极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

肿瘤细胞化疗后99Tcm-DTPA-DG摄取研究

 目的 探讨 99Tcm 标记二乙三胺五乙酸葡糖胺（99Tcm- DTPA-DG）在恶性肿瘤化疗早期疗效监测中的应用价值。 方法 将体外培养肺癌细胞 A549、结肠癌细胞 HT-29 和乳腺癌细胞 MCF-7 各分为加入化疗药物的化疗组和不加化疗药物的阴性对照组，所选化疗药物分别为顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇。化疗药作用 6 h 后，荧光倒置显微镜下观察各化疗组和对照组细胞形态变化，并行磷脂结合蛋白 V（AV）/ 碘化丙啶（PI）双标记染色，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，化疗药作用 4 h 后，各化疗组和对照组分别加入 37 MBq/L 的 99Tcm-DTPA-DG 各 0.1 ml，反应 2 h，用 γ 测量仪检测 99Tcm-DTPA-DG 摄取率。 结果 经单用化疗药作用后，3 种肿瘤细胞在荧光倒置显 微镜下观察均可见凋亡小体形成。流式细胞仪检测也均 出现凋亡峰。化疗组和对照组的凋亡率肺癌细胞分别为 43.60% ± 2.82% 和 1.21% ± 0.15%，结肠癌细胞分别为 32.42% ± 2.02% 和 2.04% ± 0.23%，乳腺癌细胞分别为 52.33% ± 2.72% 和 1.31% ± 0.10%，差异均有统计学意义 （P < 0.01）。γ 测量仪检测显示 3 种肿瘤细胞化疗组 99Tcm-DTPA-DG 摄取率均明显低于对照组（肺癌细胞分别为 0.44% ± 0.02%、0.79% ± 0.12%，结肠癌细胞分别为 0.35% ± 0.13%、0.58% ± 0.23%，乳腺癌细胞分别为 0.28% ± 0.05%、0.65% ± 0.18%，均P < 0.01）。结论 99Tcm-DTPA-DG 是一种可望用于肿瘤化疗效果早期评估的靶向分子显像剂。     

国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究

 目的 以国产培养基替代昂贵进口培养基发酵培养重组人超氧化物歧化酶（rhSOD）工程菌。 方法 利用国产 LB 培养基对自行构建的含重组质粒 pTK- rhSOD 的基因工程菌 E.coli DH5α 通过摇瓶进行发酵培养，以 SDS-PAGE 分析方法考察不同菌体接种量（1% ~ 5%）、菌体生长密度[波长 600 nm 处吸光度（A600）值]、诱导时间（1 ~ 8 h）、氨苄青霉素（Amp）浓度（终浓度150、200、250 μg/ml）及加入时机（分别于接种前和诱导前加入）、摇瓶装液量（10% ~ 40%）和诱导温度（42、43、44、45 ℃）对 rhSOD 表达的影响，优选最适培养条件，并与进口 LB 培养基进行比较。 结果 对于国产 LB 培养基，采用 3% ~ 5% 接种量，菌体密度生长至 A600 达 0.38 ~ 0.63，诱导前补加Amp由初始的 100 μg/ml 至 200 μg/ml，于 42 ~ 44 ℃ 诱导 3 ~ 5 h，rhSOD 表达量可达 30%；对于进口 LB 培养基，采用 2%接种量，菌体密度生长至 A600 达 0.55 ~ 0.93，诱导前补加Amp 由初始的 100 μg/ml 至 150 μg/ ml，于 42 ~ 43℃ 诱导 2 ~ 4 h，rhSOD 表达量可达 30%。两种培养基摇瓶装液量对 rhSOD 的表达均没有明显影响。 结论 国产 LB 培养基经条件优化后可获得与进口培养基相同的目的蛋白表达量，可以替代昂贵的进口产品，为 rhSOD 进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据。     

