未成熟树突状细胞表面CD1d分子在体外移植免疫中的作用

背景：树突状细胞具有双向免疫调节作用,成熟树突状细胞激活免疫应答,而未成熟树突状细胞则倾向诱导免疫耐受。 目的：探讨鼠CD1d分子在未成熟树突状细胞诱导移植免疫耐受中的作用,以及在此过程中细胞因子的参与机制。 方法：利用vIL-10转染的BALB/c小鼠未成熟树突状细胞在体外用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因、脂多糖刺激成熟,经抗CD1d(anti-CD1d)干预。观察培养后的细胞表型、细胞因子表达。为探明CD1d分子在异体T细胞存在下的免疫作用,进行不同实验条件的初次、再次混合淋巴细胞培养(1stMLC、2ndMLC),观察T细胞增殖、细胞因子表达。 结果与结论：Anti-CD1d的干预降低了未成熟树突状细胞增殖异体T细胞的能力,anti-CD1d干预的未成熟树突状细胞致敏异体T细胞后其免疫功能低下;anti-CD1d干预在异体T细胞存在时影响未成熟树突状细胞在功能上的成熟,主要表现在抑制白细胞介素12的分泌,加强白细胞介素10的分泌。     

狼疮鼠骨髓树突状细胞的分离培养和免疫学特性

目的对狼疮鼠骨髓树突状细胞进行分离、培养并分析其免疫学特性,为进一步研究和应用狼疮鼠骨髓来源树突状细胞（DC）奠定基础。方法分离、纯化6周龄雄性BXSB狼疮鼠骨髓单核细胞,以含10%胎牛血清、2ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和20ng/ml重组小鼠白细胞介素-4的RPMI-1640培养基培养,以脂多糖（LPS,1μg/ml）刺激24h体外诱导BXSB狼疮鼠骨髓细胞分化为DC,倒置显微镜动态观察细胞形态学变化,流式细胞仪分析细胞表面分子,混合淋巴细胞反应检测其刺激T细胞增殖能力。结果经体外诱导培养第2～8天可见大量细胞集落形成,培养的DC具有典型树突状形态,同时DC可显著刺激同种异体混合淋巴细胞增殖。结论体外诱导培养可稳定获得BXSB狼疮鼠骨髓来源DC。     

Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

背景：树突状细胞在未成熟阶段表现出极强的抗原吞噬功能，它可以在免疫耐受、癌症的免疫治疗等方面都表现出极大的优越性。但由于未成熟树突状细胞在生物体内含量极微，这就严重限制了它在临床、科研方面的应用。目的：提取鉴别Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞。方法：从Lewis大鼠骨髓中分离骨髓前体细胞，应用20 ng/m L粒细胞集落刺激因子、10 ng/m L白细胞介素4培养7 d诱导为未成熟树突状细胞，然后在未成熟树突状细胞中加入1μg/m L脂多糖继续培养2 d诱导为成熟树突状细胞。采用荧光倒置显微镜观察树突状细胞形态，流式细胞仪鉴定成熟和未成熟树突状细胞表面特异性分子，ELISA检测成熟和未成熟树突状细胞培养上清白细胞介素10、白细胞介素12和白细胞介素17A因子的分泌水平，混合淋巴细胞反应检测成熟和未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激反应。结果与结论：(1)普通荧光倒置显微镜下观察树突状细胞具有明显的突起结构；(2)流式细胞仪可见未成熟树突状细胞低表达CD40、CD86等共刺激分子；相反，成熟树突状细胞高表达上述共刺激分子；(3)未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素17A...     

