定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达

目的在已构建的氧化胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库中,筛选细粒棘球蚴在抗氧化过程中差异表达的重要基因。方法将前期研究中应用抑制性消减杂交技术(suppression subtrac-tive hybridization,SSH)构建氧化胁迫下细粒棘球蚴差异表达基因的消减cDNA文库进行蓝白斑筛选和菌落PCR分析后测序分析。测序结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化胁迫下,差异表达基因片段在mRNA水平上的变化情况。结果整个文库克隆测序结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR结果显示:S88、H32-1两个基因在0.8mmol/LH2O2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别上调为未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段当H2O2浓度大于0.8mmol/L时,其表达量增高。结论上述基因的上调表达很可能与细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关功能有密切的联系,可以作为研究细粒棘球蚴抗氧化的候选基因。     

人源细粒棘球蚴染色体测定

为鉴定棘球地细胞系及棘球绦虫的遗传分类提供依据，本实验测定了人源细粒棘球拗染色体。从外科手术的包虫病人体内获取棘球蚴原头节和生发层细胞，按染色体的常规制备方法并加以改进，制备染色体标本。通过对141个分裂像的观察分析，结果表明细粒棘球蚴染色体组的染色体数在5～20条之间，14～18条占明显优势。每一核型有一对染色体呈大棒状，似呈中间或亚中着丝粒，其余染色体呈方点状，似呈端着丝粒。本实验建立了适合棘球蚴染色体制备的方法，在国内首次测定了人源细粒棘球蚴染色体。     

小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构观察

用透射电镜观察了小鼠细粒棘球蚴不育囊的超微结构。其囊壁由角皮层和生发膜构成,角度层含有纤维基质和不规则形颗粒,生发膜又可分皮层区和细胞区。在皮层区基部见到线粒体,微毛间见到“吞饮泡”样质膜凹陷;在细胞区主要有皮层细胞、肌细胞、含糖原细胞等,在有的含糖原细胞中还见到“核仁管系统。”     

疑似精索细粒棘球蚴病2例

<正>2003-2008年甘肃省金昌市第一人民医院普外科收治疑似精索细粒棘球蚴病2例,现报告如下。1病例资料病例1,男,42岁,牧民,裕固族,甘肃省肃南县人。因腹     

人体细粒棘球蚴的组织化学观察

包虫囊的组织形态学和超微结构，国内已有较多的报道［１－４］，但对包虫囊的组织化学观察尚少报道。作者对手术切除标本进行组织化学染色观察，旨在进一步探讨人体细粒棘球蚴的组织结构及其生物学意义。材料与方法受检对象为我院１９８１－１９９４年经手术证实的包虫病...     

卵巢细粒棘球蚴病一例

患者 ,女 ,3 8岁 ,锡伯族 ,农民。与犬有过密切接触史。发现腹部包块 2年 ,伴月经紊乱、尿频。临床上以“卵巢囊肿”收住院。患者既往身体健康。体检 :一般情况良好 ,心肺未见异常。B超显示子宫多发性平滑肌瘤 ,左卵巢囊肿 ,肝胆未见异常。临床行“全子宫及左卵巢囊肿切除术” ,术中见左卵巢囊肿直径 6cm ,病理诊断为左卵巢细粒棘球蚴病 ,子宫多发性平滑肌瘤。细粒棘球蚴病在新疆多见 ,好发于肝、肺等脏器 ,发生于卵巢者较少见[1] 。本病在临床上主要表现为下腹部肿块 ,扪之呈囊性感 ,由于肿块刺激或压迫膀胱、尿道等附近组织器官 ,可出现…     

细粒棘球蚴多肽抗原的研究

本文综述一细粒棘球蚴特异性蛋白的抗原表位研究，优势肽选择的研究近况以及多肽抗原在疫苗研制、蛋白质纯方面的应用前景。     

细粒棘球蚴DNA聚合酶链反应定量分析研究

细粒棘球蚴ＤＮＡ基因的研究 ,旨在通过对核酸序列结构的规律 ,判定细粒棘球绦虫遗传变异 ,不同虫株对中间宿主在感染性和致病性等方面存在差异 ,同时也与包虫病的流行防治直接相关。细粒棘球蚴生物学的研究 ,主要以酶切图谱 ,核酸杂交和基因重组等实验技术 ,对ＤＮＡ核酸序列的分析已取得了重组进展。本实验应用ＰＣＲ技术与计算机ＧＶＡ -Ｐ6基因量分析系统结合 ,对细粒棘球蚴ＤＮＡ的部分核苷酸作观察。1　材料和方法1 1　细粒棘球原头蚴采集于海北地区 6株、海西地区 6株、临床诊断包虫病 ,手术摘取囊蚴 1株 ,病例来源于海南州牧民。无…     

抗细粒棘球蚴单克隆抗体在检测包虫病中的应用

本研究利用ＢＡＳ的生物放大作用［１］，应用生物素－抗生物素抗原斑点试验（ＡＢＣ－ＡＳＴ）［２，３］，将抗细粒棘球蚴单克隆抗体用于检测包虫病患者血清抗原。材料与方法１试剂和药品１．１抗细粒棘球蚴单克隆抗体细胞株诱生腹水由本室采用细胞融合方法，获得稳定分...     