Forskolin对人WISH细胞水通道蛋白 8 表达及分布的影响

 目的 探究调控人羊膜上皮细胞水通道蛋白8（AQP8）表达的信号转导通路 。方法 以腺苷酸环化酶激动剂 Forskolin 处理体外培养的人羊膜上皮细胞株 WISH 细胞，将 WISH 细胞随机分为不同浓度 Forskolin 作用 24 h 组和单一浓度 Forskolin 作用不同时间组。前者培养基中分别加入 Forskolin 0（对照组）、5、10、20、40、100、200 μmol/L，培养 24 h；后者培养基中加入 Forskolin 100 μmol/L 后分别培养 4、8、16、24、48 h。采用蛋白质印迹技术检测各组细胞 AQP8 蛋白表达水平；RT-PCR 技术检测 Forskolin 处理不同时间组细胞 AQP8 mRNA 表达水平；免疫荧光细胞化学方法检测 Forskolin 100 μmol/L 作用 24 h 组细胞 AQP8 蛋白的分布。结果 对照组 WISH 细胞 AQP8 蛋白表达水平为 0.027 ± 0.003，AQP8 mRNA 表达水平为 0.026 ± 0.003。不同浓度 Forskolin 处理组中，除了 5 μmol/L 组外，其余各组 AQP8 蛋白表达水平均高于对照组（P < 0.05），高峰值出现在 100 μmol/L 组（0.157 ± 0.006）。Forskolin 处理不同时间的各组 WISH 细胞，其 AQP8 mRNA 和蛋白的表达水平均高于对照组（P < 0.05），AQP8 mRNA 表达水平在 16 h 组达峰值（0.087 ± 0.007），AQP8 蛋白表达水平在 24 h 组达峰值（0.158 ± 0.007）。免疫荧光细胞化学染色显示，Forskolin 100 μmol/L 作用 24 h 组细胞膜上的黄绿色免疫荧光信号较对照组明显增强。结论 Forskolin 可上调 WISH 细胞 AQP8 mRNA 及蛋白表达水平，使细胞膜上 AQP8 蛋白的分布增加，提示细胞内 cAMP-蛋白激酶 A 信号转导途径的激活在人羊膜上皮细胞 AQP8 表达的调控中发挥重要作用。     

奥沙利铂调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用研究

目的：研究奥沙利铂（Oxaliplatin,Ox）调控PI3K/Akt信号通路抑制脑胶质瘤细胞株U87生长的作用。方法：培养U87脑胶质瘤细胞,分别利用0、20、40、80 μg/ml的奥沙利铂处理U87细胞24、36、48、72 h,利用MTT检测各处理组细胞增殖情况;利用流式细胞仪检测40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h对U87细胞周期及细胞凋亡的影响;Western blot检测40 μg/ml 的奥沙利铂处理48 h对U87细胞凋亡相关蛋白及PI3K/Akt信号通路蛋白表达的影响。结果：奥沙利铂处理抑制U87细胞增殖,与0 μmol/L处理相比,差异显著（P<0.01）,40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h差异最显著。40 μg/ml的奥沙利铂处理48 h后,U87细胞周期被阻滞在S期,U87细胞凋亡显著增加（P<0.01）,抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达明显下降,促凋亡因子Bax、Cleaved-caspase3蛋白表达明显升高（P<0.01）,PI3K及p-Akt的表达量明显降低（P<0.01）,Akt表达量无明显差异（P>0.05）。结论：奥沙利铂可能通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制U87细胞增殖,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡。     

