BMP2真核表达载体的构建

目的 为研究骨缺损的基因治疗提供实验基础,构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体.方法 采用双酶切方法克隆载体将骨形态发生蛋白2基因与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建pcDNA3.1-BMP2表达基因载体.结果 通过测序分析证实,成功构建BMP2真核表达载体.结论 成功构建BMP2表达载体.     

新城疫病毒NP蛋白的真核表达载体的构建

目的 研究新城疫病毒核衣壳蛋白基因的生物学作用及其抗人喉鳞癌的作用。方法 利用含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因ｃＤＮＡ的原核质粒ｐＵＶＮＰ４及真核质料ｐｃＮＤＡ３,采用基因重组技术构建了含有ＣＭＶ含动子、ＢＧＨｐｏｌｙＡ信号序列的表达新城疫病毒核衣壳蛋白的真核表达质粒。结果 酶切分析表明重组质粒中含有新城疫病毒Ｖ４株核衣壳蛋白基因。结论 重组质粒为表达新城疫病毒核衣壳蛋白基因的真核质粒。     

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

真核表达载体pCMV4—hTGFβ1的构建

真核表达载体ｐＣＭＶ４┐ｈＴＧＦβ１的构建贾赤宇陈璧（第四军医大学西京医院烧伤外科西安７１００３３）关键词转化生长因子β１人类巨细胞病毒中图号Ｒ７５３转化生长因子β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ，ＴＧＦβ）是一大类多功能的细胞增...     

Nogo-c基因的克隆、测序及真核表达载体的构建

目的 克隆Nogo-c的cDNA序列，并构建其真核表达载体，为进一步研究其抑制神经生长机制奠定基础。方法 根据基因GenBah中Nogo-c基因的碱基序列，利用RT-PCR的方法从鼠脑组织中扩增编码Nogo-c基因，将目的片段与pMD18T载体连接，利用亚克隆的方法将Nogo-c的cDNA片段克隆到peDNA3．1载体中，并进行序列测定。结果 DNA测序证实该片段序列与文献报道完全一致。结论 成功构建出pcDNA3．1-Nogo-c真核表达载体。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将ｈＴＲＴ ｃＤＮＡ正向及反向克隆到真核表达载体ｐｃｌ－ｎｅｏ中。结果 Ｎｏｔ Ⅰ酶切后,正义重组基因为８．８ｋｂ一条带,反义重组基因为３．４ｋｂ和５．４ｋｂ二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了ｈＴＲＴ正反义真核表达载体。     

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的：通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法：用Oliga6．0结合Primer Premier5．0软件设计特异性引物，通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中（血清型Adrq^＋）分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。结论：从广西HBsAg阳性病人病毒株（血清型Adrq^＋）中发现了新的基因型C型突变型HBx基因（mutantgenotypeC）。peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，将为进一步研究HBx基因在树鼩实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

人骨形态发生蛋白-2真核表达质粒的制备、转染及表达

目的 制备含人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因的真核表达质粒，获得可稳定高效表达BMP-2的兔骨髓基质细胞，为进一步研究BMP-2在骨牵张区的成骨作用作准备。方法 制备携带有hBMP-2的全长真核表达质粒pcDNA3.1-BMP2。通过脂质体法将所得到的重组真核质粒转染到兔骨髓基质细胞中，用G418进行梯度筛选，从而得到能够稳定表达hBMP-2的细胞克隆。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨髓基质细胞（MSCs）hBMP-2 mRNA的表达。结果 重组质粒通过EcoRI酶切后，电泳图示约1.5kb的hBMP-2的目的片段及5.5kb的载体片段，经测序显示核苷酸序列正确无误。经RT-PCR检测hBMP-2在转录水平mRNA的表达情况，提示转染组hBMP-2的mRNA量较空白对照组明显增加。结论 成功制备了含hBMP-2基因的真核表达质粒，转染后获得了高效表达hBMP-2的兔骨髓基质细胞。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

rAQP4-M1真核表达载体的构建及在CHO细胞中的表达

目的 构建rAQP4-M1基因真核表达载体,建立稳定转染AQP4-M1的CHO细胞系.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织中扩增rAQP4-M1,并将PCR产物双酶切后插入到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,经过菌落PCR、双酶切及测序验证的pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1质粒通过脂质体转染CHO细胞.G418筛选建立稳定转染rAQP4-M1的CHO细胞系.采用细胞免疫荧光和免疫印迹技术检测rAQP4-M1在该细胞系中的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1(+)/rAQP4-M1表达质粒,建立了稳定转染的CHO细胞系.免疫荧光检测结果显示,rAQP4-M1在CHO细胞膜上稳定表达;免疫印迹检测可见34×103处的阳性条带,表明rAQP4-M1在该细胞系中成功表达.蓝绿温和胶电泳技术证实了rAQP4-M23而不是rAQP4-M1参与了正交排列颗粒(orthogonal arrays of particles,OAPs)的形成.结论 rAQP4-M1在CHO细胞系中稳定表达成功,rAQP4-M1未参与OAPs的形成.     

