质粒。结果：RT-PCR产物测序显示，A/Qa／ST／852／01 ns1基因开放阅读框全长678bp，编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论：成功将缺失的15个核苷酸片段引入A/Qa／ST／852／01的ns1基因中，重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

日本血吸虫(大陆株)Sj26基因的克隆与序列分析

目的 构建日本血吸虫(大陆株)26kDa谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26)基因的真核表达载体，并测定基因序列和进行序列分析。方法 用PCR的方法特异性地扩增Sj26基因，并将此基因克隆于真核表达载体pcDN3，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定，用双脱氧链末端终止法进行序列测定，应用BIAST方法分析Si26基因序列并进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的Sj26基因，双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3-Sj26重组质粒，测序结果获得的基因片段大小为651bp，编码217个氨基酸残基。基因序列同源性为99％。结论 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-Sj26。     

血红素氧合酶-1基因真核表达载体的构建及其在大鼠腹膜间皮细胞中的表达

目的 构建大鼠血红素氧合酶-1(HO-1)真核表达载体,并以该重组表达载体体外转染培养的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs).方法 从SD大鼠脾脏中提取总RNA,并经RT-PCR扩增HO-1基因的CDS区全长片段,将PCR产物克隆至pMD-18T载体,BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后获取HO-1片段,用T4DNA连接酶将HO-1片段与双酶切后的真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建大鼠HO-1真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1.酶切鉴定和测序验证后,利用脂质体介导将重组质粒转染原代培养的RPMCs,通过RT-PCR和Western blotting检测RPMCs中HO-1的表达.结果 成功克隆了大鼠HO-1基因并构建了其真核表达载体pcDNA3.1(-)-HO-1,酶切鉴定证实基因正确地插入表达载体中,并经DNA测序验证.pcDNA3.1(-)-HO-1转染RPMCs后,经RT-PCR和Western blotting检测,HO-1在RPMCs中获得高效表达.结论 HO-1基因真核表达载体的成功构建以及HO-1在RPMCs中的高效表达,为进一步研究HO-1在腹膜透析所致RPMCs损伤中的作用奠定了基础.     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。