CTLA4Ig可诱导T淋巴细胞对氧化修饰低密度脂蛋白的免疫无反应性

 目的 研究融合蛋白CTLA4Ig对氧化修饰低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的T淋巴细胞特异性免疫反应的作用，探索预防和延缓动脉粥样硬化发生和发展的新途径。方法 从健康成人外周血分离单核细胞，加入500 IU/ml的重组人粒单细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）和500 IU/ml的重组人白细胞介素4（rhIL-4），培养6 d。取 1×106个细胞以流式细胞仪检测CD14的表达，其余细胞分为4组，分别加入细菌脂多糖（LPS）30 ng/ml（LPS 组）、LDL 10 μg/ml（LDL 组）、ox-LDL 10 μg/ml（ox-LDL组）和相同体积的PBS（PBS组），作用48 h，以流式细胞仪检测CD86和HLA-DR的阳性表达率和平均荧光强度（MFI）。将各组DC与同种异体T淋巴细胞以1:5和1:10的比例混合进行同种异体混合淋巴细胞增殖反应（MLR），其中ox-LDL 组在1:5的试验中分为4个亚组，分别给予加入1.25、0.62、0.31 μg/ml的CTLA4Ig和不加CTLA4Ig的处理，各组细胞继续培养 4 d，以噻唑蓝（MTT）比色法检测T淋巴细胞增殖活性，结果以刺激指数（SI）表示。结果 细胞培养6 d后CD14的阳性表达率为2.9%，证实已由单核细胞转化为DC。LPS组、ox-LDL组CD86阳性表达率（96.0%±8.8%，97.7%±11.4%）和HLA-DR阳性表达率（90.3%±8.8%，90.9%±7.0%）均明显高于LDL组（90.0%±10.2%，84.4%±9.6%）和PBS组（87.3%±8.4%，83.6%±7.0%）（均P<0.05），ox-LDL组CD86 MFI（73.4±6.6）和HLA-DR MFI（87.0±7.1）均明显高于LDL组（40.0±7.4，55.0±7.7，均P<0.01）和PBS组（54.6±8.2，P<0.01；70.2±6.7，P<0.05）。在MLR中，DC:T细胞=1:5和1:10两种条件下，LPS组、ox-LDL组SI均明显高于LDL组和PBS组（均P<0.05）。在ox-LDL组的MLR中，以1.25、0.62、0.31和0 μg/ml的CTLA4Ig处理的各亚组SI分别为0.96±0.30，1.12±0.33，1.29±0.28和1.64±0.37，CTLA4Ig 浓度为1.25 μg/ml时，ox-LDL激发的同种异体MLR已被完全抑制。结论 ox-LDL可作为抗原被DC递呈，激发同种异体MLR；CTLA4 Ig能明显抑制该作用，诱导T细胞对ox-LDL的免疫无反应。这一结果为动脉粥样硬化防治的研究提示了新的思路。     

可溶性HLA-G1与NK-92细胞表面ILT2及KIR2DL4受体相互作用的研究

 目的 探讨可溶性 HLA-G1（sHLA-G1）对人 NK-92 细胞杀伤活性的抑制与细胞表面免疫球蛋白样转录分子 2（ILT2）和杀伤细胞免疫球蛋白样受体 2DL4（KIR2DL4）受体的关系。 方法 ①通过原核表达技术获得 sHLA-G1 重组蛋白（重组蛋白），并采用蛋白质印迹法进行鉴定。②取 NK-92 细胞，加入终浓度 20 μg/ml 的重组蛋白分别培养 10、30 min，再分别加入抗 HLA-G1/G5、抗ILT2 和抗 KIR2DL4 抗体，采用流式细胞术检测各组 NK-92 细胞表面 sHLA-G1 和 ILT2、KIR2DL4 受体表达阳性率；以 NK-92 细胞单独培养作为对照组。③以人白血病 K562 细胞为靶细胞，以经不同方式处理的 NK-92 细胞为效应细胞，效靶比为5:1，共同培养 2 h，采用流式细胞术检测 NK-92 细胞对 K562 细胞的杀伤率。NK-92 细胞处理方式为单纯重组蛋白处理（分别加入终浓度为 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白培养 30 min）和表面受体封闭 + 重组蛋白处理（分别加入抗 ILT2、抗 KIR2DL4、抗 LT2 + 抗 KIR2DL4 抗体培养 30 min，再分别加入终浓度为 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白培养 30 min）。 结果 ①蛋白质印迹分析表明所获重组蛋白为带有组氨酸标签的特异蛋白。②NK-92 细胞与 20 μg/ml 重组蛋白共培养 30 min 后，sHLA-G1 表达阳性率明显高于而 ILT2、KIR2DL4 受体表达阳性率均明显低于对照组（均 P < 0.05）。③以终浓度 0、10、20 μg/ml 的重组蛋白处理的 NK-92 细胞对 K562 细胞的杀伤率分别为 39.79% ± 2.00%、27.79% ± 0.75%、21.36% ± 0.67%（两两比较，均 P < 0.01）；单独封闭 ILT2 受体，杀伤率分别为 23.09% ± 1.63%、21.13% ± 0.38%、18.42% ± 0.47%（两两比较，均 P < 0.01）；单独封闭 KIR2DL4 受体，杀伤率分别为 30.74% ± 0.44%、26.03% ± 0.38%、21.15% ± 0.35%（两两比较，均 P < 0.01）。 结论 sHLA-G1 通过与 NK-92 细胞表面 ILT2 和 KIR2DL4 受体直接结合而抑制 NK-92 细胞的杀伤活性。     

