定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达

目的在已构建的氧化胁迫下细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)与正常组织差异表达的消减cDNA文库中,筛选细粒棘球蚴在抗氧化过程中差异表达的重要基因。方法将前期研究中应用抑制性消减杂交技术(suppression subtrac-tive hybridization,SSH)构建氧化胁迫下细粒棘球蚴差异表达基因的消减cDNA文库进行蓝白斑筛选和菌落PCR分析后测序分析。测序结果利用BLAST在线软件与GenBank数据库进行同源序列比对分析和BlastX分析。从文库中随机挑选4个未知新序列和抗氧化密切相关的TPx基因片段,利用定量PCR法研究氧化胁迫下,差异表达基因片段在mRNA水平上的变化情况。结果整个文库克隆测序结果获得重要基因的cDNA序列,如氧化还原酶、蛋白激酶、生长因子等。另有部分克隆在GenBank中无法查到对应的同源基因,可能代表了新基因。定量PCR结果显示:S88、H32-1两个基因在0.8mmol/LH2O2氧化胁迫的原头蚴中表达量分别上调为未经氧化胁迫原头蚴中的2.0和2.3倍,TPx基因片段当H2O2浓度大于0.8mmol/L时,其表达量增高。结论上述基因的上调表达很可能与细粒棘球蚴在抗氧化过程中的相关功能有密切的联系,可以作为研究细粒棘球蚴抗氧化的候选基因。     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

细粒棘球蚴cDNA文库的构建和免疫筛选

目的 构建细粒棘球蚴原头节的λZAPⅡcDNA文库,并对构建的文库进行免疫筛选.方法 采集感染细粒棘球蚴的绵羊育囊中的原头节,用Trizol试剂抽提总RNA,用mRNA纯化试剂盒纯化mRNA作为模板合成cDNA,并对其进行末端平端化、EcoR Ⅰ接头连接和磷酸化及Xho Ⅰ酶切,然后应用Sepharose CL-2B分离柱对其进行分级分离,收集大于500 bp的cDNA片段,使用GigapackⅢGold试剂盒将合成的cDNA连接到λZAP-Ⅱ载体,并将重组载体包装到λZAP-Ⅱ噬菌体中,构建细粒棘球蚴cDNA文库.用囊型棘球蚴病患者混合血清对所构建的文库进行免疫筛选,并用NCBI中的Blast模块及其它生物信息软件对筛选出的阳性克隆进行生物信息学分析.结果 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,文库的滴度为1.8 ×105噬菌斑形成单位(plaque forming unit,pfu)/ml,插入片段长度范围在1.0～4.0 kb间,平均插入片段长度为2.6 kb,插入效率为93.8％.对所构建的文库进行免疫筛选,共筛选到5个阳性克隆,其中有2个为细粒棘球蚴新发现基因,新发现基因存在众多B细胞表位.结论 成功构建了细粒棘球蚴原头节λZAPⅡcDNA文库,初步免疫筛选得到2个新发现基因,生物信息学分析预测它们具有潜在的诊断价值.     

细粒棘球蚴内蒙株FABP基因cDNA的克隆与核酸疫苗的构建

【提要】 根据GenBank中细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)基因cDNA序列设计引物, 并在起始密码子前加上Kozak 序列(CCACC),提取细粒棘球蚴(内蒙株)的原头蚴总RNA,RT-PCR扩增目的基因。回收其纯化的产物克隆到 pMD19-T载体后进行序列分析。克隆到的FABP基因cDNA序列长402 bp,开放阅读框(ORF)编码133个氨基酸。FABP基因cDNA亚克隆到pcDNA3.1(+)中,构建核酸疫苗pcDNA3.1-FABP-NM, 经测序验证, 结果正确。     

