人基质金属蛋白酶-1融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备与初步应用

目的 :获得兔抗人基质金属蛋白酶 1 (MMP 1 )多克隆抗体 ,并将其初步应用于临床检测。方法 :将人MMP 1融合蛋白经亲和层析法纯化 ,并将其作为抗原免疫家兔 ,获得兔抗血清 ,经饱和硫酸铵纯化 ,获得初步纯化的兔抗人MMP 1多克隆抗体。用双抗夹心间接酶联免疫吸附实验 (ELISA)测定正常对照、慢性肝病、肝硬化患者血清MMP 1的OD值。结果 :获得初步纯化的兔抗人MMP 1特异性多克隆抗体 ,该抗体能与人MMP 1起反应。结论:制备的MMP 1多克隆抗体可初步用于临床检测     

抗人端粒重复序列结合因子多克隆抗体制备及纯化

目的 制备并纯化抗人端粒重复序列结合因子片段（TRF1^33-277)的多克隆抗体。方法 运用基因工程的方法表达人工TRF1^33-277，将表达蛋白经亲和层析大量纯化后免疫白哆，制备血清过柱纯化，将TRF1^33-277和GST交连于CNBr-活化的Sephrose4B柱，血清过GST柱以去除抗GST抗体，然后经GST-TRF1柱吸收抗TRF1抗体，获得兔抗人TRF1多克隆抗体。结果 用此抗体作为一抗。在人膀胱癌细胞总蛋白中检到68KD的特异条带，与阳对照基本一致。结论 兔抗人TRF1多克隆抗体制备方法有效。所获抗TRF1^33-277多克隆抗体为国内首次报道。     

兔抗人TGF-β_1多克隆抗体的制备

目的以人重组TGF-β1蛋白作为抗原,制备兔抗人TGF-β1多克隆抗体。方法重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀,免疫新西兰白兔,获得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。饱和硫酸铵盐析法纯化多克隆抗体,间接酶联免疫吸附试验检测多克隆抗体效价,Western-blot技术进行抗体特异性检测。结果成功获得兔抗人TGF-β1多克隆抗体,纯化后抗体效价达1∶110 000。结论获得的兔抗人TGF-β1多克隆抗体具有良好的特异性,能满足进一步实验的需要。     

抗rhANG多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备抗重组人血管生长素(recombinant human angiogenin，rhANG)多克隆抗体，并初步应用于消化道肿瘤实验研究。方法 用重组基因工程菌表达，SDS法纯化的rhANG蛋白免疫新西兰兔，制备并纯化多克隆抗体，并用免疫组织化学和ELISA等方法对多克隆抗体进行测定。结果 此次获得的抗血清ELISA方法效价达1：12800，检测ANG灵敏度最低为8～16μg／L，不与其他细胞因子和血清反应。该抗体与20％～30％消化道恶性肿瘤呈阳性反应。结论 ANG多克隆抗体对表达ANG的肿瘤组织反应特异性强，ELISA方法检测灵敏度高，该抗体可用于ANG的检测。     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

抗泡球蚴重组Em18抗原多克隆抗体的纯化与鉴定

目的：制备抗泡球蚴18（Em18）抗原多克隆抗体,纯化并鉴定.方法：表达并纯化rEm18-GST蛋白.用纯化后的蛋白作为免疫原,免疫新西兰白兔获得抗rEm18-GST的多克隆抗体IgG,采用ELISA法检测抗体效价,进一步纯化抗体,获得抗Em18特异性多克隆抗体IgG,用Western blot及ELISA法检测并进行初步鉴定.结果：免疫制备获得兔抗rEm18-GST抗体,随着免疫次数的增加,抗体滴度不断升高,于第10周达到最高.ELISA检测抗体效价为1∶51 200.Western blot及ELISA法鉴定表明Em18-GST抗体去除了与GST的交叉反应.结论：获得了去除与GST交叉反应的抗Em18多克隆抗体,为进行噬菌体肽库筛选奠定基础.     