丁酸钠诱导的未成熟树突状细胞的免疫学功能研究

目的： 探讨丁酸钠对人外周血来源的树突状细胞（DC）的成熟状态和免疫学功能的影响。方法： 通过粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）结合丁酸钠体外诱导人外周血来源的DC，6 d后结合不同成熟因子诱导成熟，并以流式细胞仪、FITC标记的Dextran的内吞检测、混合淋巴细胞反应（MLR）、ELISA法分别检测DC的表面标志、内吞能力、DC刺激淋巴细胞增殖能力和白细胞介素12（IL-12）分泌量的改变。结果： 丁酸钠可以抑制DC成熟，使DC具有较强的抗原吞噬能力，而刺激淋巴细胞增殖能力和IL-12的分泌能力下降。结论： 丁酸钠可以抑制DC成熟，诱导不成熟DC生成，在移植免疫耐受方面具有较好的应用前景。     

慢病毒载体介导的IL-10诱导耐受性树突状细胞的形成

探讨通过IL-10重组慢病毒载体转染小鼠未成熟树突状细胞(iDC),构建高分泌IL-10的耐受性树突状细胞的可行性.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)联合诱导并经CD11c免疫磁珠分选获得小鼠骨髓iDC,倒置显微镜下观察,流式细胞术分析细胞表面分子:IL-10重组慢病毒载体转染小鼠iD...     

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景：沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞？ 目的：探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响。 方法：利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelB shRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察。 结果：体外培养第 6 天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P > 0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P < 0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P < 0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似。说明RelB shRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟。     

人脐带血来源树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞体外培养及鉴定

目的建立从人脐带血体外诱导扩增树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞的方法。方法从正常人脐带血中分离出单核细胞,经3种细胞因子—重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)和重组人肿瘤坏死因子(rh TNF-α)联合诱导培养,7 d后收获细胞,并利用光学显微镜、免疫组化的方法进行鉴定。结果培养收获了高纯度的树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞,细胞高水平表达CD1a、CD86、CD68和CD14。结论人脐带血单核细胞经细胞因子诱导培养可以得到大量的成熟树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞。     

姜黄素诱导的免疫耐受性人树突状细胞的研究

目的:探讨姜黄素(Curcumin)诱导免疫耐受性人树突状细胞(Dendritic cell,DC)的效果。方法:聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)密度梯度离心法获得健康人外周血单个核细胞(PBMC),在含有重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素4(rhIL-4)的培养基中培养6天。实验共分四组:①未成熟DC组(imDC组)、②姜黄素组(Curcumin,Cur组)、③姜黄素+脂多糖组(Cur+LPS组)、④脂多糖组(LPS组)。流式细胞术检测DC表型CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达情况和DC吞噬葡聚糖的能力,酶联免疫吸附法(ELISA)检测DC分泌白介素-12(IL-12)的能力,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果:Cur能够显著抑制DC共刺激分子CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表达,并呈剂量依赖性,与imDC组比较差异无统计学意义;与LPS组比较,Cur+LPS组DC吞噬葡聚糖的阳性细胞百分率显著提高(P<0.05),而刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力则显著下降(P<0.05),IL-12的分泌量也显著下降(P<0.05)。结论:姜黄素能够抑制人树突状细胞的成熟,从而获得免疫耐受性的人树突状细胞。     

体外培养小鼠骨髓树突状细胞的扩增、鉴定及形态学观察

目的建立体外培养和扩增树突状细胞(dendritic cell-DC)的方法,并进行形态学观察。方法在无菌条件下提取BALB/c小鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,以小鼠重组粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL-4)协同诱导下培养,免疫组织化学染色、光镜和电镜下观察树突状细胞的形态。结果体外培养2周后小鼠树突状细胞可达70%~80%,光镜下可见典型的树突状细胞形态,S-100蛋白染色均呈阳性。电镜下,培养的细胞具有典型树突状细胞的形态特征,细胞功能活跃。结论体外大量培养和扩增小鼠骨髓树突状细胞,具有典型的树突状细胞的形态,为研究树突状细胞的功能和表型以及抗肿瘤作用提供体外实验材料。     

