用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究：Ⅱ.蚊幼 …

为了提高Ｂ．ｓ．对蚊幼虫肠壁细胞膜的识别和从而提高其杀蚊活性，本实验解剖了万余中华按蚊幼虫肠道，制备了按蚊幼虫肠壁膜泡抗原及其鼠抗血清。抗原蛋白组分分析表明膜泡的纯度较高，而抗血清实验则显示抗体组分与肠壁的结合作用。利用ＰＣＲ技术成功扩增了小鼠抗体重链区基因，借助Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰，使抗体基因得以成功克隆，为研制抗体基因与毒蛋白基因融合编码的“生物导弹”打下了基础。     

中华按蚊幼虫肠细胞膜级分的制备及其鼠抗血清对幼虫的效应

已和在芽孢杆菌杀虫蛋白的毒效依赖于它们与幼虫肠细胞膜的亲合力，对于其机理的研究和应用蛋白质工程手段改造杀蚊蛋白来说，蚊幼虫肠细胞膜的制备是必不可少的。本研究收集了万余只中华按蚊幼虫肠道，用于分离其细胞膜级分，进行蛋白组分分析，鼠抗血清的制备以及该抗血清对幼虫的作用的观察，仅在一龄幼虫观察到致死效应。     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究 Ⅰ.球形芽孢杆菌毒蛋白基因42的克隆

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片段,通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰,使目的基因片段得以成功克隆。借助光敏生物素核酸标记探针,原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。本实验中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰是ＰＣＲ产物克隆成功的关键     

中华按蚊幼虫肠细胞膜级分的制备及其鼠抗血清对幼虫的效应 (英文)

已知芽孢杆卤杀虫蛋白的毒效依赖于它们与幼虫肠细胞膜的亲合力。对于其机理的研究和应用蛋白质工程手段改造杀蚊蛋白来说,蚊幼虫肠细胞膜的制备是必不可少的。本研究收集了万余只中华按蚊幼虫肠道,用于分离其细胞膜级分,进行蛋白组分分析,鼠抗血清的制备以及该抗血清对幼虫的作用的观察。仅在一龄幼虫观察到致死效应。     

用基因融合技术进行杀蚊幼毒蛋白基因的研究：Ⅰ.球形芽孢 …

为了提高球形芽孢杆菌对中华按蚊的毒效,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术成功扩增了Ｂ．ｓ．中有毒效作用的基因片估,通过Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰,使目的基因片段得以成功克隆,借助光微生物素核酸标记探针,原位杂交筛选出目的基因阳性克隆。本实验中Ｔ４ＤＮＡ聚合酶的修饰是ＰＣＲ产物克隆成功的关键。     

球形芽孢杆菌2362株杀蚊幼虫蛋白基因的克隆

利用合成的寡核苷酸探针从球形芽孢杆菌2362株基因文库中筛选了四个杂交阳性克隆,它们分别携带质粒 pDC4(7.8kb)、pDC5(7.8kb)、pDC6(8.4kb)和 pDC7(6.4kb)。斑点杂交结果显示,探针与pDC7结合能力明显比与 pDC4和 pDC6结合能力弱。四个杂合质粒 EcoRI 酶切图谱不同,但插入片段中都含有一个3.3kb 片段。Southern 印迹杂交实验进一步揭示该3.3kb 带可为探针识别;pDC24除此之外还有-1.4kb 杂交带,表明该质粒中携有两个与探针同源的序列。在以上四个克隆中,E.coli HB101(pDC4)对淡色库蚊幼虫有显著毒性,因而携有完整的基因51和基因42序列。     

人Cubilin基因融合蛋白表达及其抗体的制备

Cubilin是属于低密度脂蛋白(LDL)受体超家族成员的吞饮受体，广泛分布于体内多种组织上皮细胞。大量研究表明，Cubilin参与多种生物代谢产物的跨细胞转运，与生命的正常生存发育有着密不可分的关系。在肾脏，Cubilin主要分布在近端肾小管上皮细胞的刷状缘侧，司近端肾小管对白蛋白、球蛋白、转铁蛋白等多种尿蛋白成分的重吸收。     