肝细胞生长因子基因转移预防术后肠黏连的实验研究

 目的 观察质粒DNA在大鼠术后肠黏连模型中的表达效率及肝细胞生长因子（HGF）基因转移对术后肠黏连的预防作用。 方法 以 pcDNA3-HGF 转染 CHO 细胞 24 h后收集培养上清，用 ELISA 测定培养上清中 HGF 的浓度；取培养的大鼠腹膜间皮细胞作划痕试验，观察表达 HGF 的培养上清对间皮细胞迁移的影响。利用无菌干纱布擦伤盲肠的方法建立 Wistar 大鼠术后肠黏连模型，将模型大鼠随机分为 5 组，每组 10 只。其中 4 组分别于创面涂布 pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g，1 组于创面涂布绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒 pcDNA3-GFP 200 g 作为对照。术后第2、14 天分别解剖 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠各 2 只取腹膜组织，荧光显微镜下观察 GFP 的表达；术后第14天解剖各组动物，观察肠黏连的发生情况。 结果 pcDNA3-HGF 质粒转染CHO细胞后 24 h 培养上清的 HGF 浓度达 40 ng/ml，该上清能够促进大鼠腹膜间皮细胞的迁移。pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠术后第 2 天腹膜组织中观察到 GFP 的表达，并持续到术后第 14 天。术后第14 天各组大鼠中均有发生不同程度肠黏连者，pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g 组和 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠肠黏连发生率分别为 9/10、7/10、6/10、4/10和 9/10，其中重度（3 ~ 4度）肠黏连发生率分别为5/10、5/10、2/10、3/10、7/10，pcDNA3-HGF对术后肠黏连的预防效果呈一定的量效关系。 结论 质粒DNA能有效转染损伤腹膜并介导外源基因表达；质粒载体介导 HGF 基因转移是预防术后肠黏连的有效手段。     

Metronidazole affects breast cancer cell lines

PurposeThe aim of our study was to evaluate the impact of metronidazole (MTZ) on cytotoxicity and DNA synthesis in MCF-7 (estrogen receptor positive) and MDA-MB-231 (estrogen receptor negative) breast cancer cell lines.Material/MethodsToxicity of MTZ was determined by MTT test. MCF-7 and MDA-MB-231 cells were incubated with metronidazole used in different concentrations for 24, 48 and 72 hours. The effect of MTZ on DNA synthesis was measured as [3H]-thymidine incorporation.ResultsWe showed that MTZ in concentration 250 μg/ml significantly increases the growth of MCF-7 cell lines after 24 hours of incubation, but it reduces cell viability in concentrations 1 and 10 μg/ml 72 hours after the drug application. Significant increase of MDA-MB-231 cell viability was obtained in MTZ concentration of 250 μg/ml after 24 and 72 hours. The increase of [3H]-thymidine incorporation in MCF-7 cell line treated with MTZ in concentration 250 μg/ml was statistically significant after 24 hours. Great suppression of cell proliferation was obtained in MDA-MB-231 breast cell line after application of the following concentrations of MTZ: 0.1 μg/ml (after 24 hours) and 0.1, 10, 50, 250 μg/ml (after 72h).ConclusionsWe found that metronidazole exerts different dose- and time- dependent effects on human breast cancer cell lines characterized by presence or absence of estrogen receptors. We suggest that these discrepancies may be influenced by the estrogen signaling.     