人脾脏树突状细胞的分离纯化与鉴定

目的　建立人脾脏体外培养树突状细胞的新方法。方法　人脾脏细胞悬液培养 2h后获得贴壁的单核细胞 ,加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (rhGMCSF) 10 0 μg/L或rhGMCSF 10 0 μg/L +重组人白细胞介素 4 (rhIL 4 ) 5 0 0k/L ,体外培养 1周 ,收集悬浮细胞 ,以流式细胞仪分析细胞表型及抗原内吞能力 ,alloMLR检测细胞抗原呈递功能。结果　以细胞因子培养 7d生成的悬浮细胞 ,2 0 %～ 80 %表达树突状细胞特异性标志CD1a ,表达高水平的MHC Ⅱ、B71、B72分子 ,具有较强的抗原内吞能力 ,抗原内吞能力及T淋巴细胞活性与人外周血单核细胞培养获得的DC相似。结论　从人脾脏获得的贴壁的单核细胞 ,体外以rhGMCSF +rhIL 4培养 ,可以获得极其大量的树突状细胞     

FVB小鼠骨髓源树突状细胞的培养

目的 建立FVB小鼠骨髓源树突状细胞体外培养和扩增方法,观察其形态和特征.方法 在无菌条件下提取FVB鼠骨髓细胞,分离单个核细胞,用IL-4和GM-CSF联合协同诱导下培养,加用磷酸脂多糖刺激.应用光镜下观察树突状细胞的形态,流色细胞仪检测鉴定其生物学特征.结果 联合培养小鼠骨髓细胞3d后,可见细胞形态发生改变,细胞形...     

人外周血单核细胞分化为树突状细胞过程中核转录因子-κB p50的表达及柴胡皂苷a的影响

目的 观察人外周血单核细胞分化为树突状细胞(DC)过程中,核转录因子-κB p50(NF-κB p50)的表达以及柴胡皂苷a对单核细胞分化为树突状细胞的影响.方法 非连续密度梯度离心获取人外周血单核细胞;用含粒单细胞刺激因子(GM-CSF)、IL-4、肿瘤坏死因子(TNF-α)和柴胡皂苷a的RPMI-1640培养液分别对细胞因子组、柴胡皂苷组、联合培养组的单核细胞进行体外培养;应用倒置相差显微镜、瑞氏染色和CD14、CD83、HLA-DR、S-100的免疫细胞化学法鉴定单核细胞和DC;动态观察单核细胞分化为DC过程中不同时间点的NF-κB p50的表达,并进行图像分析.结果 CD14、CD83、HLA-DR、S-100免疫细胞化学法证实所获单核细胞和DC符合各自的形态和表型特征.在含GM-CSF和IL-4的RPMI-1640培养液培养7d时,单核细胞分化成未成熟DC(imDC);在含GM-CSF、IL-4和TNF-a的RPMI-1640培养液继续培养3d时,imDC分化为成熟DC(mDC),两者的细胞核内NF-κB p50表达具有显著性差异(P<0.05).单纯用只含柴胡皂苷a的RPMI-1640培养液培养单核细胞至7d时,可见其细胞核呈NF-κB p50阳性,但未见其分化为DC.若用含GM-CSF、IL-4和柴胡皂苷a的RPMI-1640培养液联合培养7d时,则该单核细胞分化为imDC;加入TNF-α后继续培养3d,imDC的细胞核呈NF-κB p50强阳性,免疫细胞化学法证实imDC已经分化为mDC.联合培养组细胞的表型表达均强于只加细胞因子组(P<0.05).结论 人外周血单核细胞分化为imDC和mDC过程中,细胞核内NF-κB p50表达逐渐增强.单纯用低浓度柴胡皂苷a不能刺激单核细胞分化为DC,但联合细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α培养时,可使其分化为imDC和mDC.     

