中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在疾病中的作用

中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶破坏组织、增加血管的通透性、促进中性粒细胞移行。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂可以通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性减少组织损伤,此外,它还具有抗炎、调节免疫功能。近年来研究发现,它可以保护器官损伤,尤其是中性粒细胞介导的组织损害。现就中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在些疾病中的作用做一综述。     

01脂多糖调节人体单核细胞和巨噬细胞a1蛋白酶抑制因子和其他丝氨酸蛋白酶抑制因子的表达

a1蛋白酶抑制因子(PI）是嗜中自细胞弹性蛋白酶的主要抑制因子。该酶降解细胞外基质中的许多化台物。所以a1P1的表达和调节影响弹性蛋白酶和抗弹性蛋白酶的精细平衡。这种平衡临界于结缔组织在稳衡，组织损伤及修复时的转换。     

人MUC5AC基因启动子荧光素酶报告 基因载体的构建及其转录活性分析

目的：克隆人黏蛋白/黏液素5AC(MUC5AC)基因启动子并构建该启动子的荧光素酶报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性。方法：运用Vector NT1软件包对MUC5AC基因5′端1 348 bp进行启动子特征分析;以人A549细胞基因组DNA为模板分离出人MUC5AC基因5′端非翻译区大小为1 348 bp的片段并进行测序鉴定,再以扩增产物为模板对启动子进行5′端删除分析,分别扩增737 bp(-689/+48),372 bp(-324/+48),112 bp(-64/+48)的片段,与荧光素酶报告基因载体重组构建,通过双荧光素酶活性进行转录活性分析。应用定点突变技术,在重组质粒的基础上建立MUC5AC启动子区SP-l结合位点和核因子（NF）-κB结合位点单独突变体,并测定中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导的转染细胞荧光素酶的相对活性。结果：序列分析发现人MUC5AC基因5′端1 348 bp的区域内存在多个顺式作用元件,成功构建了4个不同长度的MUC5AC启动子报告基因载体。双荧光素酶活性分析372 bp片段为有活性的最小片段。NE可诱导含有MUC5AC启动子区NF-кB结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-NF-кB-MU）荧光素酶相对光强度增加,而NE不能诱导SP-l结合位点单独突变体（pGL3E-MUC5AC-SP-1-MU）荧光素酶表达增加。结论：上述载体的成功构建及序列分析为进一步研究MUC5AC基因的启动子活性及基因表达调控奠定了基础。MUC5AC 5′上游序列中-324/-64位点存在参与NE诱导MUC5AC基因表达的重要调控元件,位于此区域的顺式作用元件SP-1位点在NE诱导MUC5AC基因表达机制中起重要作用。     

小鼠高迁移率族蛋白B1启动子的构建与转录活性检测

【目的】构建小鼠高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子全长序列的荧光素酶报告基因用于药物筛选。【方法】采用PCR技术扩增小鼠HMGB1基因启动子全长序列,用GV238载体构建报告质粒GV238-HMGB1-P-Luc,以pGL3-basic作为阴性对照质粒,与内参质粒pRL共转染Hela细胞,以内毒素(LPS,0.2μg/mL)作为激活剂,以正丁酸钠(SB,10 mmol/L)作为抑制剂,分组处理24 h后检测荧光素酶活性。【结果】经酶切、PCR及测序鉴定证实克隆的HMGB1基因启动子全长2 140 bp,DNA序列正确无突变。与pGL3-basic组比较,GV238-HMGB1-P-Luc组荧光素酶活性显著增强(P0.05);与GV238-HMGB1-P-Luc组比较,LPS组荧光素酶活性显著增强(P0.01);与LPS组比较,SB组荧光素酶活性显著降低(P0.01)。【结论】HMGB1基因启动子报告基因构建成功,LPS可以增强其表达,SB则可以抑制LPS刺激下的HMGB1启动子表达增强,可为下一步筛选具有调控HMGB1启动子活性的药物奠定基础。     