塞来昔布对细粒棘球蚴原头节生长及p-ERK2表达的影响

目的探索塞来昔布对细粒棘球蚴原头节体外生长及p-ERK2表达的影响。方法实验分组为1640培养基组、DMSO组、塞来昔布溶液(50、100、150、200μmol/L)中体外孵育,在倒置焦镜下观察原头节的形态变化,同时通过0.1%伊红染色显示原头节活力。运用Western blot检测DMSO、100、150、200μmol/L塞来昔布处理细粒棘球蚴原头节48h后p-ERK2蛋白的表达量。结果体外孵育7d后,DMSO组及空白1640对照组原头节的活力几乎没有改变。塞来昔布作用1d后,100、150、200μmol/L组原头节的活力均下降;作用3d后,200μmol/L组原头节全部被杀死,150μmol/L组的原头节活力为43.9%。100μmol/L、50μmol/L组对原头节的活力也有明显下降,但不及高浓度组显著。Western blot结果显示P-ERK2的表达量随浓度增加而下降趋势明显。结论塞来昔布能够抑制细粒棘球蚴原头节生长,这可能与塞来昔布下调P-ERK2的表达进而抑制ERK2信号传导通路有关。     

细粒棘球蚴2HSP70重组质粒的构建、原核表达、纯化和初步鉴定

目的构建细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus，EG）2热休克蛋白70（heat shock protein，2HSPT0）表达重组质粒，原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法从EG2HSP70／pGEM-T／JM109质粒中分离EG2HSP70目的基因，将此片段重组入表达载体pGEX-6P-1后转化入大肠杆菌BL21，鉴定后以IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE检测其表达水平，用亲和层析纯化并分离重组蛋白，利用Western blot来鉴定重组蛋白的免疫学特性。结果酶切鉴定及测序分析表明，成功构建细粒棘球蚴pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒；IPTG诱导表达后，融合蛋白占菌体总蛋白的39％，占裂解物上清总蛋白的70．4%，表明重组的EG2HSP70基因能在BL21中高效表达，表达的蛋白大部分以可溶性状态存在。亲和层析法纯化重组蛋白EG2HSP70，通过Western blot证实该重组蛋白能被细粒棘球蚴囊壁免疫兔血清识别。结论成功构建细粒棘球蚴中国大陆株pGEX-6P-1／EG2HSP70重组质粒，重组的EG2HSP70能够高效表达，表达的EG2HSP70具有免疫学活性。     

细粒棘球蚴MKKl和MKK2基因原核表达载体的构建及其诱导表达

目的分别构建细粒棘球蚴（Eg）丝裂原活化蛋白激酶激酶MKK1和MKK2基因原核表达载体,诱导表达并纯化EgMKK1和EgMKK2蛋白。方法采集绵羊肝脏感染的Eg原头蚴,Trizol法提取原头蚴总RNA,反转录PCR分别扩增EgMKK1和EgMKK2基因片段,克隆至原核表达载体pET28a（＋）,经限制性内切酶双酶切和测序鉴定正确后转化大肠埃希菌感受态细胞BL21,异丙基-G-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化蛋白,并进行SDS-PAGE分析。结果测序证明pET28a-EgMKK1和pET28a-EgMKK2原核表达载体构建正确,在37℃经IPTG（终浓度1mmol／L）诱导可表达EgMKK1和EgMKK2蛋白,分子质量单位分别为44．96ku和64．0lku,与理论值相符,且以包涵体形式存在。表达产物纯化后的可溶性蛋白EgMKK1和EgMKK2含量分别为0．64mg／ml和1．2mg／ml。结论成功构建了MKK1和MKK2基因原核表达载体,表达蛋白可用于动物免疫,为研究EgMKK1和EgMKK2在Eg体内的生物学作用奠定了基础。     

巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用

目的 探索巢式PCR在鉴别多房棘球绦虫及细粒棘球绦虫基因亚型中的应用价值.方法 将水泡带绦虫、犬弓首蛔虫、多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫羊株和骆驼株等样本的DNA用巢式PCR扩增.结果 巢式PCR可以扩增出多房棘球绦虫和水泡带绦虫,而对细粒棘球绦虫羊株和骆驼株及其他寄生虫均不能扩增出.结论 在鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫方面,巢式PCR有一定的诊断意义,但不能用于鉴别细粒棘球绦虫基因亚型.     

