志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析

目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运用多序列比对分析间隔序列特点及其与侧翼序列间的联系;BLAST分析间隔序列与质粒和噬菌体的同源性;weblogo分析重复序列碱基频率及RNAfold预测其RNA二级结构;重复序列的同源聚类分析并用BLAST分析重复序列与其他细菌的同源性。结果:被测3株临床志贺菌及9株全基因组志贺菌中均含有不同数量CRISPR;同一个CRISPR中,间隔序列有的相似、有的完全不同,某些CRISPR间隔序列的部分序列与CRISPR侧翼序列存在同源性,某些间隔序列可能是信息基因和操纵基因的拼接重组;重复序列保守性不一致,可能与细菌进化存在一定的联系,重复序列碱基的差异影响茎的长度,从而影响二级结构的稳定性及CRISPR的功能。重复序列与个别远缘菌种具有较高的同源性。结论:志贺菌存在多样的CRISPR结构,不同CRISPR的重复序列保守性不同。某些间隔序列部分与CRISPR侧翼序列同源,某些间隔序列是多基因拼接而成。     

基于环介导等温扩增技术及规则成簇间隔短回文重复序列的日本血吸虫核酸检测方法的建立及评价

目的 建立一种灵敏、特异的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)-规则成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的日本血吸虫核酸检测方法。方法 以日本血吸虫SjR2基因片段作为靶序列,设计LAMP引物、gRNA和ssDNA探针,建立并优化LAMPCRISPR反应体系。用LAMP-CRISPR方法检测含有SjR2靶序列的10倍梯度稀释的重组质粒,不同发育阶段日本血吸虫基因组DNA,以及肝片形吸虫、曼氏血吸虫、肥胖带绦虫、华支睾吸虫、似蚓蛔线虫、美洲钩口线虫、卫氏并殖吸虫、细粒棘球绦虫等蠕虫基因组DNA,评价其灵敏度和特异度。用LAMP-CRISPR方法分别检测15份血吸虫感染的阳性钉螺样本以及30份未感染的阴性钉螺样本,并与LAMP检测结果比较,以评价LAMP-CRISPR方法用于筛查感染性钉螺的应用效果。结果 建立的基于LAMP-CRISPR的核酸检测方法可特异性扩增并检测出日本血吸虫目的基因片段...     

乌兰县鼠疫自然疫源地分离鼠疫菌株CRISPR基因分型研究

目的 应用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats, CRISPR)基因分型方法,对乌兰县分离鼠疫菌株进行CRISPR基因分型分析,以了解该地区鼠疫菌CRISPR类群和基因型。方法 复苏培养乌兰县1966—2010年取自鼠疫患者、媒介昆虫和喜马拉雅旱獭的63株原始鼠疫菌株,提取其DNA,设计CRISPR的YPa、YPb、YPc 3个位点引物,利用PCR技术,对以上位点进行扩增,测定其扩增产物核酸序列并进行综合分析,将测得的CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库进行比对,探索是否存在之前未出现的CRISPR间隔(spacer)类群和基因型别,分析菌株间可能的进化关系,最终确定乌兰县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地鼠疫菌菌株的CRISPR基因库。结果 63株鼠疫菌在3个CRISPR位点上共有16种spacer,其中YPa位点9种、...     

短串联重复序列在医学中的应用

目的：介绍短串联重复序列在医学中的应用。方法：查阅国内外有关献加以综述。结果：短串联重复序列已广泛应用于医学临床和研究。结论：短串联重复序列是目前医学中应用的主要遗传标记。     