紫杉醇对骨髓细胞体外诱导分化的巨噬细胞影响

目的:研究紫杉醇对小鼠骨髓分化巨噬细胞的直接影响。方法:常规方法无菌制备BALB/c小鼠骨髓细胞,用含M-CSF的RPMI1640培养液培养7d,同时加入不同浓度紫杉醇,通过流式细胞术对骨髓单核细胞分化的巨噬细胞的表型分子、吞噬功能进行测定,采用迟发型过敏反应(DTH)方法检测巨噬细胞免疫原性。结果:紫杉醇明显降低骨髓单核细胞分化成巨噬细胞的数量;F4/80 巨噬细胞表面分子CD80、CD14表达升高,而I-Ad表达降低;紫杉醇提高分化的巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力;但使其免疫原性降低。结论:紫杉醇能使骨髓单核细胞分化的巨噬细胞细胞吞噬能力提高,但其免疫原性下降,提示紫杉醇可能具有调节巨噬细胞免疫功能的作用。     

直接和间接共培养条件下小鼠子宫自然杀伤细胞与树突状细胞相互作用的比较

背景：子宫自然杀伤细胞与树突状细胞可以相互作用,但相互间作用是否必须直接接触还存在不同的观点。 目的：对比直接和间接共培养条件下子宫自然杀伤细胞与树突状细胞之间的相互作用,明确两者相互作用的方式。 方法：将树突状细胞和子宫自然杀伤细胞进行直接接触共培养,设为直接共培养组;在2种细胞Transwell系统中进行共培养,设为间接共培养组。观察培养细胞的生长状况,酶联吸附法检测培养上清白细胞介素10,12、转化生长因子β细胞因子的浓度,流式细胞术检测各组细胞表面标志CD86的表达情况。 结果与结论：与单独培养树突状细胞和子宫自然杀伤细胞相比,直接和间接共培养组培养液上清中白细胞介素10,12、转化生长因子β浓度均增加(P < 0.05),尤以白细胞介素10浓度增加明显(P < 0.05),CD86的表达明显增高 (P < 0.05)。直接共培养组白细胞介素10,12和转化生长因子β浓度更高(P < 0.05),表达CD86的细胞含量更多 (P < 0.05)。证实子宫自然杀伤细胞可以促进树突状细胞成熟,而树突状细胞促进子宫自然杀伤细胞的分泌,两者通过细胞间的直接接触而相互作用。     

Flt-3 ligand, in combination with bovine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-4, promotes the growth of bovine bone marrow derived dendritic cells

Culture of bone marrow precursor cells with cytokines, including granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin-4 (IL-4) and the tyrosine kinase receptor binding proteins Flt-3 ligand (Flt-3L) and stem-cell factor (SCF), has previously been shown, in both mouse and human, to result in the generation of large numbers of dendritic cells. We extend these findings to bovine dendritic cells. Culture of bovine bone marrow cells with GM-CSF, IL-4 and either Flt-3L or SCF enhanced the generation of low buoyant-density dendritic cells. However, only the addition of Flt-3L to cells cultured with GM-CSF and IL-4 was shown to increase the number of dendritic cells and induce the differentiation of dendritic cells with potent capacity to stimulate allogeneic T cells and resting CD4+ memory T cells. The effective ability to stimulate T cells was associated with the expression of major histocompatibility complex (MHC) class II molecules and CD80/86 by dendritic cells. Bovine bone marrow derived dendritic cells appeared to be exclusively of myeloid origin because they expressed the myeloid-related antigens CD14, MyD-1 and CD11b.     