乙型肝炎病毒X蛋白对SNAI1基因启动子转录活性调控的作用

目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对SNAI1基因启动子活性是否存在调控作用,并明确SNAI1启动子区重要的转录激活调控序列.方法 运用分子克隆技术,构建一系列5'端缺失,保留共同3'端的SNAI1启动子荧光素酶报告质粒.将报告质粒分别与内参pRL-TK质粒、HBx重组腺病毒载体共转染人肝癌SMMC7721细胞,检测各组相对荧光素酶活性.结果 酶切鉴定及DNA测序证实SNAI1基因系列启动子荧光素酶报告质粒构建成功.HBx共转染下的系列启动子缺失实验发现,HBx能显著上调SNAI1基因启动子(-869～+59)活性[SNAI1(-869)Luc:无处理组6.17±0.08,阴性对照组6.09±0.44,实验组12.52±0.72,P<0.01],其转录调控序列定位于SNAI1基因启动子区-869～-514之间.结论 HBx可有效激活SNAI1基因转录表达,SNAI1启动子区存在HBx作用的重要转录活性调控序列,提示了HBx促进肝癌侵袭转移的新路径.     

人PSMA基因启动子表达载体pGL3-PSMP的构建

目的：构建含人前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）基因启动子表达载体pGL3-PSMP。方法：PCR扩增人PSMA上游1175bp启动子序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic,构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP,重组子经双酶切、测序鉴定。将构建载体用脂质体转染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M,应用双荧光素酶测定系统检测荧光素酶的表达活性。结果：序列测定表明,克隆获得的1175bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人PSMA基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高,比pGL3-Basic高10倍多。结论：成功构建了含人PSMA基因启动子的荧光素酶表达载体。     

CEACAM1与CD105在肾细胞癌中的表达及意义

目的:观察细胞黏附分子1(CEACAM1)与CD105分子在肾细胞癌(RCC)中的表达变化,研究其与肿瘤血管生成、肿瘤侵袭和转移的关系。方法:采用免疫组化SP法,检测47例肾细胞癌组织中CEACAM1和CD105的表达情况;并记录微血管密度(MVD)值,对肾细胞癌及癌旁正常肾组织中CEACAM1和CD105的表达情况进行相关分析。结果:⑴CEACAM1在肾癌中表达强度明显低于癌旁正常组织(P<0.05);CEACAM1在Ⅰ~Ⅱ期中表达明显高于Ⅲ~Ⅳ期(P<0.05)。⑵肾癌组织中CD105-MVD值明显高于癌旁正常组织MVD,二者相比差异有统计学意义(P<0.01)。CD105-MVD值在各病理分级G1、G2、G3组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05),在不同临床分期中表达有显著差异(P<0.01)。⑶CEACAM1与CD105-MVD表达呈负相关(r=-0.427,P<0.01)。结论:⑴肾癌中存在CEACAM1的表达下调和CD105-MVD升高,肾细胞癌中CEACAM1与CD105-MVD存在负相关。⑵CEACAM1在肾癌中的表达促进了肾细胞癌微血管的生成,提示CEACAM1可以作为抗肿瘤血管生成疗法的治疗靶点之一。     

核因子κB和VEGF在肾癌中的表达及其意义

目的:研究核因子κB(nuclear factor-κappaB,NF-κB)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth facor, VEGF)在肾癌中的表达及其意义.方法:应用免疫组化方法(Envision二步法)检测40例肾癌组织及10例正常肾组织中的NF-κB P65、VEGF和CD34的表达,并与肾癌的临床分期进行比较.结果:NF-κB P65显著表达于肾癌组织中,40例肾癌组织中有26例呈阳性表达(65.0%),正常肾组织中呈阴性表达;VEGF在40例肾癌中有27例阳性表达,表达率为67.5%,显著高于正常肾组织 (20.0%,P<0.05);NF-κB P65与VEGF同时表达组肾癌的微血管密度(microvessel density,MVD)明显较两者同时阴性组高(P<0.01);肾癌中NF-κB P65的表达与VEGF的表达呈正相关(P<0.01);NF-κB P65与VEGF的表达均与肾癌的临床分期有关.结论:NF-κB在肾癌中呈异常活性表达,可能通过多种途径参与肾癌的发生发展;NF-κB对于VEGF的高表达可能具有潜在的正向调节作用.     

