人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达的研究

人胰岛素基因（PCMV．INS）经壳聚糖中介，成功地转染到NIH3T3细胞并证明表达有效。这有助于1型糖尿病基因治疗的研究。     

乙型肝炎病毒前S2-ENV融合基因在NIH3T3细胞中的表达和初步鉴定

HBV是严重威胁人类健康的病毒之一，在我国约有1．2亿HBV携带者，但目前对乙型肝炎的治疗仍停留在对症治疗及调节机体免疫功能等阶段，尚无直接抑制HBV复制的有效方法。反义技术是依赖反义寡核苷酸（ODN）、反义RNA和核酶（ribozyme）等手段进行基因治疗、基因调控研究的方法。它在基因水平上考虑选择性关闭或修饰靶基因，使其失活而达到对疾病的特异性治疗，或研究特定基因功能及基因调控机制等。HBV在复制过程中经历了从前基因组mRNA逆转录到DNA的过程，利用反义技术能直接抑制病毒复制。     

人垂体瘤转化基因1对NIH3T3细胞无直接肿瘤转化作用

目的 克隆人垂体瘤转化基因1（hpTTG1)cDNA并确定其在不同细胞内的分布和其在体外是否具有直接的肿瘤转化作用。方法 （1）用快速扩增（RACE）克隆hPTTG1 cDNA；（2）用Northern印迹检测hPTTG1 mRNA在肿瘤细胞的表达水平；（3）构建pCMX-GFP-hPTTG1表达质粒并转染HeLa等6种细胞，用荧光共聚焦显微镜观察GFP－hPTTG1的细胞内分布；（4）构建pIRESneo-hPTTG1表达质粒并转染NIH3T3细胞，经G418选择后检测hPTTG1是否有直接的致肿瘤作用。结果 （1）hPTTG1与大鼠PTTG的同源性为79％。开放可读框架由609bp组成，编码202个氨基酸；（2）hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高，其表达水平由强到弱依次为THP－1，Raji,CEM,AR230,DLD-1,H1299,HeLa,HepG2和A549肿瘤细胞；（3）hPTTG1的细胞内分布在HeLa、Cos-7和DU145细胞主要位于细胞核，在A549、DLD－1和NIH3T3细胞则呈胞浆和胞核的弥漫性分布；（4）hPTTG1明显抑制NIH3T3细胞的生长，降低[^3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入率。hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用。结论 （1）hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高；（2）hPTTG1的细胞内分布与细胞类型有关；（3）hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用。     

体内直接人胰岛素原基因转移对糖尿病小鼠治疗作用的研究

目的　研究人胰岛素原基因表达质粒直接转移至糖尿病小鼠体内后对其血糖和血浆胰岛素水平的影响。　方法　将人胰岛素原基因和大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)启动子的重组质粒 p N - PEPCK- INS经脂质体介导 ,直接转入糖尿病小鼠体内 ,监测空腹血糖并测定血浆胰岛素水平 ,PCR法鉴定基因转入。　结果　人胰岛素原基因转移组小鼠血浆胰岛素为 (49.2 9± 14 .5 6 )ml U / L ,显著高于生理盐水对照组 (37.5 6± 8.4 ) m l U / L (P<0 .0 5 )和质粒 PL NC对照组 (33.5 4±13.35 ) ml U / L (P<0 .0 5 ) ,生理盐水组与质粒 PL NCX组差别无显著性 (P>0 .0 5 ) ,人胰岛素原基因转移组空腹血糖显著低于基因转入前 (P<0 .0 5 )。生理盐水组和质粒 PL NCX组空腹血糖基因转入前后差异无显著性。　结论　人胰岛素原基因可通过脂质体介导直接转移入糖尿病小鼠体内并发挥治疗作用     

过氧化物酶体增殖体激活受体γ2表达诱导NIH3T3细胞向脂肪细胞分化

目的通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2)基因整合入NIH3T3细胞基因组中进行表达,并研究其功能.方法从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2中,双酶切下mPPARγ2全长cDNA序列,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2.对pGCEN/mPPARγ2及pGCEN进行包装及G418抗性筛选,收集病毒上清,感染靶细胞NIH3T3细胞,进行G418抗性筛选并进行扩增.在含过氧化物酶体增殖体激活受体γ(PPARγ)激活物5,8,11,14-二十碳四烯酸等分化介质中,诱导PPARγ2表达增加,使NIH3T3细胞向脂肪细胞分化.结果构建了含mPPARγ2全长cDNA重组逆转录病毒载体,获得了滴度分别为5×104CFU/ml和6×105CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2及pGCEN的病毒上清.经油红O染色证实分化10d的表达mPPARγ2的NIH3T3细胞中明显积聚了较多的中性脂肪,其细胞形态也与体内成熟脂肪细胞相似.结论本研究在体外建立了由PPARγ2诱导NIH3T3细胞向脂肪细胞分化模型,为进一步研究脂肪细胞分化的分子机制奠定了基础.     