细粒棘球绦虫DNA聚合酶δ小亚基EgPolD2基因的克隆及序列分析

目的从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴中克隆DNA聚合酶δ小亚基EgPolD2,进行序列测定和生物信息学分析。方法设计EgPolD2特异性引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆EgPolD2基因,然后将其克隆至pMD18-T载体,测序并进行生物信息学分析,半定量反转录PCR分析其在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中的表达情况。结果 EgPolD2基因开放阅读框为1 218bp,编码405个氨基酸,等电点为4.74。NCBI保守功能区分析软件预测EgPolD2蛋白第113～378个氨基酸为MPP_PolD2_C结构域。登陆GenBank进行Blast比对,EgPolD2与曼氏血吸虫SmPolD2基因同源性为32.1%,与线虫和人等其他物种PolD2基因同源性在18.3%～22.8%之间。进化树分析表明EgPolD2与SmPolD2相聚集,与其他物种同源性较低。半定量RT-PCR显示,EgPolD2在细粒棘球绦虫原头蚴和囊泡中均有表达,且表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论本实验成功克隆出细粒棘球绦虫EgPolD2新基因,为进一步研究抗细粒棘球绦虫药物靶标奠定了基础。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

细粒棘球绦虫的副肌球蛋白:皮层抗原的cDNA序列及其特征

作者采用基因重组技术,用大肠杆菌的真核细胞表达细粒棘球绦虫幼虫的λ ZAPIIcDNA文库。用抗细粒棘球蚴原头节的兔血清检测cDNA文库,发现几株具免疫反应性的克隆。将克隆的cDNA片段转入pBlueskript噬菌粒中进行亚克隆,再用双脱氧链终止法获DNA序列。测定克隆的插入片段3′端核苷酸序列,表明其中3株具有相     

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的　分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法　采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论　成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。     

应用抑制消减杂交技术筛选大肠癌新相关基因

目的利用抑制消减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）构建人大肠癌差异表达cDNA文序，分离并克隆出大肠癌发病的相关新基因。方法运用抑制消减杂交技术分离大肠癌组织及癌旁正常黏膜差异表达基因的cDNA片断，将其与T载体连接构建文库，从库中随机挑取200个白色菌落．使用PCR方法鉴定阳性克隆并对其中50个克隆进行测序，将测序结果登录GenBank进行卜司源性对比分析，并对部分有意义的差异表达片断进行Virtual Northern Blot分析。结果成功构建人源性大肠癌消减cDNA文库，通过筛选获得20个差异表达的基因，其中有2个片断未检测到同源性序列，根据杂交结果考虑可能是存大肠肿瘤中差异表达的新基因。结论运用SSH技术成功构建了人大肠癌的差异表达的cDNA消减杂交文库，并筛选出2个存大肠肿瘤中差异表达的新基因。     

应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因

目的 构建转化生长因子(TGF)β1刺激大鼠肝星状细胞(LX02)反式调节基因的cDNA消减文库,筛选并克隆TGF β1反式调节相关基因,以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制.方法 以TGF β1刺激LX02细胞,同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照.提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆;随机挑取其中35个克隆进行测序,30个列序成功,并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源.结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库,筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成,信号传导、细胞外基质代谢、扰脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因,为进一步阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索.     

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒E1蛋白反式激活基因

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)E1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVE1蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVE1表达质粒pcDNA3 .1( -) E1转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( -)为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果　成功构建人HCVE1蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 89个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 10 0 10 0 0bp插入片段。挑取 46个含有插入片段的阳性克隆测序分析 ,获得 44个已知基因序列和 2个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。结论　应用SSH技术成功构建了HCVE1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE1反式调节的靶基因及致肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

Screening and cloning for proteins transactivated by the PS1TP5 protein of hepatitis B virus： A suppression subtractive hybridization study

AIM:To clone and identify human genes transactivated by PS1TP5 by constructing a cDNA subtractive library with suppression subtractive hybridization(SSH)technique.METHODS:SSH and bioinformatics techniques were used for screening and cloning of the target genes transactivated by PS1TP5 protein.The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-myc-his(A)-PS1TP5 and pcDNA3.1(-)-myc-his(A)empty vector,respectively,and SSH technique was employed to analyze the differentially expressed DNA sequence between the two groups.After digestion with restriction enzyme RsaⅠ,small size cDNAs were obtained.Then tester cDNA was divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2,respectively.The tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and subjected to nested PCR for two times,and then subcloned into T/A plasmid vectors to set up the subtractive library.Amplification of the library was carried out with E.coli strain DH5α.The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Vector NTI 9.1 and NCBI BLAST software after PCR amplification.RESULTS:The subtractive library of genes transactivated by PS1TP5 was constructed successfully.The amplified library contained 90 positive clones.Colony PCR showed that 70 clones contained 200-1000-bp inserts.Sequence analysis was performed in 30 clones randomly,and the full-length sequences were obtained by bioinformatics technique.Altogether 24 coding sequences were obtained,which consisted of 23 known and 1 unknown.One novel gene with unknown functions was found and named as PS1TP5TP1 after being electronically spliced,and deposited in GenBank(accession number:DQ487761).CONCLUSION:PS1TP5 is closely correlated with immunoregulation,carbohydrate metabolism,signal transduction,formation mechanism of hepatic fibrosis,and occurrence and development of tumor.Understanding PS1TP5 transactive proteins may help to bring some new clues for further studying the biological functions of pre-S1 protein.     