永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究

目的建立永生化人肝细胞系（IHCL），评价其作为制备生物人工肝细胞材料的可行性。方法利用基因转移技术对原代培养的人肝细胞转染永生化基因猴病毒40大T抗原和人端粒酶逆转录酶，建立IHCL。以噻唑蓝法测定IHCL细胞生长曲线；流式细胞仪分析细胞增殖周期；裸鼠皮肤和肝脏局部接种观察细胞致瘤性；RT-PCR检测肝细胞相关基因mRNA表达；蛋白质印迹法检测肝功能相关蛋白的表达。应用Cytodex3微载体培养IHCL，分析细胞的生长状态和细胞密度。将IHCL细胞分别与5例重症肝功能衰竭患者的血清共培养，培养前后检测血清中胆红素和尿素氮水平，评价IHCL的解毒功能。结果所建立的IHCL具有原代肝细胞的形态，并具有较好的增殖能力，细胞已经传代超过80次。IHCL细胞以DNA二倍体整数倍方式增殖，细胞倍增周期为38h。裸鼠接种IHCL部位均未见肿瘤生长。RT-PCR检测显示IHCL细胞表达仅α1-抗胰蛋白酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶、谷胺酰胺合成酶和谷胱甘肽硫转移酶的mRNA；蛋白质印迹分析证实IHCL细胞表达这4种蛋白。IHCL细胞可以在微载体上贴附生长，细胞密度可以达到2．86×10^6个／ml。将IHCL细胞与重症肝功能衰竭患者血清共培养12、24和48h后，血清中总胆红素由（346±94）μmol／L分别下降至（330±97）、（315±97）和（295±100）μmol／L，直接胆红素由（243±70）μmol／L下降至（218±76）、（198±79）和（184±75）μmol／L，24、48h与共培养前比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；而尿素氮进行性地升高，由（6．6±0．9）μmol／L分别升高至（9．0±0．9）、（9．9±1．1）和（12．5±1．6）μmol／L，3个时间点与共培养前比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论所建立的IHCL细胞系具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性，具备成为生物人工肝细胞     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

脑源性神经营养因子与心脏微血管内皮细胞的管状形成

背景：研究发现脑源性神经营养因子可促进内皮细胞的存活,诱导血管新生,但其促进血管新生的细胞与分子机制尚不清楚。 目的：观察脑源性神经营养因子在3D体外管状形成模型中对心脏微血管内皮细胞管状结构形成的影响。 方法：分离提取大鼠心脏微血管内皮细胞并培养使之形成细胞小球,将心脏微血管内皮细胞小球接种于Ⅰ型胶原-甲基纤维素的3D环境中培养,然后分别加入50,70,100 μg/L的脑源性神经营养因子继续培养,于培养24,48 h观察并测量心脏微血管内皮细胞的分枝长度和分枝条数。 结果与结论：经分离的大鼠心脏微血管内皮细胞小球在Ⅰ型胶原-甲基纤维素3D环境中培养24 h,均可见管状分枝,且脑源性神经营养因子可促进管状分枝生长,以100 μg/L的脑源性神经营养因子的促生长效果最明显,分枝也最多。培养至    48 h,心脏微血管内皮细胞小球的分枝更长。说明脑源性神经营养因子在3D体外管状形成模型中可促进大鼠心脏微血管内皮细胞发芽及管状结构的形成,且具有剂量依赖性。     

Detection of MNNG-induced DNA lesions in mammalian cells; validation of comet assay against DNA unwinding technique,alkaline elution of DNA and chromosomal aberrations

Human cells (VH10 or Hep G2) and hamster cells V79 were exposed to different concentrations of N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) and the level of DNA lesions was evaluated by the DNA unwinding technique, alkaline elution of DNA and the comet assay. All three methods were able to detect the effects of MNNG but with a clear difference in sensitivity. At low concentrations of MNNG the most sensitive method appeared to be the comet assay. After the short-term treatment the comet assay was able to detect the lesions induced by MNNG at approx. 0.1 μg/ml, alkaline elution of DNA at 1 μg/ml and DNA unwinding at 1–2 μg/ml. MNNG treated VH10 cells, human lymphocytes and V79 cells were also tested cytogenetically, confirming that MNNG induced chromosomal aberrations at concentrations >1 μg/ml in VH10 cells (short-term treatment); >0.2 μg/ml in V79 cells (long-term treatment) and >8 μg/ml in human lymphocytes (long-term treatment). In some experiments we tried to increase the level of MNNG-induced DNA breaks with help of DNA repair inhibitors cytosine arabinoside (Ara C) and hydroxyurea (HU) which were applied either after or during MNNG treatment. Our results showed that the level of MNNG-induced lesions was increased by simultaneous treatment of cells with MNNG and Ara C and HU. 2×10⁻⁵ M Ara C and 2×10⁻³ M HU were as effective as 10-times higher concentrations of inhibitors. Ara C and HU increased the level of MNNG-induced DNA breaks mainly in combination with lower concentrations of MNNG (<2 μg/ml). Rejoining of DNA breaks was observed in human cells VH10 and Hep G2 as well as in Chinese hamster cells V79 damaged by both lower and higher MNNG-concentrations. All methods showed that MNNG-induced DNA breaks had been gradually rejoined.