CRISPR-Cas9系统抑制乙型肝炎病毒复制相关研究

目的:探讨成簇的、规律间隔的短回文重复序列-相关核酸酶9（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociatedprotein-9nuclease,CRISPR-Cas9）技术的抗乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）作用。方法:通过生物信息学筛选,获得12条靶向HBV基因组不同区域的sgRNA（single-guideRNA,sgRNA）并分别构建pspCas9-sgRNA质粒,与HBV1.3倍体复制质粒共转染至HepG2细胞,通过荧光定量PCR筛选能够有效抑制HBV复制的sgRNA,并使用Southernblot验证获得的sgRNA功能;使用最新报道的重组共价闭合环状DNA（recombinantcovalentlyclosedcircularDNA,rcccDNA）模型评估CRISPRCas9对HBV共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）的抑制水平,并通过克隆测序检测rcccDNA的突变状况;对C57小鼠进行尾静脉高压水动力注射（hydrodynamicinjection,HDI）rcccDNA质粒与pspCas9-sgRNA,检测不同时间点外周血中乙型肝炎病毒s抗原（hepatitisBvirussurfaceantigen,HBsAg）及e抗原（hepatitisBviruseantigen,HBeAg）水平,通过免疫组化技术观察CRISPR-Cas9处理后肝脏中乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitisBviruscoreantigen,HBcAg）水平,在动物水平评估CRISPR-Cas9对HBV复制的抑制作用。结果:所筛选的靶向乙型肝炎病毒基因组聚合酶编码区以及衣壳蛋白编码区的sgRNA5及sgRNA9能有效抑制细胞中HBV复制,分别使细胞复制模型中rcDNA降低至对照组的（43.64±4.66）%（P=0.000）和（44.86±2.25）%（P=0.000）;在rCCCDNA细胞模型中证实2组sgRNA分别使cccDNA降低至对照组的（29.39±3.18）%（P=0.000）及（26.83±1.76）%（P=0.000）;CRISPR-Cas9系统主要使rcccDNA的靶点区域发生以短片段缺失为主的突变,突变率位50%⁶0%。CRISPR-Cas9系统能够有效降低HBV水动力小鼠模型血清HBsAg（sgRNA5:P=0.000;sgRNA9:P=0.001）及HBeAg浓度（sgRNA5:P=0.000;sgRNA9:P=0.000）;小鼠血清HBVDNA水平与对照组相比降低约1个lg值（sgRNA5:P=0.000;sgRNA9:P=0.001）,肝脏免疫组化结果显示CRISPR-Cas9系统能够降低组织HBcAg表达。结论:CRISPR-Cas9系统作为一种基因编辑技术,能够在细胞水平及动物模型中发挥抗HBV作用,可以作为一种新型的抗病毒策略并为HBV感染的治疗提供了一个新的方向。     

CRISPR/Cas9介导的同源重组在非编码区疾病相关位点功能研究中的应用

目的·以全基因组关联研究报道的系统性红斑狼疮相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs1978421为例,利用规律成簇间隔短回文重复序列/相关蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats...     

青海省海南藏族自治州鼠疫疫源地鼠疫菌规律成簇的间隔短回文重复基因分型研究

目的 研究青海省海南藏族自治州（简称“海南州”）鼠疫疫源地鼠疫菌的规律成簇的间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）基因型及其地区分布,为该疫源地的鼠疫防控工作提供科学依据。方法 1954—2009年海南州鼠疫疫源地内不同宿主动物和媒介昆虫体内分离的36株代表性鼠疫菌株为实验对象,采用传统的十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA。应用3对CRISPR引物（YPa、YPb、YPc）分别对被试菌株DNA进行PCR扩增、测序和分析,确定海南州鼠疫疫源地鼠疫菌的CRISPR基因型。结果 36株鼠疫菌中共发现17种非重复间区序列（spacer）,其中YPa 9种、YPb 5种、YPc 3种。所有鼠疫菌株被分为5个CRISPR基因簇（Cb2、Cb4’、Ca7、Ca7’、Ca35’）,6个基因型（G1、G9、G22、G22-a1’、G26-a1’、G26-a1’a4-）,其中G26-a1’型为主要基因型,分布于共和县、贵德县、兴海县;其次是G22型,分布于共和县、贵德县。结论 海南州...     

短串联重复序列位点CYP19,LPL,TH的多态性研究

应用ＰＣＲ及ＰＡＧ电泳技术研究了ＣＹＰ９、ＬＰＬ及ＴＨ３个ＳＴＲ位点的多态性。调查武汉地区２００名汉族无亲缘关系个体，首次获得汉族人群基因频率分布。３位点基因型频率分布与Ｈａｒｄｙ－Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡吻合。家系调查证实了等位基因具孟德尔遗传特征，观察４６次减数分裂未发现突变基因。分别计算了汉族人群ＣＹＰ１９、ＬＰＬ和ＴＨ位点的杂合度、个人识别能力、多态性信息总量和非父排除率，为法医学应用提供了基     

内源性表位标记的H1FX细胞系构建及其染色质分布图谱

目的 利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)基因组编辑技术对内源性H1FX进行表位标记来执行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq),探究前列腺癌22Rv1细胞中H1FX在基因组上的结合位点及分布规律。方法 以质粒pX330-U6-Chimeric＿BB-CBh-hSpCas9为载体,设计特异性向导RNA(gRNA),构建pX330-H1FX重组质粒,引导Cas9核酸酶至接近H1FX终止密码子的位置处进行切割。以含有3×FLAG表位标签、自剪切多肽2A和遗传霉素耐药基因序列的质粒pFETCh＿Donor为载体,序列两侧添加与双链断裂两侧区域同源的同源臂(HOMO),构建pFETCh＿Donor-HOMO重组质粒。将pX330-H1FX重组质粒和pFETCh＿Donor-HOMO重组质粒共转染到前列腺癌22Rv1细胞中,切割DNA并通过同源重组修复的方式整合表位标签。48 h后使用含遗传霉素的培养基筛选细胞。筛选出内源性表位标记的H1FX-FLAG细胞系后使用FLAG抗体进行ChIP。对ChIP富集的DNA和给料对照(Input)DNA进行建库...     