功能未知基因C170rff7重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C170rf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法~HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C170rf77目的基因片段,构建pET-32a（＋）．C170rf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C170rf77重组蛋白表达并进行Westernblot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C170rf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Westernblot观察C170rf77蛋白在HepG2、L02、Lx2和Jurkat细胞系的表达情况。结果PCR扩增获得C170rf77基因片段,成功诱导表达了C170rf77重组蛋白。制备了多克隆抗．C170rf77,ELISA检测抗体效价〉1：1280000。不同浓度C170rf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性（P〉0．05）。C170rf77蛋白在HepG2、L02、Lx2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C170rf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C170rf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4’T细胞系（Jurkat细胞）均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

功能未知基因C17orf77重组蛋白及多克隆抗体的制备

目的体外克隆表达C17orf77重组蛋白,制备其多克隆抗体,初步探索该蛋白的生物学作用,观察其细胞系分布特征。方法以HepG2细胞cDNA为模板,PCR扩增C17orf77目的基因片段,构建pET-32a(+)-C17orf77原核表达载体。转化大肠埃希菌,IPTG诱导C17orf77重组蛋白表达并进行Western blot鉴定。以重组蛋白免疫大耳白兔,获得兔抗C17orf77蛋白多克隆抗体,并分析其特异性及检测效价。MTT法观察不同浓度重组蛋白对HepG2细胞增殖的影响。利用Western blot观察C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系的表达情况。结果 PCR扩增获得C17orf77基因片段,成功诱导表达了C17orf77重组蛋白。制备了多克隆抗-C17orf77,ELISA检测抗体效价1∶1280000。不同浓度C17orf77重组蛋白对HepG2细胞无明显增殖促进或抑制活性(P0.05)。C17orf77蛋白在HepG2、L02、LX2和Jurkat细胞系均有分布。结论利用体外克隆表达的C17orf77重组蛋白可制备效价和特异性均较高的多克隆抗体。HBV感染相关基因C17orf77在体外肝脏的间质和实质细胞,以及CD4+T细胞系(Jurkat细胞)均有不同程度的表达。提示该基因可能与HBV感染的致病过程相关。     

EB病毒融合基因Z2A重组BCG的免疫学特性研究

目的对EB病毒融合基因Z2A构建的重组BCG进行鉴定及免疫学研究。方法采用Westernblot方法检测重组BCG中Z2A基因的表达;用重组BCG免疫小鼠,用ELIsA方法检测小鼠血清特异性抗体水平,采用乳酸脱氢酶法检测小鼠的细胞免疫水平,评价重组BCG的免疫效果。结果重组BCG表达的蛋白能被血清BZLFl抗体（或LMP2A抗体）识别;ELISA检测表明,重组BCG能刺激机体产生抗体,当重组BCG细菌数为5×10-8个／只时,抗体滴度最高为17600（186．5±6．7Pg／ml）;BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为（32．5±2．7）％和（22．8±2．3）％,重组BCG组为（62．7±6．2）％,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论EB病毒融合基因Z2A重组BCG免疫效果良好,能刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。     

EB病毒融合基因Z2A重组BCG的免疫学特性研究北大核心CSCD

目的对EB病毒融合基因Z2A构建的重组BCG进行鉴定及免疫学研究。方法采用Western blot方法检测重组BCG中Z2A基因的表达;用重组BCG免疫小鼠,用ELISA方法检测小鼠血清特异性抗体水平,采用乳酸脱氢酶法检测小鼠的细胞免疫水平,评价重组BCG的免疫效果。结果重组BCG表达的蛋白能被血清BZLF1抗体(或LMP2A抗体)识别;ELISA检测表明,重组BCG能刺激机体产生抗体,当重组BCG细菌数为5×108个/只时,抗体滴度最高为17 600(186.5±6.7pg/ml);BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为(32.5±2.7)%和(22.8±2.3)%,重组BCG组为(62.7±6.2)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EB病毒融合基因Z2A重组BCG免疫效果良好,能刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应。     

旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白对小鼠的免疫保护性研究

目的 探讨旋毛虫编码新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白WN10对小鼠的免疫保护性。方法 将纯化的重组融合蛋白WN10以20μg/只的剂量分3次免疫小鼠后，攻击感染旋毛虫肌幼虫200条／只，检查旋毛虫7日龄成虫数、雌虫体外产生新生幼虫数、感染35d的肌幼虫数并计算减虫率，同时用ELISA法检测血清中抗WN10抗体IgG滴度。结果WN10免疫小鼠后获得旋毛虫7日龄成虫、肌幼虫的减虫率分别为64．28％和61．21％，均与感染对照组和佐剂对照组差异显著；获得雌虫产新生幼虫的减虫率为16．46％，与感染对照组和佐剂对照组差异不显著；WN10免疫组小鼠在第3次免疫后1周可检测到高滴度的抗WN10抗体IgG，在攻击感染旋毛虫9周后仍维持在较高水平。结论 编码旋毛虫新生幼虫p46 kDa抗原基因重组融合蛋白可诱导小鼠产生较强的抗旋毛虫保护性免疫。     

血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导融合蛋白的表达,并对其进行纯化;制备兔抗BC097361蛋白多克隆抗体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR技术,以LX02细胞总RNA为模板,扩增BC097361目的 基因片段,构建原核表达载体pET-32a(+)-BC097361.转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-半乳糖苷诱导并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Western blot分析证实融合蛋白表达的特异性.大量表达后利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性.纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗BC097361蛋白的多克隆抗体.以纯化的BC097361蛋白为抗原,分别以免疫前后的新西兰兔血清作为第一抗体,利用Western blot和酶联免疫吸附法对多克隆抗体进行特异性分析及效价检测.结果 扩增获得BC097361基因片段,成功表达了BC097361相关蛋白,经十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析得到证实.成功获得融合蛋白及兔抗BC097361多克隆抗体.酶联免疫吸附法检测证实多克隆抗体效价>1:320 000,Western blot、免疫组织化学检测证明多克隆抗体的特异性良好.结论 利用大肠埃希菌BL21(DE3)能够成功表达BC097361蛋白,获得高特异性、高效价兔抗BC097361蛋白的多克隆抗体,为今后研究BC097361蛋白的生物学特性奠定了基础.     

p7TP2融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及其多克隆抗体的制备和应用

目的应用基因芯片技术筛选获得p7蛋白反式调节的新基因,即丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白反式激活基因p7TP2,研究其生物学功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-p7TP2,转入大肠埃希菌Rosetta-gami B中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在相对分子量约35kD处有一条特异的蛋白质条带,以包涵体形式表达,并通过蛋白质变性、重折叠及纯化后得到了高纯度融合蛋白,将重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备抗-p7TP2多克隆抗体。结果经酶联免疫吸附法(ELISA)测定、蛋白印迹(Western blot)和免疫组织化学鉴定,制备的多克隆抗体具有较高效价和特异性。结论 p7TP2蛋白的表达及多克隆抗体的制备为进一步研究HCV p7TP2蛋白的功能及丙型肝炎的发病机理创造了条件。     

应用合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1多克隆抗体的研究

目的应用人工合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1(Lung Cancer Metastasis-Related Protein1,LCMR1)的多克隆抗体。方法运用生物信息学技术和人工合成多肽方法制备LCMR1特异性多肽,鉴定纯度后与牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白进行偶联制备多肽抗原,然后免疫新西兰雄性白兔,获得抗血清,经亲和层析法纯化后,用ELISA法鉴定抗体效价,用Western Blot鉴定特异性。结果成功获得了LCMR1的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1:100 000,Western Blot免疫印迹结果显示其具有抗原特异性识别。结论应用免疫原性肽抗体技术成功制备了LCMR1的多克隆抗体,为今后深入了解LCMR1基因的生物学功能提供了有用的研究工具。     