犬体内细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染

目的 证实家犬体内是否存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。方法 从新疆和静县巴音布鲁克草原现场收购的30条牧羊犬,经麻醉后处死解剖,在1只雌性牧羊犬小肠内发现棘球绦虫成虫1万条以上,经显微镜观察,疑为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫混合感染。用Eg1f/r和EM-15/17EM引物分别对两种棘球绦虫的线粒体DNA特异目的片段进行序列分析鉴定。结果 形态学观察:细粒棘球绦虫孕节长大,生殖孔偏后,位于节片一侧中部。子宫有不规则的分支和侧突(侧囊),内含虫卵200~800个。多房棘球绦虫较短小,4~5体节。孕节中子宫呈简单的囊状,无侧囊。生殖孔开口于侧缘的前半部。线粒体12S RNA序列鉴定,扩增样本DNA经同源序列比较发现,与细粒棘球绦虫G1型具有相同的序列;扩增样本与多房棘球绦虫具有相同的序列。分别确定为细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种虫种。结论 首次证实家犬体内存在细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的混合感染。     

细粒棘球绦虫精子形成的超微结构观察

用透射电镜观察了细粒棘球绦虫精原细胞、精母细胞、精细胞的发育变化和精子的主要形态结构特点，从而揭示了该虫精子的形成过程。结果显示细粒棘球绦虫的精子形成主要是由于精细胞内微管结构的多次排列组合形成的。精细胞和精子中无线粒体和顶体结构。成熟的精子可分为头部和尾部。头部色较淡，顶端有与精子轴丝呈30°角排列的明暗相间的带构成的帽状物包裹。完整精子结构为固有膜包统一条轴丝，轴丝向前伸入头部，向后延伸至尾部。固有膜内线有微管排列，尾部前段一例可有2层做管，多为“2×4＋1，”结构，后段为一层微管紧贴固有腹内缘。抽丝有一个中央微管和9对外周微管组成，中央微管的外围有一个纤维鞘包绕，由纤维鞘发出纤维丝与外周9对微管相连，形成一个车轮状的“9＋1”微管系统结构。     

细粒棘球绦虫原头蚴复合染色方法的探讨

目的 改进染色方法，制作结构清晰、颜色对比鲜明的细粒棘球绦虫原头蚴标本。方法 原头蚴经4％孔雀绿36℃初染48h后，分别用石碳酸复红、稀释石碳酸复红、沙黄、伊红，醋酸洋红，苏木精洋红，盐酸洋红染液复染。结果 经4％孔雀绿初染的原头蚴标本分别用稀释石碳酸复红或沙黄染液复染5s、伊红染液复染30s、洋红染液复染5min均能获得满意效果。染色后原头蚴头钩呈亮绿色，吸盘和其余实质部分着淡红色或浅紫红色，层次分明，立体感强。结论 用孔雀绿初染，用红色染液复染制作原头蚴标本，染色效果好，操作简单，值得推广。     

细粒棘球绦虫基因型的微卫星分析

目的利用细粒棘球绦虫微卫星序列为分型标记,建立高效、快速、简便的鉴定细粒棘球绦虫基因型技术。方法采用FAM和HEX两种不同荧光染料分别标记细粒棘球绦虫的Sca、Emsk、C106微卫星序列引物,利用荧光PCR-基因扫描技术鉴定新疆不同地区CE病人细粒棘球绦虫分离株的基因型。结果44例CE病人的66个分离株标本经PCR及微卫星标记鉴定均为细粒棘球绦虫,其中43例病人的65个细粒棘球绦虫分离株标本为G1基因型;1例病人的1个细粒棘球绦虫分离株标本为G6基因型。结论微卫星标记能够从基因水平快速、精确地鉴定新疆细粒棘球绦虫分离株的基因型,对细粒棘球绦虫的流行病学和致病性研究有重要价值。     

细粒棘球绦虫亲环蛋白基因的克隆 重组表达和生物信息学分析

目的 克隆表达细粒棘球绦虫亲环蛋白 （EgCyP） 基因, 并对其进行生物信息学分析。方法 从细粒棘球绦虫cD? NA中扩增目的基因, 克隆入表达载体pET28a, 转化大肠埃希菌 （E.coli） BL21 （DE3）, 经异丙基?β?D硫代半乳糖苷诱导表达后, 进行SDS?PAGE和免疫印迹试验鉴定, 并对其进行生物信息学分析。 结果 重组质粒pET28a?EgCyP构建成功。SDS? PAGE和免疫印迹试验结果显示, 重组蛋白在E.coli BL21 （DE3） 中获得高效表达, 重组蛋白EgCyP分子量约为22 kDa, 可被细粒棘球绦虫感染犬血清识别。生物信息学分析显示该蛋白具有7个潜在的抗原表位。 结论 成功克隆出细粒棘球绦虫EgCyP基因并在E.coli BL21 （DE3） 中表达, 为进一步研究其免疫原性奠定了基础。