肝癌靶向性T细胞活化融合基因scFv-CD3ζ的构建与表达

目的 :构建抗肝癌单链抗体融合CD3 ζ真核表达载体。 方法 :应用PCR法将二硫键稳定的人源化的单链抗体scFv的基因克隆入真核细胞表达载体pcDNA3 ,在 5′端及 3′端分别引入相应酶切位点 ;用RT PCR法从正常外周血人T细胞扩增出CD3 ζ的胞内区、跨膜区基因 ,然后将其克隆于scFv的下游 ,并在5′端及 3′端引入相应的酶切位点。以脂质体转染法将pcDNA3 scFv CD3 ζ转入T细胞 ,采用免疫细胞化学的方法 ,利用抗CD3 ζ的单克隆抗体检测转染前后T细胞中CD3 ζ的表达。 结果 :二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv的cDNA片段为 73 5bp ,与已知的序列相符 ;CD3 ζ的胞内区、跨膜区的cDNA片段为 2 94bp ,与GeneBank公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。转染前后T细胞中CD3 ζ染色强度显著增强。 结论 :完成了二硫键稳定的人源化抗肝癌的单链抗体scFv及CD3 ζ的胞内区、跨膜区融合基因真核表达载体pcDNA3 scFv CD3 ζ的构建 ,制备了肝癌靶向性T细胞     

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的：应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因，探讨胃癌发生、发展的分子机制。方法：运用含18000个基因克隆的cDNA膜基因芯片，对6对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析。结果：6对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较，筛选出在3～6对标本中有2倍以上改变的基因克隆共有103条(1条在所有标本中均差异明显)，其中胃癌组织表达上调基因56条，胃癌组织表达下调基因47条。结论:人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程，基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法。     

肝癌微环境与调节性T细胞

调节性T细胞(Treg)的浸润是肿瘤免疫微环境抑制的重要机制之一.Treg在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织呈现高表达,其高表达很可能通过抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞的肿瘤杀伤效应或引起效应性T淋巴细胞对肿瘤抗原的耐受,而不产生急性或记忆性效应性T淋巴细胞反应,最终逃避免疫攻击,营造了机体免疫抑制微环境,介导肿瘤的免疫逃逸.

Abstract：

Regulatory T cell (Treg) infiltration is an important mechanism for inhibition of tumor immune microenvironment. Treg is highly expressed in peripheral blood and tumor tissue of various cancer patients. A high expression of Treg may inhibit the antitumor effect of CD4 + CD8 + T lymphocytes or induce immunological resistance to tumor antigens among cytotoxic T lymphocytes(CTL) without producing acute or memory CTL responses, resulting in tumor escape from immuneattack and immune suppressionin in the tumor microenvironment.     

肝癌微环境与调节性T细胞

调节性T细胞(Treg)的浸润是肿瘤免疫微环境抑制的重要机制之一.Treg在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织呈现高表达,其高表达很可能通过抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞的肿瘤杀伤效应或引起效应性T淋巴细胞对肿瘤抗原的耐受,而不产生急性或记忆性效应性T淋巴细胞反应,最终逃避免疫攻击,营造了机体免疫抑制微环境,介导肿瘤的免...     

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的：将不同长度的NGAL基因3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧翼非翻译序列)克隆到pGL3-Promoter(pGLP)载体中，通过检测报告基因荧光素酶活力，确认NGAL3′端序列中是否含有增强子或抑制子元件。方法：应用PCR技术从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同长度的NGAL基因片段F5(1880bD)和F7(826bp)，将其克隆到pGEM-T easy载体，并测序验证；再亚克隆到pGL3-Pro-moter载体中，获得pGLP-F5和pGLP-F7表迭栽体；将pGLP-F5和pGLP-F7载体分别与pRL-TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞，通过检测相对荧光素酶活力，确认这些NGAL基因片段中是否含有增强子元件。结果：我们成功构建了pGLP-F5和pGLPF7重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞与pGL3-Promoter相比，酶活力未表现出明显的增强或减弱。结论：在本研究的实验条件下，NGAL基因F5和F7片段内潜在的顺式作用元件并没有发挥作用，或作用不明显。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