PcDNA4/His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建PcDNA4/HisC-MBL表达载体,在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法 应用PCR从含有中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段,将其克隆至PcDNA4/HisC真核表达载体。经酶切及测序鉴定后,以电穿孔法转染CHO细胞,以RT-PCR分析其mRNA表达,通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果 从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段,构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段,测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBLmRNA表达,纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带,其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1:819200,与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1:25600。结论 获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL,为MBL分子的进一步研究提供了条件。     

Bek腺病毒表达载体的构建及其在哺乳类动物细胞中的表达

目的构建Bek腺病毒表达载体并观察该载体在成纤维细胞中转基因表达FGFR2-Ⅲc的情况,为研究骨骼发育打下基础.方法利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Bek腺病毒表达载体;该载体感染成纤维细胞后,通过荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA情况.结果Bek腺病毒表达载体感染成纤维细胞后,成纤维细胞有绿色荧光表达,荧光定量PCR检测表明Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA效果明显(P＜0.05).结论Bek腺病毒表达载体构建成功,能够转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA,为研究骨骼发育和成骨机制提供了基础.     

Survivin反义核酸真核表达载体的构建及在胶质瘤细胞中的表达

目的构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并检测其在恶性胶质瘤细胞SHG-44中的表达。方法构建survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SVVas,并用脂质体介导转染入SHG-44细胞,通过RT-PCR及western blot检测细胞中survivin mRNA和蛋白的表达。结果构建了survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-SWas,并成功导入SHG-44细胞中,且有效表达,使SHG-44细胞中survivin mRNA和蛋白表达水平均降低。结论Survivin反义核酸真核表达载体pIRES2-EGFP-sVVas可以降低SHG-44细胞survivin基因的表达。     

pEYFP-hApelin-R重组真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的人Apelin-R（Human Apelin receptor,hApelin-R）真核表达载体,用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究。方法以质粒pcDNA3.1-hApelin-R为模板,PCR方法扩增人Apelin-R。扩增的Apelin-R产物与质粒pEYFP-C1按常规方法酶切、连接、转化,并经酶切和测序进行鉴定。将重组质粒用脂质体法转染HEK293细胞,Western blot鉴定人Apelin-R的表达。用Apelin-13诱导后,共聚焦显微镜观察受体在细胞内的位移。结果扩增出了一条1143 bp的基因片段,序列与GenBank（NM_005161）相同。在69 kDa处有一蛋白条带,与预期大小相同。人Apelin-R表达在细胞膜上。诱导30 min后,发生受体向胞浆的位移。结论成功构建了pEYFP-hApelin-R重组表达载体,建立了该质粒转染HEK293的细胞模型。可用于Apelin-R介导的细胞内信号转导机制研究,其结果有助于寻找其作为药物的靶点。     

PcDNA4／His C-MBL表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的构建PcDNA4／His C-MBL表达载体，在哺乳细胞中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)。方法应用PCR从含有中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增目的基因片段，将其克隆至PcDNA4/His C真核表达载体。经酶切及测序鉴定后，以电穿孔法转染CHO细胞，以RT-PCR分析其mRNA表达，通过Ni-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白并以SDS-PAGE和Western-blotting鉴定，以其为免疫原免疫小鼠后取鼠血清进行ELISA检测分析目的蛋白的免疫活性。结果从pGEM-MBL中扩增得到约750bp的cDNA片段。构建成重组载体经酶切出现约5100和750bp片段，测序鉴定与预期的完全一致。RT-PCR证实转染细胞有MBL mRNA表达。纯化蛋白经SDS-PAGE电泳可见约29000、58000和87000条带，其中29000蛋白带可与6-His抗体反应。纯化蛋白免疫小鼠所获抗血清ELISA效价是1：819200，与天然人MBL和重组MBL三聚体糖识别域反应的ELISA效价均为1：25600。结论获得了表达中国人MBL的CHO细胞株和重组人MBL，为MBL分子的进一步研究提供了条件。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.