CD147和基质金属蛋白酶-9在肝细胞肝癌中的表达与微血管生成的相关性

目的:探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(CD147)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在肝细胞肝癌组织中的表达与肝细胞肝癌血管生成的关系。方法:采用免疫组织化学法检测63例肝细胞肝癌组织中CD147和MMP-9的表达,光镜下计数(分化抗原105 CD105)标记的微血管密度。结果:63例肝细胞肝癌组织中CD147阳性率为65.1%,MMP-9阳性率73.0%,二者阳性率在肿瘤大小、门静脉癌栓、肿瘤分化和TNM分期间差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01),而在患者的性别、年龄及甲胎蛋白的表达水平间差异无统计学意义(P>0.05)。CD147和MMP-9阳性组微血管密度值均明显高于阴性组(P<0.01)。CD147在肝细胞肝癌中的表达与MMP-9表达呈正相关关系(P<0.01)。结论:肝细胞肝癌组织中CD147表达上调可能通过促进MMP-9的生成参与肝癌微血管的生成,进而有利于肝癌侵袭和转移。     

GLUT9基因启动子区荧光素酶表达重组体的构建

目的 构建人葡萄糖转运蛋白9(GLUT9)基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)rs13124007位点不同单倍型(GG/CC)荧光素酶表达重组体。方法 采用PCR方法扩增目的片段,产物经双酶切后克隆至表达载体pGL3-basic,并通过双酶切及测序进行验证。结果 经验证,所构建质粒含有pGL3-basic全序列及GLUT9基因启动子区包含rs13124007的序列,且插入方向正确。结论 GLUT9基因启动子区荧光素酶表达重组体构建成功,为后续研究SNP rs13124007位点是否影响启动子活性奠定了基础。     

miR-222-3p通过靶向调节Bim蛋白表达参与肾细胞癌的发生发展

目的: 检测miR 222 3p在肾细胞癌组织中的表达,探讨其参与肾细胞癌发生发展的分子机制。方法: 运用qRT PCR检测15对肾细胞癌组织和对应癌旁组织miR 222 3p的表达水平。生物信息学预测miR 222 3p的靶基因,荧光素酶报告实验验证其靶向调控作用。运用免疫组化和蛋白质印迹技术检测癌组织中靶基因蛋白表达水平。进一步通过脂质体瞬时转染技术实现肾细胞癌细胞株769 P中miR 222 3p过表达,采用流式细胞术检测miR 222 3p对细胞凋亡的影响。结果： qRT PCR结果显示,miR 222 3p在肾细胞癌组织的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）。生物信息学预测显示,抗凋亡蛋白Bim是miR 222 3p潜在的靶基因。荧光素酶报告实验证实,过表达miR 222 3p可抑制含有Bim 3’ UTR的荧光素酶报告基因的荧光素酶活性,但对Bim 3’ UTR突变体的荧光素酶活性没有影响。免疫组化结果显示,肾细胞癌组织中Bim蛋白免疫组化阳性反应程度明显低于相应的癌旁组织（P<0.01）;蛋白质印迹结果进一步证实Bim蛋白在肾细胞癌组织中的表达较癌旁组织明显下调（P<0.01）。进一步在769 P细胞中瞬时过表达miR 222 3p后,发现Bim蛋白水平明显下调（P<0.01）,但Bim mRNA水平无明显变化。流式细胞术检测结果显示,过表达miR 222 3p可显著抑制769 P细胞的凋亡（P<0.01）。 结论： miR 222 3p可通过靶向作用于抑癌基因Bim表达抑制肾癌细胞的凋亡,在肾癌的发生发展中起重要作用,miR 222 3p/Bim轴为肾细胞癌治疗提供新的途径。     