胃肠道肿瘤靶向抗癌胚抗原单链抗体与T细胞表面受体基因的融合分子构建

目的 将胃肠道癌胚抗原(CEA)特异性单链抗体基因与人T细胞CD3ξ胞内区、跨膜区基因克隆入真核表达载体，表达相应的融合分子，以期制备消化道肿瘤靶向性杀伤T细胞。方法 应用PCR法扩增抗CEA特异性单链抗体(scFv)基因；用RT-PCR法从正常人外周血T细胞扩增出CD3ξ胞内区、跨膜区基因；将单链抗体插入CD3ξ基因序列的上游，构建重组真核表达载体scFv-CD3ξ-pcDNA3．0并测序。结果 抗CEA scFv cDNA片段为810bp，与已知的序列相符；CD3ξ胞内区、跨膜区的cD-NA片段为438bp，与基因库公布的序列一致。重组的表达载体经酶切琼脂糖电泳及测序加以证实。结论 成功制备了具有抗肿瘤相关抗原CEA靶向性及CD3ξ胞内区、跨膜区信号转导功能的重组分子，为制备消化道肿瘤靶向性嵌合锚定T细胞奠定了实验基础。     

小反刍兽疫病毒西藏株血凝素蛋白和融合蛋白兔多克隆抗体的制备与初步应用北大核心CSCD

目的 对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants Virus,PPRV)强毒株China/Tibet/Geg/07-30血凝素蛋白H和融合蛋白F的主要抗原表位区进行原核表达,并制备兔抗PPRV H和F蛋白多克隆抗体。方法 根据GenBank上公布的PPRV China/Tibet/Geg/07-30 (GenBank FJ905304.1)株H和F蛋白的基因序列构建重组质粒pET30a(+)-H和PGEX-4T-1-F,并将重组质粒转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达目的蛋白,经亲和层析纯化后与弗氏佐剂混合免疫新西兰大白兔,收集血清,制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光(IFA)方法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体与抗原的结合能力。结果 分别对重组质粒进行酶切,pET30a(+)-H切出约1 653 bp的PPRV H基因,PGEX-4T-1-F切出约为1 245 bp的PPRV F基因,与预期一致。经IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式表达,Western blot检测原核表达的两个目的蛋白均能与标签抗体发生反应,ELISA检测原核蛋白抗原能与相应多克隆抗体相结合,间接免疫荧光试验显示兔多克隆抗体能够识别表达PPRV H蛋白的重组狂犬病病毒(rSRV9-H)和表达PPRV F蛋白的重组狂犬病病毒(rSRV9-F)。结论 利用原核表达系统成功表达出具有抗原性的PPRV China/Tibet/Geg/07-30株F和H蛋白,并制备了高特异的兔多克隆抗体,为建立针对PPRV H、F蛋白抗原的鉴定及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

抗人红细胞单链抗体与狂犬病毒G蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

摘要：目的 为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白。方法 本研究利用特异性引物从重组质粒pMD-2E8ScFv和pMD-G中以PCR方法扩增2E8基因（抗人红细胞H抗原单链抗体基因）和Kg基因(狂犬病毒G基因主要抗原表位区),采用重叠延伸（SOE）PCR法拼接成融合基因2E8Kg,构建原核表达质粒pET-Trx-2E8Kg并将其转化至BL21（DE3）plysS中进行诱导表达并对诱导菌液进行SDS-PAGE分析。结果 2E8Kg融合基因获得了高效表达并主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的23.5%左右,分子量约为77.7kD,与预期的大小一致。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱甘肽还原法进行复性,纯化后蛋白纯度达到98.9%。结论 经Western-blot检测和红细胞凝集试验证明,2E8kg融合蛋白既能够与狂犬病毒（RV）高免血清发生特异性反应,又能够与人红细胞结合,具有双功能特性。     

