胶原／羟基磷灰石复合支架负载软骨细胞构建组织工程软骨

背景：新型复合软骨组织工程支架克服了传统支架的诸多不足，如组织相容性差、生物力学性能不足、降解过快、材料单一、难与关节软骨的分层结构相匹配等，为软骨组织工程的发展提供新的途径。目的：观察具有柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架对软骨细胞的吸附作用，以及对软骨细胞生物学性状的影响，评价其作为软骨组织工程支架的可行性与价值。设计：开放性实验。单位：中山大学附属第三医院骨科，华南理工大学材料学院。材料：实验于2004-06／11在中山大学附属第三医院动物实验中心完成。选取2周龄普通级健康新西兰白兔1只，雄性，饲养环境温度20℃，湿度40％。方法：①在羟基磷灰石中加入少量的去离子水，分散后加入Ⅰ型胶原溶液搅拌复合，并按一定比例加入碳二亚氨，调配形成不同比例的胶原／羟基磷灰石复合物，并逐层加入模具，最上层采用纯胶原，底层为纯羟基磷灰石。将制备好的柱状分层的胶原／羟基磷灰石复合材料冷冻干燥后，经环氧乙烷气体消毒后备用。②体外培养幼兔关节软骨细胞并扩增，吸附于多孔胶原／羟基磷灰石复合支架上三维立体培养，通过相差倒置显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响。主要观察指标：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察。结果：①胶原／羟基磷灰石多孔支架的形貌观察：胶原／羟基磷灰石为具有一定力学强度的柱状分层的三维多孔支架，最上层为纯胶原，底层为纯羟基磷灰石，中间为胶原与羟基磷灰石复合。扫描电镜可见支架内具有不规则的通孔结构，孔径较均匀，相互连通，平均孔径约为147μm。②体外培养的软骨细胞生物学性状观察：刚分离的软骨细胞为球形，活细胞率达95％。24h后细胞开始贴壁，逐渐伸展为三角或多角形，内含分泌颗粒。细胞保持单层生长，传代后增殖速度加快，4d铺满培养瓶。随着传代次数的增加，增殖速度开始减慢，当传到第6代时，细胞分裂能力明显下降，细胞变形明显，体积变大，梭形为主，边沿模糊，折光性弱。表现出细胞老化和向成纤维细胞反分化的趋势。③胶原／羟基磷灰石多孔支架材料与软骨细胞相容性的观察：多孔胶原／羟基磷灰石复合支架亲水性好，软骨细胞吸附于支架表面，增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部，在孔壁贴附良好，表型维持稳定，分泌胞外基质。结论：柱状分层结构的胶原／羟基磷灰石复合支架具有良好的细胞相容性，较单纯胶原力学性能更强，是比较理想的软骨组织工程支架材料。     

胶原-纳米羟基磷灰石复合支架的细胞相容性

背景:观察成骨细胞在生物材料上的形态、增殖和分化等项目,可评估生物支架材料的生物相容性。目的:观察复合支架材料纳米羟基磷灰石/胶原对成骨细胞增殖、分化的影响。方法:取新生24h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养,取第3代细胞与纳米羟基磷灰石/胶原支架或普通羟基磷灰石材料体外复合培养。培养3,6,9d后,观察材料周边的细胞形态及支架材料对细胞分化、增殖的影响。结果与结论:纳米羟基磷灰石/胶原材料较普通的羟基磷灰石材料更有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,证实其生物相容性更好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。     

聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架与兔软骨细胞的相容性

背景：传统的支架材料存在疏水性强,材料表面缺乏细胞表面受体特异结合的生物活性分子,材料的酸性降解产物易引发无菌性炎性反应等不足。根据仿生原理及软骨真实结构和构成来选择和制备组织工程软骨支架能够获得理想效果。目的：制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架,评价其与兔膝关节软骨细胞的生物相容性,探讨其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法：采用二次相分离技术制备聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石复合支架,将第3代新西兰兔软骨细胞接种至复合支架材料上复合培养,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。细胞-支架复合物在24孔板中培养5d以后,将其植入裸鼠皮下8周。结果与结论：聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石支架材料经化学合成后,具有合适的三维多孔结构,孔隙率为90%孔径300-450μm;植入裸鼠皮下8周后Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色显示细胞-支架复合物中的软骨细胞可以像天然软骨一样分泌黏多糖和Ⅱ型胶原。提示生物材料聚乳酸/壳聚糖纳米纤维/纳米羟基磷灰石对于兔软骨细胞有良好的生物相容性,可作为生物组织工程支架。     