大鼠肝癌高表达基因cDNA序列的克隆

目的克隆出大鼠肝癌高表达EST片段相关基因的cDNA完整表达序列,为进一步揭示其生物学功能奠定基础。方法通过基因芯片检测出DEN诱发的大鼠肝癌高表达的EST片段;其中部分高表达的EST片段,采用电子克隆与PCR相结合的方法,克隆出其cDNA完整表达序列。结果与正常大鼠肝组织比较,肝癌组织中明显高表达的EST片段有34个。采用EST电子克隆技术与PCR技术相结合的方法,成功克隆出4个EST片段的cDNA序列,经进一步BLAST对比分析,证明G15、G20、G36、G40等4个基因为新基因,并进行GenBank登录,登录号分别为DQ480746、DQ480747、DQ480744、DQ912022。结论利用大鼠基因芯片高通量地筛选出DEN诱发的肝癌组织高表达的有关基因,并在充分利用生物信息学资源的基础上,成功克隆出4个新基因的cDNA序列,为今后进一步深入观察这些基因的功能及其在肝癌发生、发展过程中的作用机制打下良好的研究基础。     

棘霉素对肝癌SMMC7721细胞凋亡相关基因影响的研究

目的：探讨棘霉素诱导肝癌SMMC7721细胞的凋亡作用及对转录因子Twist、p53、Survivin和hTERT（人端粒酶）基因的影响。方法：采用MTT法测定棘霉素对肝癌细胞的生长抑制率；半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测与肝癌的发生和转移密切相关的转录因子Twist，与细胞增殖和凋亡联系紧密的p53、Survivin和hTERT的mRNA表达水平的改变；利用Westernblot方法分析棘霉素治疗后上述基因的蛋白表达情况。结果：体外实验证实，棘霉素浓度〉10．0ng／mL各组对细胞的生长抑制均显著增加，P〈0．05，随棘霉素药物浓度增加，细胞抑制率明显增大。棘霉素抑制肝癌细胞株SMMC7721的作用呈剂量一时间依赖性。RT-PCR方法证实，随着棘霉素剂量的增加，肝癌SMMC7721细胞株中Twist、Survivin和hTERTmRNA表达水平逐渐下调，P〈0．01，p53mRNA表达水平微弱上调，P〈0．05。Westernblot检测显示，Twist、Survivin和hTERT蛋白的表达量呈递减趋势，P〈0．01，p53蛋白的表达微弱上调，P〈0．01。结论：随着棘霉素剂量的增加，细胞凋亡率显著增加。棘霉素能够抑制与肝癌生长密切相关基因的Twist、Survivin和hTERTmRNA表达，促进p53mRNA表达上调，相应蛋白的表达呈下调和上调。棘霉素可能通过抑制肝癌细胞的生长、转移和促进肝癌细胞的凋亡起到抑制肿瘤生长的作用。     

pcDNA3．0／PNP-CD和pcDNA3．0／PNP表达载体的克隆和表达

目的：构建新型PNP，Mep-dR自杀基因系统的融合和单基因表达载体。方法：利用DNA重组技术制备融合自杀基因PNP-CD．将其和PNP单基因分别插入真核表达载体pcDNA 3．0中，构建融合与单自杀基因表送载体pcDNA 3.0 PNP-CD和pcDNA 3．0 PNP;酶切、PCR及测序鉴定两重组体结果：成功构建了两个新型自杀基因载体并实现在HepG2肝癌细胞株中的表达。结论：两个新型自杀基因表达载体．尤其是I’Nt。CI)融合自杀基因载体．是肿瘤基因治疗中广谱、高效的治疗载体。     