精神分裂症与8个短串连重复序列基因座遗传多态性的关联性研究

目的：探讨精神分裂症与8个短串连重复序列（ short tandem repeats,STR）基因座遗传多态性的关联性。方法以50位精神病专科医院住院患者为观察组,以150份正常人无关个体血液样本为对照组。采用PCR-STR复合扩增和毛细管电泳自动化检测技术检测观察组和对照组血样8个STR基因座遗传多态分布。用SPSS软件对数据进行分析,观察精神分裂症观察组和对照组相比是否有显著性差异,并对有显著性差异的基因位点进行相对危险度分析。用吻合度检验法验证观察组的Hardy-Weinberg平衡。结果在8个被检STR基因座中有6个基因位点在精神分裂症观察组与对照组之间差异有显著性意义（ P ＜0．05）,其中 D7S820-11、D19S433-14．2、D19S433-15的频率低于对照组,危险度RR＜1。 TH01-7、D19S433-13、D19S433-15．2的频率高于对照组,危险度RR＞1。8个STR基因座各基因型的观察值符合Hardy-Weinberg平衡。结论 D7S820-11、D19S433-14．2、D19S433-15可能与抑制精神分裂症发生具有一定的关系,而TH01-7、D19S433-13、D19S433-15．2可能与导致精神分裂症发生具有一定的关系。     

CRISPR/Cas9基因剪辑技术在乙型肝炎病毒感染治疗中的应用

CRISPR/Cas9基因剪辑技术源于细菌及古细菌CRISPR介导的后天获得性免疫系统,通过引导RNA与靶DNAPAM序列特异性识别,引发Cas9核酸酶定点切割互补双链DNA,在基因剪辑方面具有制备简单、剪辑位点特异性高及易于同时剪辑多个基因位点等优势,已被广泛应用于哺乳动物细胞基因剪辑。本文主要从CRISPR/Cas9技术作用原理和其抗乙型肝炎病毒感染作用及机制等方面进行综述。     

高分辨率熔解曲线在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中的应用

目的 建立一种基于PCR和在线高分辨率熔解曲线（high-resolution melting curve, HRM）分析工具的检测方法,实现对DNA序列微小差异的快速检测。方法 在CRISPR基因编辑检测和基因型鉴定中,采用两步PCR,分别对目的片段进行扩增和富集,并通过免费在线软件对HRM进行分析。结果 HRM分析结果显示,本实验所设计的CRISPR慢病毒系统未能对COS7细胞中的RPE65基因进行有效的基因编辑;而在瘦素突变大鼠的子代基因型中,HRM可以明显区分杂合子和纯合子。结论 HRM能够快速鉴定CRISPR编辑和区分基因型。     

基于CRISPR/Cas9系统构建ARID2基因敲除模型并探索其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的:通过成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/Cas9,CRISPR/Cas9)系统在SK-Hep1肝癌细胞系中构建AT富集作用域2(AT-richinteractiondomain2,ARID2)基因敲除模型,并初步观察ARID2敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:设计并合成靶向ARID2的向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)寡核苷酸序列,长度为20bp,构建到CRISPR表达载体上,转染HEK293T细胞包装慢病毒并筛选稳定细胞株,采用克隆形成、Transwell和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果:目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的LentiCRISPER-V2质粒载体中且测序正确;经Westernblot鉴定ARID2敲除的细胞株筛选成功;ARID2基因敲除后,与亲本细胞系相比,其蛋白表达缺失;克隆形成实验结果示ARID2敲除细胞株(1#6)培养至10d时克隆形成数为(125.600±5.131)个,亲本细胞株克隆形成数为(69.000±5.567)个(t=12.962,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)培养至8d时克隆形成数为(94.000±8.737)个,亲本细胞株克隆形成数为(67.000±5.292)个(t=4.635,P=0.010),差异有统计学意义。Transwell结果示ARID2敲除细胞株(1#6)在24h的迁移细胞数为(180.000±5.542)个,亲本细胞组的迁移细胞数为(90.400±5.031)个(t=20.731,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)在24h的迁移细胞数为(138.600±5.749)个,亲本细胞组的迁移细胞数为(78.400±5.703)个(t=12.891,P=0.000),差异有统计学意义。划痕实验结果示ARID2敲除细胞株(1#6)16h划痕愈合度为(88.000±0.011)%,亲本细胞组划痕愈合度为(52.500±0.047)%(t=12.490,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)16h划痕愈合度为(71.900±0.020)%,亲本细胞组划痕愈合度为(55.200±0.024)%(t=9.190,P=0.001),差异有统计学意义。结论:ARID2敲除可明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,证实ARID2作为抑癌基因参与肝癌的发生和进程。ARID2敲除细胞模型为肝癌的深入研究提供新的手段。     