胶原-纳米羟基磷灰石复合支架的细胞相容性

背景：观察成骨细胞在生物材料上的形态、增殖和分化等项目,可评估生物支架材料的生物相容性。目的：观察复合支架材料纳米羟基磷灰石/胶原对成骨细胞增殖、分化的影响。方法：取新生24h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养,取第3代细胞与纳米羟基磷灰石/胶原支架或普通羟基磷灰石材料体外复合培养。培养3,6,9d后,观察材料周边的细胞形态及支架材料对细胞分化、增殖的影响。结果与结论：纳米羟基磷灰石/胶原材料较普通的羟基磷灰石材料更有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,证实其生物相容性更好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。     

丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景:随着组织工程的兴起,软骨损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架,有一定的局限性.目的:观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性.方法:体外分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导成软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养,构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损.54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组,复合组植入细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石,对照组不行任何植入.植入后8,12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况.结果与结论:植入后8周,复合组关节面不平整,关节间隙增大,形成新生类软骨细胞,基质丰富.材料组关节面塌陷,软骨细胞少量增殖.植入后12周,复合组关节面平整,关节间隙如常.大量软骨细胞出现,与周边软骨色泽一样,支架材料完全降解.材料组关节面不平整,软骨细胞不完全充填,支架材料部分降解.对照组未见修复.提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性.     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

背景:最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性.目的:验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况.方法:贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况.培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量.结果与结论:发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞.骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养.结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化.     

丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景：随着组织工程的兴起,软骨损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架,有一定的局限性。目的：观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性。方法：体外分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导成软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养,构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损。54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组,复合组植入细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石,对照组不行任何植入。植入后8,12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况。结果与结论：植入后8周,复合组关节面不平整,关节间隙增大,形成新生类软骨细胞,基质丰富。材料组关节面塌陷,软骨细胞少量增殖。植入后12周,复合组关节面平整,关节间隙如常。大量软骨细胞出现,与周边软骨色泽一样,支架材料完全降解。材料组关节面不平整,软骨细胞不完全充填,支架材料部分降解。对照组未见修复。提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景:国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的:观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法:SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论:骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

多孔碳酸钙陶瓷与干细胞源性成骨细胞的相容性

背景：国内外的研究证实普通碳酸钙陶瓷作为骨替代材料时具有细胞支架作用。目的：观察多孔碳酸钙陶瓷与成骨细胞的相容性,及作为骨组织工程支架的可能性。方法：SD大鼠骨髓基质干细胞经矿化诱导培养、扩增并检测证实其已具成骨细胞表型后,分别与多孔碳酸钙陶瓷支架、普通羟基磷灰石陶瓷支架体外复合培养。结果与结论：骨髓基质干细胞经体外诱导形成成骨细胞,钙结节、Ⅰ型胶原和碱性磷酸酶免疫染色结果阳性。多孔碳酸钙陶瓷支架材料与羟基磷灰石陶瓷材料皆有细胞附着生长,但多孔碳酸钙陶瓷支架材料细胞的黏附能力、增殖活力及成骨活性均强于羟基磷灰石陶瓷材料。提示多孔碳酸钙陶瓷支架材料与SD大鼠骨髓基质干细胞源性成骨细胞有良好相容性。     

软骨细胞复合胶原/壳聚槲/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景:关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨.目的:观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性.时间及地点:体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与榆测实验室进行.材料:以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100 μm.方法:体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.结果:修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.结论:胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料.     