表达FasL的肝癌细胞通过Fas/FasL诱导T淋巴细胞发生凋亡

目的研究发现肿瘤组织中FasL阳性表达区肿瘤浸润淋巴细胞的凋亡率比FasL阴性区高,推测肿瘤细胞可通过增加FasL表达来促使肿瘤浸润淋巴细胞凋亡.本实验在体外验证肝癌细胞是否可以诱导T淋巴细胞发生凋亡.方法选择FasL表达阳性的肝癌细胞(效应细胞)与对Fas介导凋亡敏感的活化T淋巴细胞共培养,取3种效靶比20:1,10:1,5:1.生长曲线法,流式细胞术,荧光显微镜观察分别检测T淋巴细胞的凋亡情况.结果流式细胞仪检测结果显示,肝癌细胞接种浓度为0(对照),0.5×105/ml,1×105/ml,2×105/ml时,T淋巴细胞凋亡率为1.80±0.21%,5.49±0.17%,11.18±0.14%,18.22±0.11%.荧光显微镜观察结果表明,肝癌细胞接种浓度为0(对照),0.5×105/m1,1×105/ml,2×105/ml时,T淋巴细胞凋亡率为1.58±0.12%,5.22±0.13%,9.74±0.21%,19.33±0.18%.3种效靶比条件下,肝癌均能诱导T淋巴细胞发生凋亡.随着肝癌接种浓度的升高及培养时间的延长,T淋巴细胞凋亡率逐渐增加,每个实验组与对照组比较P值均＜0.01.结论肝癌细胞可以通过Fas系统诱导淋巴细胞发生凋亡,这为肝癌的免疫逃逸和反攻击提供了证据.     

原发性肝癌患者外周血淋巴细胞Th1/Th2型细胞因子表达的测定

目的　检测原发性肝癌患者外周血 Th1/ Th2类细胞因子基因的表达 ,为细胞因子免疫治疗提供依据。方法　应用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)方法检测 30例原发性肝癌患者及 2 5例健康体检者外周血淋巴细胞IFN-γ、IL - 2、IL - 4及 IL - 10 m RNA的表达 ,以及用酶联免疫吸附 (EL ISA)方法检测血浆中 IFN-γ和 IL - 10的含量。结果　原发性肝癌患者 PBMC中 Th1型细胞因子 IL - 2 m RNA表达阳性率低于正常对照组 (P<0 .0 5 ) ,Th2型细胞因子 IL - 4和 IL - 10 m RNA表达阳性率明显高于正常对照组 (P<0 .0 1) ;原发性肝癌 、 与 期 IL - 10 m RNA表达阳性率比较差异均有显著性 ,随临床分期升高 ,IL - 10表达阳性率升高 ; 、 与 期原发性肝癌患者血浆中IFN-γ明显低于正常对照组 (P<0 .0 1) ,而 IL - 10明显高于正常对照组 (P<0 .0 1)。结论　原发性肝癌患者外周血单个核细胞及血浆中存在 Th1/ Th2平衡失调 ,呈 Th2型细胞因子优势表达现象。 IL - 10表达水平的提高可能与原发性肝癌病变的进程有关     

一个肝癌相关基因的生物信息学及其基因表达分析

筛选并克隆肝癌相关基因，探讨肝癌发病机制。方法：在国家人类基因组南方研究中心肝癌基因表达谱及其功能研究的工作基础上，发现1个未知功能基因（暂命名LLC基因），其DNA拷贝数在肝癌基因组中呈降低的趋势。本研究利用生物信息学和RT-PCR的方法，对其进行功能预测并在转录组水平检测该基因的表达。结果：LLC基因定位于染色体8p23.3区段，全长为6706bp，含有2个外显子，1个内含子，其开放阅读框长为1871bp，编码1个含有623个氨基酸的蛋白。该基因在67%（16/24）肝癌组织中呈现下调趋势。同时其在人体内多种组织均有表达。结论：LLC基因有可能是一个新的肝癌相关抑癌基因。     

人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha （hTNF-α） 基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型.方法： 应用RT-PCR 的方法从分离的正常人外周血单核细胞（LPS刺激）中,扩增出hTNF-αcDNA ,连接至载体pMD18-T vector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点, 转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Western blot鉴定;经脂质体Lipofectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达.结果：自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA 成功连接到pMD18-T vector,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Western blot证实此蛋白为hTNFα.克隆基因正确插入载体pBK-CMV中.pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后, ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达.结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA 全长的真核表达载体pBK-hTNFα.     