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白联合甲氨蝶呤治疗活动性类风湿关节炎的疗效和安全性的开放多中心临床研究

目的 评估重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体—抗体融合蛋白(rhTNRF:Fc)联合甲氨蝶呤治疗活动性类风湿关节炎(RA) 52周的临床疗效、放射学改变和安全性。方法 30例中重度活动性RA患者应用rhTNRF：Fc(25 mg皮下注射,每周2次)联合甲氨蝶呤（每周15 mg口服）治疗。应用美国风湿病学会(ACR)20、50、70疗效标准和28个关节的疾病活动度评分(DAS28)评估临床疗效,应用改良的Sharp评分标准评价放射学疗效。计数资料应用x2检验或Fisher精确检验,计量资料采用配对t检验。结果 治疗52周时达到ACR20、50、70标准的有效率分别为90％、87％和67％。DAS28由6.4±0.6降至3.4±1.1(P＜0.01),23％患者达到疾病缓解,17％达到低度活动状态。健康状况问卷由1.18±0.56降至0.25±0.34（P＜0.01）。基线期和52周时,双手和双腕X线片关节间隙狭窄（8±10与8±11）和关节侵蚀(10±15与10±15)的改良Sharp评分差异无统计学意义;73％患者无放射学进展。未见严重不良反应,无新发结核菌感染和恶性肿瘤。结论 rhTNRF:Fc联合甲氨蝶呤治疗RA 52周能够显著减低疾病活动度、改善关节功能以及延缓放射学进展,达到临床缓解和阻止放射学进展的治疗目标：且耐受性良好。     

基因重组融合蛋白hNPY对小鼠前脂肪细胞增殖和分化影响的实验研究

目的：前脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化潜力的特异化的前体细胞,如能找到可促进前脂肪细胞增殖和分化的因子或药物,并在脂肪组织移植的同时使用,则有希望提高脂肪组织的移植效果,本实验探索一种新的人体肥胖关联基因和外周脂肪细胞激动剂一基因重组融合蛋白hNPY对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响及其分子调控机制。方法：采用基因工程技术设计hNPY基因上下游序列,经过PCR反应合成hNPY的cDNA后与pET28a＋载体重组,再将已构建好、并经测序确认无误的重组质粒pET28a—NPY转导至大肠杆菌BL21（DE3）,再由IPTG诱导表达hNPY融合蛋白、并进行纯化;然后,将体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞经由3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和地塞米松进行联合诱导;诱导2d后,再将此细胞分为三组,即空白对照组（未加任何诱导剂组）、经典诱导组（胰岛素诱导）和实验干预组（hNPY融合蛋白干预）,其中,实验干预组再按照hNPY融合蛋白浓度不同又分为高、中、低三个浓度组（10^-8mol／L、10^-19mol／L和10^-9 mol／L）。分别于细胞培养的第7d和第12d用相差显微镜观察各组细胞的形态学变化,再于细胞培养的第12d用油红O染色观察脂肪细胞的分化程度;同时,采用MTT法检测该细胞的增殖状况;采用Westernblot法检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体-γ（PPAR-γ）、CAAT／增强子结合蛋白-a（C／EBP-a）蛋白的表达水平。结果：低浓度（10^-10 mol／L）的hNPY融合蛋白,无明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的作用效果;中浓度（10^-9 mol／L）的hNPY融合蛋白,可有效促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖及细胞数量增多;而高浓度（10^-8 mol／L）的hNPY融合蛋白,不仅能明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的细胞增殖和分化,且能显著提高该细胞C／EBPa和PPARγ的表达水平、而明显降低INSIG-2的表达。结论：高浓度（10^-8mol／L）的基因重组融合蛋白hNPY能够明显促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化,其促进3T3-L1细胞增殖和分化的分子调控机制很可能与上调PPARγ、C／EBPa表达和降低INSIG-2表达水平有关,这提示：hNPY作为脂肪细胞膜上受体NPYR的有效促进剂或激动剂,未来很可能成为人体外周脂肪细胞一个新的作用靶点。