低强度脉冲式超声对兔脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞复合体的影响

背景:有关低强度脉冲式超声波促进关节软骨损伤修复的研究较多,可供选择的细胞支架亦较多,但是有关低强度脉冲式超声波的应用条件及构建出理想的组织工程软骨细胞支架尚未达到共识.目的:构建新西兰兔同种异体脱细胞脱钙骨基质负载关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的复合体.给予一定条件的低强度脉冲式超声波刺激,以探讨脱细胞脱钙骨基质作为组织工程软骨支架的可行性和低强度脉冲式超声波刺激对关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞的促进作用.设计、时间及地点:多个样本观察,实验于2009-05/08在解放军第二军医大学生物医学工程研究所完成.材料:应用新型改良Urist法制备兔脱细胞脱钙骨基质.采用机械粉碎结合酶消化法获取兔关节软骨细胞;采用全骨髓漂洗法分离出骨髓间充质干细胞并加以纯化,进行体外单层培养扩增.方法:按与脱细胞脱钙骨基质复合的细胞成分不同及是否应用低强度脉冲式超声波刺激不同分为4组:软骨细胞组、骨髓间充质干细胞组、复合细胞组:脱细胞脱钙骨基质分别与软骨细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,未进行低强度脉冲式超声波刺激.超声组:将脱细胞脱钙骨基质与软骨细胞/骨髓间充质干细胞复合,第2天进行低强度脉冲式超声波刺激,刺激频率1.0 MHz、瞬时空间强度10 mW/cm~2,20 min/d.主要观察指标:①平面培养第2代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞行免疫组织化学检测.②新型改良Urlet法制备的脱细胞脱钙骨基质行苏木精一伊红染色.③于细胞-支架复合第21天行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测.结果:①平面培养第2代关节软骨细胞行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,可见细胞形态为多角形、星形、圆形,有伪足伸出,胞质内容丰富,胞浆明显呈棕黄色,胞核为圆形.②平面培养第2代骨髓间充质干细胞的CD34免疫组织化学染色呈阴性,CD44及CD105免疫组织化学染色呈阳性.③新型改良Urist法制备的兔脱细胞脱钙骨基质内未见明显的细胞样结构,空隙大小均匀.④复合第21天后,骨髓间充质干细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,软骨细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色弱阳性,复合细胞组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,超声组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈强阳性.结论:①第1-3代关节软骨细胞及骨髓间充质干细胞与原代细胞的生物学性能相似.②在脱细胞脱钙骨基质内,软骨细胞和骨髓间充质干细胞可以保持较高的增殖能力.③10 mW/cm~2的低强度脉冲式超声波不影响骨髓间充质干细胞活性,并且能够加速其向关节软骨细胞分化,但未发现有明显促进细胞增殖的作用.     

Mechanical stimulations on human bone marrow mesenchymal stem cells enhance cells differentiation in a three‐dimensional layered scaffold

Scaffolds laden with stem cells are a promising approach for articular cartilage repair. Investigations have shown that implantation of artificial matrices, growth factors or chondrocytes can stimulate cartilage formation, but no existing strategies apply mechanical stimulation on stratified scaffolds to mimic the cartilage environment. The purpose of this study was to adapt a spraying method for stratified cartilage engineering and to stimulate the biosubstitute. Human mesenchymal stem cells from bone marrow were seeded in an alginate (Alg)/hyaluronic acid (HA) or Alg/hydroxyapatite (Hap) gel to direct cartilage and hypertrophic cartilage/subchondral bone differentiation, respectively, in different layers within a single scaffold. Homogeneous or composite stratified scaffolds were cultured for 28 days and cell viability and differentiation were assessed. The heterogeneous scaffold was stimulated daily. The mechanical behaviour of the stratified scaffolds were investigated by plane–strain compression tests. Results showed that the spraying process did not affect cell viability. Moreover, cell differentiation driven by the microenvironment was increased with loading: in the layer with Alg/HA, a specific extracellular matrix of cartilage, composed of glycosaminoglycans and type II collagen was observed, and in the Alg/Hap layer more collagen X was detected. Hap seemed to drive cells to a hypertrophic chondrocytic phenotype and increased mechanical resistance of the scaffold. In conclusion, mechanical stimulations will allow for the production of a stratified biosubstitute, laden with human mesenchymal stem cells from bone marrow, which is capable in vivo to mimic all depths of chondral defects, thanks to an efficient combination of stem cells, biomaterial compositions and mechanical loading.     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景：目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的：观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法：采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论：胶原-壳聚糖支架的吸水性为（80.0±0.55）%,孔隙率为（88.5±1.5）%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