小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2重组逆转录病毒载体在NIH3T3细胞中的表达

目的　通过应用重组逆转录病毒介导小鼠过氧化物酶体增殖体激活受体γ2(mPPARγ2 )基因整合入NIH3T3细胞基因组中并进行表达。方法　从经测序证实含正确序列mPPARγ2的重组质粒pcDNA3/mPPARγ2 中 ,双酶切下约 1.5Kb的mPPARγ2 全长cDNA编码序列 ,亚克隆入逆转录病毒载体pGCEN中构建重组逆转录病毒载体pGCEN/mPPARγ2 。pGCEN/mPPARγ2 及pGCEN经LipofectAMINE感染病毒包装细胞系PA317细胞 ,通过筛选PA317细胞G418抗性克隆 ,收集病毒上清 ,然后用其感染靶细胞NIH3T3细胞 ,用免疫荧光染色及Western印迹方法鉴定mPPARγ2 在NIH3T3细胞中的表达情况。结果　构建了含mPPARγ2 全长cDNA重组逆转录病毒载体 ,获得了滴度分别为 5×10 4 CFU/ml和 6× 10 5CFU/ml的pGCEN/mPPARγ2 及pGCEN的病毒上清。经鉴定pGCEN/mPPARγ2 能有效地感染靶细胞NIH3T3细胞并表达mPPARγ2 。结论　本研究结果为在体外建立脂肪细胞分化模型及为进一步研究PPARγ2 在诱导脂肪细胞分化中的分子机制奠定了基础     

胰岛素上调3T3-L1细胞apelin基因表达的初步观察

Northern印迹法证实apelin在分离的小鼠脂肪细胞上有表达，其表达量随3T3-L1细胞分化而渐增。胰岛素上调3T3-L1脂肪细胞apelin的表达，提示脂肪细胞apelin的表达可能与肥胖、胰岛素抵抗、高血压相关。     

基因扫描分析人T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立

目的建立人T细胞受体（TCR）互补决定区3（CDR3）基因谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法。方法分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,应用RT-PCR方法扩增5例健康志愿者外周血T细胞的34个TCR Vα亚家族和26个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性。结果T细胞株Jurkat细胞仅表达TCR Vα1．1和Vβ8基因,且为单克隆,而B细胞株Raji细胞则不表达所有的TCR Vα和Vβ基因。5例健康人表达所有的TCR Vα和Vβ基因,均为多克隆T细胞。结论基因扫描分析人TCRCDR3基因谱型是检测T细胞克隆性的精确敏感方法。     

丹参对转化生长因子β1刺激的NIH／3T3细胞表达Ⅰ型胶原和c—fos mRNA的影响

目的观察丹参对TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞功能的影响.方法将丹参灌胃给正常大鼠,分离含药血清,温育TGFβ1刺激的成纤维细胞.RT-PCR法检测I型胶原和c-fos的基因表达.结果经TGFβ1刺激后,细胞I型胶原和c-fas的mRNA表达明显增加,丹参含药血清可分别抑制由TGFβ1引起的细胞I型胶原和c-fos的mR-NA表达的增加,结论丹参可能通过抑制c-fos的基因表达进而抑制I型胶原的基因表达.     

简捷的PCR点突变实现人胰岛素原基因非β细胞表达

利用聚合酶链反应 (PCR)技术将人胰岛素原基因进行两处突变 ,引入Furin酶的裂解位点 ,再构建突变人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒 ,转染HepG2肝癌细胞 ,经检测可表达成熟胰岛素。所采用的PCR点突变法简单且无错误掺入产生     

Effects of salvianolic acid-A on NIH/3T3 fibroblast proliferation, collagen synthesis and gene expression

AIM:To investigate the mechanisms of salvianolic acid A (SA-A) against liver fibrosis in vitro.METHODS:NIH/3T3 fibroblasts were cultured routinely, and incubated with 10(-4) mol/L-10(-7)mol/L SA-A for 22h. The cell viability was assayed by (3)H proline incorporation, cell proliferation by (3)H TdR incorporation, cell collagen synthetic rate was measured with (3)H proline impulse and collagenase digestion method.The total RNA was prepared from the control cells and the drug treated cells respectively, and alpha(1) I pro-collagen mRNA expression was semi-quantitatively analyzed with RT-PCR.RESULTS:10(-4)mol/L SA-A decreased cell viability and exerted some cytotoxiciy,while 10(-5)mol/L -10(-7)mol/L SA-A did not affect cell viability, but inhibited cell proliferation significantly, and 10(-6)mol/L SA-A had the best effect on cell viability among these concentrations of drugs. 10 (-5)mol/L -10(-6)mol/L SA-A inhibited intracellular collagen synthetic rate, but no significant influence on extracellular collagen secretion. Both 10(-5)mol/L and 10(-6)mol/L SA-A could decrease alpha(1)I pro-collagen mRNA expression remarkably.CONCLUSION:SA-A had potent action against liver fibrosis. It inhibited NIH/3T3 fibroblast proliferation, intracellular collagen synthetic rate and type I procollagen gene expression, which may be one of the main mechanisms of the drug.     