优选短串联重复序列应用于脊肌萎缩症产前诊断的连锁分析

目的建立完整的适合汉族人群的脊肌萎缩症（SMA）产前基因诊断体系。方法对30名正常汉族人的外周血样本进行基因多态性分析,评估位于运动神经元存活基因1（SMN1）两侧的短串联重复序列（STR）位点的多态信息含量;并通过在6个SMA产前诊断家系连锁中的应用,优选出STR位点,并结合PCR酶-切法（PCR-RFLP）进一步评价STR位点与SMN1基因的连锁紧密性。结果从7个STR位点中优选出D5S435、D5S629、D5S610和D5S351四个STR位点用于家系连锁分析,联合PCR-RFLP,在6名待检胎儿中检出2例患者和4例携带者。结论通过优选出的4个多态性强、与SMN1基因紧密连锁的STR位点,联合家系连锁和PCR-RFLP,建立起稳定可靠的适合汉族人群的SMA产前基因诊断体系。     

优选短串联重复序列应用于脊肌萎缩症产前诊断的连锁分析

目的 建立完整的适合汉族人群的脊肌萎缩症(SMA)产前基因诊断体系.方法 对30名正常汉族人的外周血样本进行基因多态性分析,评估位于运动神经元存活基因1(SMN1)两侧的短串联重复序列(STR)位点的多态信息含量;并通过在6个SMA产前诊断家系连锁中的应用,优选出STR位点,并结合PCR-酶切法(PCR-RFLP)进一步评价STR位点与SMN1基因的连锁紧密性.结果 从7个STR位点中优选出D5S435、D5S629、D5S610和D5S351四个STR位点用于家系连锁分析,联合PCR-RFLP,在6名待检胎儿中检出2例患者和4例携带者.结论 通过优选出的4个多态性强、与SMN1基因紧密连锁的STR位点,联合家系连锁和PCR-RFLP,建立起稳定可靠的适合汉族人群的SMA产前基因诊断体系.     

人类短串联重复序列(STR)及其研究进展

短串联重复序列（STR）作为第二代遗传标记,广泛的分布于人类基因组中。本文介绍了STR及其分型特点。以及STR应用于遗传制图、法医学鉴定、人类学、群体遗传学、基因诊断、器官移植等方面内容。     

西藏藏族15个STRs位点多态性及其与其他民族群体的遗传关系

目的:研究西藏藏族人群15个短串联重复序列(short tandem repeats,STRs)位点(D8S1179,D21S11,D7S820, CSF1P0,D3S1358,TH01,D13S317,D16S539,D2S1338,D19S433,vWA,TPOX,D18S51,D5S818,FGA)的多态性分布及群体遗传学和法医学应用价值.并分析它们与西藏其他民族及其他亚洲人群间的遗传学关系.方法:采用AB13100遗传分析仪检测STRs基因多态性,用ARLEQUIN 3.1软件计算等位基因频率和各种多态性参数.并将其结果与文献报道的其他亚洲人群的STRs结果进行比对,DISPAN软件计算遗传距离(DA)、基因分化系数(Gst)和杂合度(Ht),MEGA4.0软件绘制进化树,SPSS14.0进行多维量表法(MDS)分析.结果:藏族群体中共检出132种等位基因,频率分布0.0050～0.5990;杂合度、个体识别力、多态性信息量等群体遗传学指标分析显示,15个STRs位点具有中度或高度多态性,中国藏族群体具有较独立的遗传结构.结论:所选择的15个STRs位点具有较高的个体识别力和多态性信息量,可用于群体遗传学和法医学研究.     

基于15个短串联重复基因座分析湖北土家族与湖北汉族的群体遗传结构及系统发育关系

目的 研究湖北土家族和汉族人群的群体遗传结构和系统发育关系,探讨湖北土家族的起源及其与湖北汉族等民族间的相互关系,为我国人群的法医学和遗传学研究以及民族政策的制定提供科学依据.方法 选取湖北土家族(333例)和湖北汉族(89例)3代均为本民族且无亲缘关系的个体,采用15个短串联重复(short tandem repea...