从G-CSF动员的外周血细胞悬液培养的成纤维细胞样细胞的特性分析

目的： 研究从G-CSF动员的外周血细胞（PBC）悬液培养的成纤维细胞样（F-L）细胞的特性。 方法： 取PBC中贴壁细胞分4组培养：①RPMI-1640组；②L-DMEM组；③粒细胞集落刺激因子（G-CSF）组；④白细胞介素-3（IL-3）组。流式细胞仪分析各组培养的F-L细胞特性。 结果： 培养2-3周后，4组均能收获到F-L细胞，细胞贴壁生长，但不融合，不能连续传代培养，③④组细胞数量明显多于①②组，4组F-L细胞表型相似：CD33+、CD11c+、CD64+、CD14+、CD45+、HLA-DR+、CD86+、CD34-、CD38-、CD3-、CD19-、CD56-、CD29-、CD44-、CD105-；与单核细胞（PB-M）表型差异仅CD38表达不同而与间质干细胞（MSC）或树突状细胞（DC）表型明显不同。 结论： 从PBC培养的F-L细胞为巨噬细胞，不是MSC或DC；G-CSF、IL-3能提高F-L细胞培养数量，不改变PB-M向巨噬细胞分化的分化方向。     

干扰素-α联合GM－CSF诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化

目的：研究干扰素-α（IFN-α）对慢性髓性白血病（CML）骨髓单个核细胞来源的树突状细胞（DCs）发育的影响。 方法： 12例初发慢性期CML患者的骨髓单个核细胞，分别与含如下细胞因子,RPMI-1640培养液共育：rhGM-CSF 1×106U/L联合rhIFN-α 2×106U/L（IFN-α组）、rhGM-CSF 1×10⁶U/L联合rhIL-4 5×10⁵U/L（IL-4组）、单用rhGM-CSF 1×10⁶U/L和单用rhIFN-α 2×106U/L，培养7 d；于第8-10 d，部分孔加入rhTNF-α 5×10⁴U/L。形态学（Wright染色、倒置显微镜）、免疫学（CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR）检测；磷脂酰丝氨酸（PS）转位检测 DCs凋亡情况；荧光原位杂交（FISH）对1例CML进行细胞遗传学分析；混合淋巴细胞反应（MLR）检测刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。 结果： CML骨髓单个核细胞经上述细胞因子诱导7 d后，IFN-α组和IL-4组均呈现树突状细胞的典型形态；免疫学鉴定，IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05），经5×104U/L rhTNF-α作用后，两组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR进一步上调，其中IFN-α组DCs CD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组（P<0.05）；经FISH证实来源于白血病细胞；两组DCs均具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，IFN-α组刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于IL-4组(P<0.05)。 结论： IFN-α可促进CML骨髓单个核细胞来源的树突状细胞的分化、活化。这可能是IFN-α在CML中的治疗机制之一。     

体外诱导人类B细胞分泌HLA抗体的实验研究

目的:探索体外诱导人类B细胞产生特异性HLA抗体的理想培养条件。方法:以EBV转化致敏肾移植患者B淋巴细胞系(BLCL)为模型,采用ELISA和ELISPOT方法,比较3种培养体系:(1)RPMI1640 抗OPTI单克隆抗体(mAb);(2)RPMI1640 0·1mmol/L非必需氨基酸液 1mmol/L丙酮酸钠 40mg/L转铁蛋白;(3)Hybridoma无血清培养液,以及3种培养条件:(1)对照组(仅培养液),(2)培养液 rIL-4 rIL-10 鼠抗人CD40(α-CD40),(3)培养液 rIL-4 rIL-10 重组人CD40配体(CD40L),人类B细胞产生免疫球蛋白(Ig)和特异性抗HLA抗体的能力。结果:BLCL细胞在Hybridoma SFM培养体系所产生的IgG和IgM浓度分别为25·2～28·1mg/L和7·14～7·95mg/L,高于其他两种培养条件(P<0·05)。BLCL细胞在添加了IL-4、IL-10和α-CD40或CD40L的杂交瘤无血清培养液中能产生特异性抗HLA-I抗体,所获得的斑点频数分别为3·06/每104个BLCL细胞和3·55/每104个BLCL细胞,高于对照组(1·77/每104个BLCL细胞)。结论:BLCL细胞在杂交瘤无血清培养液中和添加了IL-4、IL-10和α-CD40或CD40L的培养条件下,提高分泌IgG和IgM的能力和特异性抗HLA-I类分子的抗体。