雪腐镰刀菌烯醇能干扰培养软骨细胞表面黏附分子CD44的表达

背景:雪腐镰刀菌烯醇和硒缺乏与大骨节病的发生有一定的联系。透明质酸的代谢直接影响着蛋白聚糖的聚合和软骨的正常结构与功能。透明质酸代谢的关键环节是与软骨细胞表面透明质酸受体的结合。软骨细胞膜上的CD44作为透明质酸的主要受体,其表达直接影响透明质酸的代谢,继而影响软骨基质代谢,对维持软骨基质的结构与功能具有极其重要的意义。目的:探讨大骨节病有关病因因素对靶组织细胞的损伤和保护作用以及引起软骨细胞变性坏死的机制。设计:机对照观察。随单位:安交通大学医学院遗传学与分子生物学系。西材料:实验于2002-10/2004-07在西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成。选择30d龄的新西兰纯种幼兔1只,手术截取兔肱骨、股骨和胫骨。方法:采用细胞培养法于体外再建软骨组织模型,并加入不同浓度的大骨节病可疑致病因子雪腐镰刀菌烯醇和保护因子硒,检测软骨细胞膜上透明质酸受体CD44和细胞培养液中可溶性CD44。主要观察指标:①软骨细胞表面黏附分子CD44镜下观察。②软骨细胞培养液中可溶性CD44浓度。结果:①软骨细胞表面黏附分子CD44镜下观察:软骨细胞膜上CD44的表达随着雪腐镰刀菌烯醇浓度的增加而减少,加硒后有增加趋势。②软骨细胞培养液中可溶性CD44浓度:细胞培养液中可溶性CD44浓度随雪腐镰刀菌烯醇浓度升高逐渐降低,但高浓度组出现了增高,加硒后趋势不变;除空白对照组与加硒对照组外,组间差异显著(P<0.05)。结论:雪腐镰刀菌烯醇能干扰软骨细胞表面黏附分子CD44表达,进而引起软骨细胞外基质代谢紊乱;补硒能够拮抗雪腐镰刀菌烯醇对软骨细胞的损伤,但作用有限。     

胶原-壳聚糖支架与软骨细胞的生长

背景:目前软骨支架材料的种类比较多,但还没有一种材料能完全符合软骨修复的要求。目的:观察在混合材料胶原-壳聚糖支架中软骨细胞的生长情况。方法:采用冷冻干燥法将质量分数为2%胶原与3%壳聚糖混合制备胶原-壳聚糖多孔支架。将分离培养的第2代兔软骨细胞接种到胶原-壳聚糖支架上,对照组将软骨细胞接种到无支架的培养板中。观察支架的孔隙率、吸水性及内部形态结构,MTT法检测软骨细胞在支架上的增殖情况,组织切片苏木精-伊红染色,扫描电镜观察细胞在支架的生长、贴附情况,RT-PCR检测细胞支架复合物蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达情况。结果与结论:胶原-壳聚糖支架的吸水性为(80.0±0.55)%,孔隙率为(88.5±1.5)%,孔径为100～150μm,复合细胞培养2周后,细胞增殖活力高,软骨细胞分泌的蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于对照组。说明质量分数为2%胶原与3%壳聚糖的混合支架适合软骨细胞生长和快速增殖,是一种良好的修复和重建软骨载体。     

兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体构建软骨组织工程支架

背景:软骨组织工程的核心是利用少量的细胞经体外培养、扩增后,在一定环境下附着在三维多孔支架上,再将细胞/支架复合体移植到体内形成新的组织.目的:拟构建兔骨髓间充质干细胞/壳聚糖-胶原支架复合体,探讨该支架作为软骨组织工程支架的可行性.设计、时间及地点:细胞-支架学体外观察,于2008-03/2009-02在武警医学院生物化学教研室完成.材料:日本大耳白兔6只用于分离培养骨髓间充质干细胞.医用壳聚糖粉末为山东奥康生物科技有限公司产品.Ⅰ型胶原为Sigma公司产品.方法:取3%的壳聚糖和2%的胶原混合的醋酸溶液,倒入72孔板内,-20℃预冷冻10 h,冻干机冷冻抽干24 h制作成壳聚糖-胶原支架.取第3代兔骨髓间充质干细胞,以1×109L-1密度接种于支架内,构建细胞/支架复合体.主要观察指标:傅里叶红外光谱、扫描电镜、液体置换法测定支架的理化性质,观察三维培养后细胞在支架上的生长情况.结果:壳聚糖-胶原支架孔径为160～380 μm,平均为270 μm,孔相通性好,支架孔隙率为(86.00±5.12)%.傅里叶红外光谱仪测定数据表明复合支架组成物有典型的壳聚糖、胶原峰,未发现有聚乙二醇峰.细胞/支架共培养24,48,72 h后,骨髓间充质干细胞可渗入支架多孔结构内,并黏附在支架上成簇生长,部分细胞已与支架融合.结论:壳聚糖-胶原支架基本符合软骨组织工程支架要求,能够作为种子细胞的承载体.     