泛素水解酶22调控丝裂原活化蛋白激酶激酶6基因的转录活性

目的：克隆丝裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)基因启动子,研究泛 素水解酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对MKK6转录活性的调控作用。方法：采用PCR扩增MKK6基因启动 子片段,并以该片段为模板对USP22结合位点进行定点突变,将野生型与突变型启动子片段定向插入荧光素酶表达 载体pGL3-Basic;用重组载体与内参质粒pRL-TK共转染HeLa细胞,行双荧光素酶活性检测以确定其转录活性;利用 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验观察USP22蛋白与MKK6启动子是否存在直接的结合;下 调USP22表达后,检测MKK6转录活性的变化。结果：成功扩增MKK6启动子及其突变体并构建荧光素酶表达载体; USP22结合位点的突变导致该启动子活性在HeLa细胞中明显降低(P<0.05);USP22与MKK6启动子在细胞中存在直接结 合;抑制USP22的表达导致MKK6转录水平明显下降(P<0.05)。结论：在HeLa细胞中,USP22有效地调控MKK6基因的 转录。     

稳定表达人α-分泌酶adam10基因启动子荧光素酶报告基因细胞系的构建研究

目的 构建携带adam10基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞系并分析其活性.方法 提取人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)基因组DNA,以其为模板,PCR扩增adam10基因启动子并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.17中,构建adam10基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.17-adam10,将其转染SH-SY5Y细胞(无启动子的pGL4.17载体作阴性对照,带有CMV启动子的pGL4.51载体作阳性对照),经G418进行稳定表达株的筛选,用1μmol/L维甲酸处理细胞4d后检测其荧光活性.结果 成功扩增到438 bp的adam10基因启动子,pGL4.17-adam10经PCR和双酶切鉴定均正确.SH-SY5Y细胞被该载体转染后经G418筛选得到稳定表达adam10基因启动子的细胞株,经检测具有较强的转录活性;1μmol/L雏甲酸能诱导adam10基因启动子高效表达.结论 成功构建了人adam10基因启动子荧光素酶报告载体,adam10基因启动子在SH-SY5Y细胞中能稳定表达,为深入研究adam10基因的表达调控、多态性分析及其高通量药物筛选提供基础.     

长链非编码RNA BX357664对肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程的影响

目的：探讨长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）BX357664在肾癌组织中的表达并研究其对Caki?1和Caki?2细胞上皮间质转化过程的影响。方法：以前期芯片检测结果经标准化分析确认在肾癌组织中表达明显低于癌旁正常组织的lncRNA BX357664为目标,采用逆转录-聚合酶链反应（qRT?PCR）检测其在24对肾癌组织和Caki?1以及Caki?2细胞中的表达情况;lncRNA BX357664慢病毒载体感染Caki?1和Caki?2细胞后,Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞迁移和侵袭能力的改变;Western blot检测Caki?1和Caki?2细胞处理组和对照组中上皮间质转化相关蛋白的表达情况。结果：lncRNA BX357664在24对肾癌组织和Caki?1、Caki?2细胞中表达水平降低（P < 0.05）;lncRNA BX357664慢病毒过表达载体感染Caki?1和Caki?2细胞后能够显著抑制细胞迁移（P < 0.01）和侵袭能力（P < 0.01）,显著改变上皮间质转化相关蛋白的表达,抑制上皮间质转化的进程（P < 0.05）。结论：lncRNA BX357664在肾癌中显著低表达,在Caki?1和Caki?2细胞中上调lncRNA BX357664能够通过抑制上皮间质转化过程,从而抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素-金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响。方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1 953 bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒,并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中;利用双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。将HEK293T、BEAS-2B细胞分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组,分别转染GATA3过表达质粒和空白对照质粒,用双荧光素酶报告基因技术检测荧光素酶活性;用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33 mRNA相对表达水平。结果:通过PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒;重组质粒的ADAM33启动子活性较pGL3-Basic对照组...     