兔抗人RBBP10多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人RBBP10多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组PTC-hRBBP10融合蛋白,表达产物以直链淀粉树脂亲合柱和superose 12凝胶柱过滤纯化,将纯化的PTC-hRBBP10偶联于NHS-activated SepharoseTM上,制备亲合层析柱,纯化兔抗人RBBP10多克隆抗体。结果①表达、纯化的PTC-hRBBP10的相对分子质量(Mr)为80×103,纯度为95%;②从抗血清中纯化获得可与PTC-hRBBP10特异性结合的兔抗人RBBP10多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗人RBBP多克隆抗体,为进一步研究该蛋白质的功能提供了条件,为肿瘤的诊断和治疗提供了新的理论和手段。     

热休克因子4b多克隆抗体制备及纯化

目的制备兔抗人热休克转录因子4b(Hsf4b)多克隆抗体。方法利用实验室已纯化的GST-Hsf4b融合蛋白免疫新西兰大耳白兔3次,制备Hsf4b多克隆抗体血清,ELISA方法检测血清抗体效价,饱和硫酸铵纯化血清多克隆抗体,Western blot检测多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合能力。结果 ELISA检测显示,经过三次免疫,获得了高效价的兔抗人Hsf4b多克隆抗体;Western blot检测表明,制备的兔抗人Hsf4b多克隆抗体与Hsf4b蛋白结合良好。结论成功制备了高效价的抗Hsf4b多克隆抗体,为研究Hsf4b生物学功能提供了有用的实验工具。     

肝硬化患者血清MMP-2和TIMP-1的测定及临床意义

目的观察肝硬化患者血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其抑制因子基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的含量变化,探讨其在肝硬化发生发展过程中的作用和意义.方法用ELISA法检测30例慢性乙型病毒性活动性肝炎、30例肝硬化患者以及32例健康体检者血清MMp-2和TIMP-1的含量.结果与正常对照组相比,肝硬化组血清MM P-2水平升高,(P＜0.05);而慢性活动性肝炎血中MMP-2值与对照组无差别.慢性活动性肝炎组、肝硬化组血清TIMP-1水平显著高于对照组(P＜0.05).结论血清MMP-2水平可检测肝硬化,在慢性活动性肝炎病人若MMP-2水平升高则可表明已发展为肝硬化;血清TIMp-1水平可反映病人的慢性肝脏炎症及纤维化.     

慢性肝病患者血清MMP-3、TIMP-1水平在肝纤维化进程中的临床意义

目的 观察慢性乙型肝炎后肝病患者血清MMP-3、TIMP-1水平变化,探讨其在慢性肝病肝纤维化进程中的临床意义.方法 采用ELISA方法检测25例慢性乙型肝炎患者、53例乙型肝炎后肝硬化患者、31例肝癌患者及27例正常对照者血清MMP-3、TIMP-1水平.结果 与正常对照组比较,肝硬化代偿期患者血清MMP-3水平明显增高（P〈0.01）,肝硬化失代偿期患者和肝癌患者血清TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-3比值明显增高（P〈0.05）;慢性乙型肝炎MMP-3、TIMP-1水平及TIMP-1/MMP-3比值均升高（P〈0.01）.肝硬化失代偿期与代偿期比较,血清MMP-3水平明显下降,TIMP-1/MMP-3比值则明显增高（P〈0.01）.结论 TIMP-1、MMP-3作为对肝纤维化评价的血清指标,联合检测比单独检测TIMP-1更具实用价值.TIMP-1、MMP-3在临床上对肝纤维化的监测和治疗效果的评价具有无损伤及快速便捷的优势,动态检测可作为评估慢性肝病患者肝纤维化进程及治疗效果的有效指标.     

日本血吸虫26kDa谷胱苷肽-S-转移酶抗血清的制备

目的制备日本血吸虫26kDa谷胱苷肽-S-转移酶免疫血清。方法大量诱导表达日本血吸虫26kDa谷胱苷肽-S-转移酶，予亲和层析纯化；用纯化蛋白免疫家免，制备谷胱苷肽-S-转移酶的免疫血清。结果亲和层析纯化获得26kDa谷胱苷肽-S-转移酶，融合蛋白免疫家免三次后获得谷胱苷肽-S-转移酶的免疫血清，其滴度达1：12800。结论纯化的谷胱苷肽-S-转移酶免疫家兔诱导产生了高滴度的抗体。     