羟基丁酸-羟基辛酸聚合物-胶原骨软骨支架的制备及应用

背景：关节软骨修复的关键是软骨和软骨下骨的整体修复,然而目前尚缺乏理想的一体化支架。目的：制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,并分析其基本生物学特性。方法：以聚羟基丁酸-羟基辛酸、Ⅰ型胶原为材料,通过溶剂浇铸-颗粒沥滤法制备聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架,观察支架超微结构,支架孔径及孔与孔的连通情况;液体置换法测定支架孔隙率。将乳兔骨髓间充质干细胞接种于聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原一体化支架上,扫描电镜观察细胞在支架上的黏附状态,MTT法测定细胞在支架上的生长曲线。结果与结论：一体化支架呈疏松多孔结构,软骨层孔径80-100μm,骨层孔径200-220μm,孔隙率（80.0±2.3）%。骨髓间充质干细胞在支架上黏附状态良好,增殖迅速。说明聚羟基丁酸-羟基辛酸-胶原骨软骨一体化支架具备适宜的孔隙结构和良好的生物亲和性。     

多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石复合骨髓间充质干细胞修复兔半月板无血运区软骨损伤

背景:随着组织工程的兴起,半月板无血运区损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架的要求,有一定的局限性。目的:观察丝素蛋白/羟基磷灰石复合骨髓间充质干细胞修复兔半月板无血运区软骨损伤的效果。方法:体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,并定向诱导成纤维软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养。42只构建半月板无血运区软骨损伤模型成功的大白兔随机抽签法均分为3组,复合材料组植入骨髓间充质干细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;单纯材料组植入丝素蛋白/羟基磷灰石;对照组不行任何干预。结果与结论:复合材料组大体观察损伤被修复组织填充,8~12周效果逐渐改善,与正常半月板组织相似,优于其他两组;组织学检查显示8周时出现软骨囊和排列紊乱的胶原纤维,12周时完全修复了半月板损伤区,表现为纤维软骨样组织愈合;单纯材料组部分修复了半月板损伤区,呈瘢痕愈合,对照组未见软骨修复。MRI检查显示复合材料组修复效果较好;说明丝素蛋白/羟基磷灰石复合骨髓间充质干细胞可有效地修复半月板无血运区缺损。丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为半月板软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。     

聚磷酸钙纤维/明胶软骨组织工程支架复合材料的制备及性能表征

背景:目前,以明胶为基体制备的组织工程支架材料存在力学性能低,生物相窖性差缺陷,其降解速率也难以控制.目的:希望研制一种以明胶为基体材料,降解速率可以控制旦具有良好的为学性能和生物相容性能的高空隙率软骨组织工程支架材料. 设计、时间及地点:单一样本观察,实验于:2006-06/2008-06在兰州交通大学工程材料研究所完成.材料:明胶,聚磷酸钙纤维(直径10-20μm),松香(颗粒尺寸为355-450μm),方法:选用自制聚磷酸钙纤维为增强材料,明胶为基体材料.采用溶媒浇铸、粒子滤取技术,制备出聚磷酸钙纤维/明胶组织工程支架复合材料. 主要观察指标:测试该支架复合材料的微观结构、物理性能、力学性能和降解特性.结果:①微观结构:该支架复合材料具有三维、连通、微孔结构,孔隙分布较均匀.②物理力学性能:聚磷酸钙纤维,明胶支架复合材料密度的实验值和计算值基本相吻合;孔隙率的实验值均在60%-80%,基本满足组织工程支架复合材料的空隙率要求.压缩模量随交联剂质量浓度的增加而增大.③降解性能:在0-2周内,支架复合材料的降解速率较大,2周以后,降解速率趋于平缓,随交联剂质量浓度的增大而减小,降解液的pH值基本保持在5-7之间.结论:聚磷酸钙纤维/明胶复合材料的物理力学性能和降解性能基本满足软骨组织工程支架材料的要求,该复合材料有希望成为软骨组织工程支架材料之一.