可诱导型真核表达载体的构建及其表达效率的测定

目的：利用ＭＴ－Ⅱ启动子的Ｚｎ＾２＋诱导表达特性,构建含多克隆位点的可诱导型真核表达载体ｐＭＤＮＡ３－ｎｅｏ,并用荧光素酶报告基因（ｌｕｃ）检测其表达效率。方法：用分子克隆方法构建载体,并将ｌｕｃ基因克隆到其多克隆位点内,转染胃癌细胞ＳＧＣ７９０１,Ｇ４１８筛选出稳定克隆,分别在不同浓度ＺｎＳＯ４级不同诱导时间下进行诱导表达和测定,并检测不同单细胞株的表达效率。     

三突变型低氧诱导因子-1α对人微血管内皮细胞增殖及VEGF蛋白表达的影响

目的观察重组腺病毒三突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对人微血管内皮细胞(hMVECs)增殖及VEGF蛋白表达的影响。方法三突变型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1α564/402/803)、野生型HIF-1α腺病毒载体(Ad-HIF-1αnature)、Ad-LacZ及空载腺病毒载体(Ad-Null)分别在HEK293A细胞大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,终点稀释法测定病毒滴度;双荧光素酶报告系统检测三突变型HIF-1α与野生型HIF-1α的转录活性;各重组腺病毒载体以最佳转染复数转染体外培养的hMVECs,Western blotting测定HIF-1α和VEGF蛋白表达;MTS检测Ad-HIF-1α564/402/803对细胞增殖的影响。结果三突变型HIF-1α转录活性显著高于野生型HIF-1α(P<0.001);Ad-HIF-1α564/402/803组HIF-1α和VEGF蛋白表达量高于Ad-HIF-1αnature及其他组;VEGF蛋白表达水平与HIF-1α呈剂量依赖关系。Ad-HIF-1α564/402/803组第3、5天吸光度值均显著高于Ad-HIF-1αnature及其他组(P<0.01)。结论三突变型HIF-1α在体外常氧条件下稳定高效表达,可诱导hMVECs VEGF蛋白表达上调,促进hMVECs增殖。     

β-防御素-2荧光素酶报告基因载体及克罗恩突变体的构建

目的：构建人β-防御素-2（hBD-2）荧光素酶报告基因质粒及其克罗恩病（Crohn’s,CD）相关突变体,并检测其在人胚胎肾T细胞（HEK-293T）中的活化．方法：通过基因重组构建包含hBD-2启动子序列的报告基因质粒hBD-2—780-luc,再通过定点突变技术在启动子区（-233位点）引入变异点（G变为C）,构建突变体hBD-2-mut-luc;经酶切及测序验证后,将报告基因质粒和野生型NOD2／CARD15蛋白真核表达载体共转染到HEK一293T中,TNF—α刺激后测定双荧光素酶的表达．结果：酶切和测序证实,构建了重组体hBD-2-780-luc及其突变体hBD-2-mut—luc,两者均能表达荧光素酶活性,且明显高于空载体．结论：hBD-2报告基因质粒hBD-2-780-luc及其CD相关突变体hBD-2-mut—luc构建成功,并在细胞内活化表达荧光素酶．     

肾细胞癌组织中S100蛋白表达及与P53的关系

目的:探讨肾细胞癌组织中S100蛋白的表达情况、临床意义及与P53的关系。 方法:采用免疫组织化学染色法检测36例肾细胞癌及14例正常肾组织中S100A1蛋白、S100B蛋白和突变型P53的表达,观察并分析S100蛋白与肾细胞癌临床分期、病理类型、及与突变型P53表达的关系。 结果:肾细胞癌组织S100A1表达阳性率72.2%,高于正常肾组织的21.4%（P<0.01）。随肾癌分期和恶性程度的增加,S100A1的表达阳性率增加。肾细胞癌组织中突变型P53表达阳性率30.6%,正常肾组织中的阳性率则为0（P<0.05）;P53表达与肾癌分期和癌细胞恶性程度无关（P>0.05）。肾细胞癌组织S100B表达阳性率36.1%,正常肾组织表达阳性率为64.3%（P>0.05）。S100A1,S100B在肾癌中的表达与突变型P53无显著相关性（P>0.05）。 结论:S100A1蛋白在肾癌组织中表达增高,且随肾癌分期以及肾细胞癌恶性程度的增加,其表达阳性率均增加。S100A1蛋白可能成为判断肾细胞癌侵袭性和恶性程度一项新的、有意义的指标。