流行性乙型脑炎病毒重组E蛋白的纯化及多克隆抗体制备

目的：纯化原核表达的JEV E蛋白并制备其多克隆抗体。方法：IPTG诱导大肠杆菌表达JEV E蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化。将纯化后的JEV E蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗血清。琼脂糖双向扩散实验及间接ELISA检测抗体效价。结果：获得浓度1.85mg/ml、纯度92%的JEV E蛋白,并制备了JEV E蛋白兔多克隆抗体血清。琼脂糖双向扩散实验显示多克隆抗体血清1∶16稀释时仍能观察到沉淀线,间接ELISA法显示1∶200稀释时具有较高效价。结论：纯化了JEV E蛋白,并制备出了多克隆抗体。     

肝硬化患者血清中基质金属蛋白酶-3、 基质金属蛋白组织抑制因子-1 水平与肝硬化进程的研 究简

目的 探讨肝硬化患者血清中的基质金属蛋白酶-3（MMP-3）和基质金属蛋白组织抑制因子-1 （TIMP-1）值对于肝硬化进程的影响.方法 分析台州恩泽医疗集团路桥医院2011年1月～2012年6月收治的30例乙型肝炎后肝硬化代偿期患者（代偿组）及30例失代偿期患者（失代偿组）的临床资料,30名健康者作为正常对照组.采用BAS-ELISA法测定MMP-3的血清含量,同时采用ELISA双抗体夹心法测定TIMP-3的浓度;计算TIMP-1/MMP-3的比值.对比两组患者的MMP-3、TIMP-1的临床指标的异同.结果 ①代偿组患者血清MMP-3水平[（20.32±3.10） ng/mL]显著高于正常对照组血清MMP-3水平[（17.45±2.30）ng/mL],差异有统计学意义（P＜ 0.05）;代偿组患者血清TIMP-1水平[（1.72±0.40）ng/mL]显著高于正常对照组[（1.49±0.30）ng/mL],差异有统计学意义（P＜0.05）;代偿组TIMP-1/MMP-3值为（0.088±0.010）,比正常对照组TIMP-1/MMP-3值（0.086±0.010）有所升高,但差异无统计学意义（P＞0.05）.②失代偿组患者血清MMP-3水平[（22.73±5.20）ng/mL]显著高于正常对照组[（17.45±2.30）ng/mL],差异有统计学意义（P＜0.05）;失代偿组患者血清TIMP-1水平[（2.24±0.30）ng/mL]显著高于正常对照组[（1.49±0.30）ng/mL],差异有统计学意义（P＜0.05）;失代偿组患者TIMP-1/MMP-3值为（0.103±0.020）,显著高于正常对照组（0.086±0.010）,差异有统计学意义（P＜0.05）.③失代偿组患者血清中MMP-3水平显著高于代偿组患者,差异有统计学意义（P＜0.05）;失代偿组患者血清TIMP-1水平显著高于代偿组患者,差异有统计学意义（P＜0.05）;失代偿组患者TIMP-1/MMP-3值显著高于代偿组患者,差异有统计学意义（P＜ 0.05）.结论 代偿期肝硬化患者MMP-3以及TIMP-1皆显著升高,TIMP-1/MMP-3比值有升高趋势.失代偿期肝硬化患者MMP-3以及TIMP-1皆显著升高,TIMP-1/MMP-3比值显著升高.MMP-3/TIMP-1的比值与TIMP-1的表达与肝硬化程度有关.     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

慢性肝病患者血清中自身抗体的检测

目的：探讨慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中自身抗体的变化。方法：以鼠肝组织和猴肝组织切片为抗原基质,用间接免疫荧光法、免疫印迹法检测肝病患者血清中的自身抗体。结果：间接免疫荧光法显示慢性肝炎(17．5％)、肝硬化(24．6％)、肝癌(20．0％)三组阳性率明显高于急性肝炎(6．89％)、正常对照组(3．33％)。免疫印迹法检测中慢性肝炎、肝硬化患者约70．0％的抗原相对分子质量多集中在47000～52000上,肝癌患者抗原相对分子质量多集在22000～38000上,约有22．6％的肝硬化、肝癌患者在20000～32000分子量之间的阳性区带处出现1～2条异常阳性区带。结论：慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中存在相似的自身免疫紊乱,表明其免疫系统发生了改变,探讨自身免疫性相关的自身抗体,将有助于诊断肝病患者的病情变化。