丹酚酸A对成纤维细胞活力、增殖及胶原合成的影响

目的：探讨庆酚酸Ａ对成纤维细胞增殖及胶原合砀影响。方法：常规培养ＮＩＨ／３Ｔ３成纤维细胞,１０＾－４～１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ丹酚酸Ａ温有亚单２２ｈ。〖＾３Ｈ〗－ＴｄＢ主法测定细胞增殖。〖＾３Ｈ〗－ｐｏｒｌｉｎｅ掺入法测定细胞活力,〖＾３Ｈ〗－ｐｒｏｌｉｎｅ掺入,胶原酶消化法细胞内外胶原生成率。结果：１０＾－１～１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ彤酚酸Ａ抑制细胞增殖,除１０＾－４〖＾３Ｈ〗ｍｏｌ／Ｌ丹酚酸Ａ组细胞〖     

Highly-efficient gene transfer with retroviral vectors into human T lymphocytes on fibronectin

Genetically modified lymphocytes have been successfully used for correction of ADA deficiency in children and in controlling graft-versus-host disease (GvHD) after allogeneic bone marrow transplantation. Low transduction efficiencies are, however, limiting for gene therapeutic strategies based on lymphocytes. In this study we compared protocols for highly efficient gene transfer into human T cells using retroviral vector-containing supernatant. We showed that infection of both human primary T cells and CD4⁺ Jurkat cells is most efficient on the matrix component fibronectin. Transduction was carried out with a retroviral vector encoding both the human intracytoplasmatically truncated low-affinity nerve growth factor receptor (ΔLNGFR) as a gene transfer marker and the Herpes simplex virus thymidine kinase for negative selection. Based on ΔLNGFR expression genetically modified cells were enriched to near purity by magnetic cell sorting (MACS). Enriched cells could be shown to be highly sensitive to ganciclovir.     

阳离子脂质体联合转铁蛋白对人肿瘤细胞的靶向基因转染

目的研究阳离子脂质体联合转铁蛋白(transferrin ,Tf)介导报告基因虫荧光素酶基因对人肿瘤细胞的靶向转染。方法比较阳离子脂质体Lipofectin、Lipofectin联合含双铁的人转铁蛋白[HTf(Fe) 2 ]介导质粒pDR2 luc转染人肝癌细胞株HepG2 、SMMC772 1、人肾癌细胞株GRC及非洲绿猴肾细胞COS7的转染效率,转染效率通过以液体闪烁计数仪单光子计数法测定荧光素酶活性估计。结果除COS7外,其余3株细胞以Lipofectin联合HTf(Fe) 2 介导pDR2 luc的转染效率均比单用Lipofectin的转染效率高(P <0 0 1) ,其中HepG2 与SMMC772 1中的转染效率增高8倍多,GRC中的转染效率增高4倍多。结论Lipofectin联合HTf(Fe) 2 介导质粒pDR2 luc转染细胞时对人肿瘤细胸株有一定的靶向作用。     

转铁蛋白受体介导的自杀基因转移系统的建立及其体外抗瘤效应

目的 构建转铁蛋白受体介导的自杀基因系统并观察其对肝癌细胞的体外杀伤效应。方法 SPDP法制备抗转铁蛋白受体与多聚赖氯酸(PLL)的复合物并用分子筛层析纯化。根据DNA阻断试验结果，pEBAF／tk重组质粒与Ab-PLL按1：6混合使二者结合形成PEBAF／tk—Ab PLL复合物。将此复合物转入人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2和肺癌细胞株A549，并以脂质体转移为对照。加入不同浓度的更昔洛韦(GCV)以观察细胞的自杀效应。结果 加入GCV后HepG2／tk的增殖受抑制最明显。100mg／L和1mg／L时抑制率分别为60．5％和24．3％。SMMC7721／tk受抑制较低，而A549的增殖不受抑制。结论 本基因治疗体系具仃很好的靶向性和杀肿瘤效果。     

Retroviral-mediated gene transfer of human phenylalanine hydroxylase into NIH 3T3 and hepatoma cells.

Phenylketonuria (PKU) is caused by deficiency of the hepatic enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH). A full-length human PAH cDNA sequence has been inserted into pzip-neoSV(X), which is a retroviral vector containing the bacterial neo gene. The recombinant has been transfected into psi 2 cells, which provide synthesis of the retroviral capsid. Recombinant virus was detected in the culture medium of the transfected psi 2 cells, which is capable of transmitting the human PAH gene into mouse NIH 3T3 cells by infection leading to stable incorporation of the recombinant provirus. Infected cells express PAH mRNA, immunoreactive PAH protein, and exhibit pterin-dependent phenylalanine hydroxylase activity. The recombinant virus is also capable of infecting a mouse hepatoma cell line that does not normally synthesize PAH. PAH activity is present in the cellular extracts and the entire hydroxylation system is reconstituted in the hepatoma cells infected with the recombinant viruses. Thus, recombinant viruses containing human PAH cDNA provide a means for introducing functional PAH into mammalian cells of hepatic origin and can potentially be introduced into whole animals as a model for somatic gene therapy for PKU.