Study of transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus and cloning of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization

AIM: To investigate the transactivating effect of pre-S2 protein of hepatitis B virus (HBV) and construct a subtractive cDNA library of genes transactivated by pre-S2 protein with suppression subtractive hybridization (SSH) technique, and to pave the way for elucidating the pathogenesis of HBV infection. METHODS: pcDNA3.1(-)-pre-S2 containing pre-S2 region of HBV genome was constructed by routine molecular methods. HepG2 cells were cotransfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ and empty pcDNA3.1(-)/pSV-lacZ. After 48 h, cells were collected and detected for the expression of β-galactosidase (β-gal). SSH and bioinformatics techniques were used, the mRNA of HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 and pcDNA3.1(-) empty vector was isolated, respectively, cDNA was synthesized. After digestion with restriction enzyme RsaI, cDNA fragments were obtained. Tester cDNA was then divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR, amplified cDNA fragments were subcloned into pGEM-Teasy vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E.coli strain DH5oα. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR. RESULTS: The pre-S2 mRNA could be detected in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-pre-S2 plasmid. The activity of β-gal in HepG2 cells transfected with pcDNA3.1 (-)-pre-S2/pSV-lacZ was 7.0 times higher than that of control plasmid (P<0.01). The subtractive library of genes transactivated by HBV pre-S2 protein was constructed successfully. The amplified library contains 96 positive clones. Colony PCR showed that 86 clones contained 200-1 000 bp inserts. Sequence analysis was performed in 50 clones randomly, and the full length sequences were obtained with bioinformatics method and searched for homologous DNA sequence from GenBank, altogether 25 coding sequences were obtained, these cDNA sequences might be the target genes transactivated by pre-S2 protein. CONCLUSION: The pre-S2 protein of HBV has transactivating effect on SV40 early promoter. The obtained sequences may be target genes transactivated by pre-S2 protein among which some genes coding proteins involved in cell cycle regulation, metabolism, immunity, signal transduction and cell apoptosis.This finding brings some new clues for studying the biological functions of pre-S2 protein and further understanding of HBV hepatocarcinogesis.     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因克隆化的研究

目的 应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HBX反式激活相关基因。方法 以HBX表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照。制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaⅠ酶切后，将实验组cDNA分成两组。分别与两组不同的接头衔接，再对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制聚合酶链反应（PCR），将产物与T/A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库；文库扩增后得到85个白色克隆，进行菌落PCR分析。均得以200-1000bp插入片段，挑取含有插入片段的65个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得19种已知基因序列。和15个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了HBX反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HBX反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选血小板衍生生长因子上调的大鼠肝星状细胞靶基因

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建血小板衍生生长因子（PDGF）-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库,从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制。方法以PDGF-BB刺激的HSC作为实验组,以未用PDGF-BB刺激的HSC作为对照组,分别收获细胞提取总mRNA,并逆转录为cDNA。经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增。将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果成功构建了PDGF-BB刺激HSC差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到93个200～1000 bp的插入片段。挑取含有插入片段的31个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得13种已知基因序列,主要包括电压依赖性阴离子通道、热休克蛋白质47、Ras家族基因RAN等蛋白质基因。结论PDGF- BB作为最有效的促有丝分裂原在激活HSC过程中上调某些与细胞生长相关的蛋白质、参与细胞内代谢的蛋白质及分子伴侣蛋白质等基因的表达,这将为进一步阐明PDGF-BB刺激HSC介导肝纤维化的分子生物学机制提供理论依据。