两种甲胎蛋白启动子调控下PNP基因载体的克隆和表达差异性分析

目的:分别构建甲胎蛋白(α- fetoprotein,AFP)启动子AF 0 3和AFP杂合启动子[HRE]AF调控的 PNP基因表达载体,检测并分析两者的表达差异性。方法: 将AF 0 3和[HRE]AF启动子插入载体 pcDNA- 3 .0 中,构建肝癌特异表达载体pAF- 0. 3 和 p[HRE]AF;将 PNP基因分别插入 pAF -0 .3 和 p[HRE] AF中,构建两启动子调控的 PNP基因表达载体;通过酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两重组体转染不同细胞株,RT PCR检测 PNP基因在各细胞株中表达,分析两者表达的特点。结果: 两目的片段均正确插入相应载体,pAF- 0 3/PNP中的 PNP基因在 AFP阳性肝癌细胞中实现了靶向性表达,而p[HRE] AF/PNP 中的 PNP 基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了靶向性表达。结论: 两种 PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效、特异性的治疗载体。两者的成功构建为利用PNP/Mep -dR系统进行肝癌的靶向性基因治疗奠定了坚实的基础。     

CD4^＋CD25^＋调节T细胞与肿瘤免疫治疗策略

随着分子生物技术的不断发展，肿瘤的生物治疗在临床应用中的地位日渐突出，其中CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋调节T细胞（CD4^＋CD25^＋Foxp^3＋regulatory T cell，Treg）在抑制肿瘤免疫方面起着重要作用，文章就其近年来在肿瘤免疫领域的研究进展作一综述。     

克隆性增殖T细胞的检测和研究进展

肿瘤部位出现大量淋巴细胞浸润的病人常有较好的预后，推测这是宿主对肿瘤相关抗原的一种直接反应。目前理想的检测是否存在针对肿瘤细胞的克隆性增殖Ｔ细胞的方法是ＣＤＲ３长度分析法。克隆性增殖了细胞的研究有助于进一步阐明肿瘤免疫机制，并有可能用于过继细胞免疫治疗。     

胃腺癌差异表达基因的cDNA微阵列研究

目的:应用cDNA基因芯片研究筛选人胃腺癌相关差异表达基因, 探讨胃癌发生、发展的分子机制。方法: 运用含18 000个基因克隆的cDNA膜基因芯片,对6 对胃腺癌及正常胃组织标本分别进行杂交检测并对比分析。结果: 6 对人胃腺癌与相对应的胃正常组织相比较,筛选出在3~6 对标本中有2 倍以上改变的基因克隆共有103条(1 条在所有标本中均差异明显),其中胃癌组织表达上调基因56条, 胃癌组织表达下调基因47 条。结论: 人胃腺癌癌变是一个多基因参与的过程, 基因芯片技术是一种快速有效的筛选人胃腺癌差异表达基因的方法。     

表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达小鼠CD1D基因的重组逆转录病毒载体并加以酶切鉴定。方法提取小鼠脾总RNA进行RT—PCR反应获基因，酶切真核表达载体得到目的基因，定向克隆连接到逆转录病毒载体上，得到重组逆转录病毒载体，使用酶切方法加以鉴定。结果酶切所得片段与所需相符，经测序证明为所需载体。结论获得重组的逆转录病毒载体，为今后进一步的研究奠定基础。     

T细胞因子4基因表达与肝癌侵袭转移的关系

目的　研究人T细胞因子 4基因 (hTcf- 4)在原发性肝癌及肝癌细胞株中表达情况 ,以探讨hTcf- 4基因与肝癌发生发展的关系。方法　用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR) ,检测了 32例原发性肝癌组织、癌旁组织及 5株肝癌细胞株中hTcf- 4基因表达。结果　hTcf- 4mRNA在癌旁组织中的表达率为 71 9% ,而在癌组织中的表达率达 90 6 %。且癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织 (P <0 0 0 1)。同时在肿瘤包膜不完整及有转移的癌组织中该基因表达明显增高。不同细胞株中均有hTcf- 4基因表达。肝癌细胞株中表达水平高于正常肝细胞株 (P <0 0 0 1) ,而高转移肝癌细胞株MHCC97中表达水平又高于低转移肝癌细胞株 (P <0 0 5 )。结论　hTcf- 4基因表达增高与肝癌发生发展及侵袭转移有关 ,提示hTcf- 4可能成为协助肝癌诊断、判断预后及疗效评价的指标。