联合靶向小干扰RNA对疱疹病毒2感染的体外抑制作用

目的 探讨联合靶向特异性小干扰RNA(siRNA)对疱疹病毒(HSV)2的体外特异抑制作用.方法 将体外合成的靶向HSV-2编码包膜糖蛋白gB的UL27.2基因、靶向DNA结合蛋白UL29.2基因的siRNA和该两种联合靶向特异性siRNA制剂,共转染Vero细胞并感染HSV-2,观察靶基因的表达情况、Vero细胞病变、空斑减数实验和子代病毒滴度并进行各组间比较:结果特异性UL27.2siRNA、UL29.2 siRNA和联合siRNA转染Vero细胞后,均能不同程度抑制各HSV-2临床株感染所导致的细胞病变,对病毒增殖抑制率分别为63.9%、86.7%和93.3%.实时定量PCR检测各组siRNA分别对UL27.2和UL29.2两个基因的表达,结果显示UL27.2 siRNA和UL29.2 siRNA对各自的靶向基因均有抑制,而联合靶向siRNA制剂对两个基因的抑制率最高.结论 联合靶向特异性siRNA制剂能有效抑制HSV-2的感染和复制.     

RNA沉寂及其抗病毒效应研究进展

RNA沉寂 (RNAsilencing)是一种新发现的、在RNA水平发挥作用的基因调控机制 ,以序列特异性方式降解病毒、转基因的RNA或内源性mRNA ,发生于真核生物 ,包括在植物细胞中描述的转录后基因沉寂、真菌中的压制现象和动物细胞中的RNA干扰。RNA沉寂发挥作用的一般机制是由dsRNA启动 ,经Dicer酶处理成2 1～ 2 5nt的小片段siRNA ,作为向导序列与核糖核酸酶构成RNA诱导的沉寂复合体 ,降解与dsRNA同源的RNA序列 ,防御外来核酸序列的入侵和调节细胞内基因的表达。作为一种古老的病毒防御机制 ,可通过沉寂同源的病毒基因或沉寂与病毒复制有关的宿主细胞基因 ,在病毒感染的不同时期抑制病毒的复制。RNA沉寂的应用非常广泛 ,在某种意义上 ,RNA沉寂将会产生一场新的生物学革命。     

CVB3-VP1 siRNA对CVB3复制的抑制作用

目的：观察柯萨奇B组病毒3型衣壳蛋白1（CVB3-VP1）特征性小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）对CVB3复制及VP1蛋白表达的抑制作用.方法：根据CVB3VP1基因的序列及其结构特征,设计并用化学方法合成小于扰RNA（siRNA）.以CVB3感染HeLa细胞,通过脂质体介导以siRNA转染HeLa细胞.48 h后,观察细胞病变的程度,用TCID5o法测定病毒滴度,免疫荧光法测定CVB3-VP1蛋白的表达,RT-PCR法检测CVB3-RNA的水平.结果：化学合成的4对针对CVB3-VP1的siRNA,发现其中有两对（VP1-1、VP1-2）对CVB3的复制具有明显的抑制作用,同时VP1蛋白的表达明显减少;细胞病变的程度也明显减轻.结论：CVB3-VP1siRNA可有效地抑制CVB3在HeLa细胞中的复制及表达VP1.     

靶向PV株核蛋白基因的小分子干扰RNA对不同狂犬病病毒毒株复制的交叉抑制作用

目的研究小分子干扰RNA（siRNA）对狂犬病病毒（RV）不同毒株复制的交叉抑制效果。方法采用体外转录和RNA酶Ⅲ消化长片段双链RNA的方法制备8条以RV的PV株核蛋白（N）基因为靶基因的21nt siRNA，用以转染已经感染了不同滴度PV、CTN或CVS株RV的BSR细胞，采用直接免疫荧光法观察转染的siRNA对已感染BSR细胞的不同毒株RV复制的抑制效果，并分析这种抑制效果与靶基因序列的相关性。结果不同21nt siRNA均对PV株的复制产生了较强的抑制作用：对CTN株和CVS株的交叉抑制作用观察结果表明，21nt siRNA与靶基因在碱基错配高达5个的情况下仍对病毒复制保持抑制效应。然而，siRNA与靶基因碱基错配的位置与抑制作用的丧失高度相关。3’端第2个碱基的错配将使抑制作用表失，随后的碱基错配对抑制作用的影响依次降低；中部碱基错配影响较小；而5’端碱基错配对抑制作用几乎没有影响。结论siRNA对靶基因的抑制作用的丧失与其同靶基因序列碱基错配的位置相关，3’端碱基错配可降低其抑制作用的特异性，产生偏靶效应的范围和概率可能增大，这为设计独特的siRNA序列提供了新的思路。     

RNA干扰技术及其应用

近来研究发现 ,真核细胞内某些双链RNA能高效、特异地结合、降解互补mRNA ,阻断特异基因的表达 ,介导高度序列特异性的基因沉默 ,导致细胞出现特定基因缺失的表型 ,此现象称为RNA干扰 (RNAinterference,RNAi) ,其中 2 1～ 2 5nt大小的短双链RNA称为siRNA(smallinterferingRNA) .siRNA与核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物 (RNA -inducedsilencingcomplex.RISC) .RISC通过碱基配对方式与靶mRNA结合 ,并在距离siRNA 3’端 12个碱基的位置切割、降解靶mRNA .RNAi具有高效性和序列特异性 ,已经成为功基因组研究的有力工具 ,并且有可能在某些疾病如肿瘤等的基因治疗中发挥重要作用 .     

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。     

Suppression of FLI-1 expression through lentivirus-based vectors mediated RNAi

目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)方法 对小鼠红白血病细胞(CBa)中FLI-1基因表达的抑制作用.方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA( siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达.结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/mL,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组(P＜0.001).结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达.     

RNA 干扰研究的新进展

RNA干扰技术(RNA interference, RNAi) 诞生5年来,无论在技术本身的改进上还是应用上都有了很大的发展,尤其是siRNA的产生和引入方法有了一系列的改进,使siRNA的长期稳定表达成为可能.RNAi的生殖细胞传递现象的发现,进一步拓宽了RNAi的应用潜力.然而,除了对靶基因的沉默效应外,引入的siRNA还可以导致siRNA序列特异性、而非靶基因特异性的基因沉默现象(off-target效应).这就提示,在注释特定siRNA产生的沉默效应时要特别注意,尤其是将siRNA用于疾病治疗时.     

RNA干扰技术及其应用

近来研究发现,真核细胞内某些双链RNA能高效、特异地结合、降解互补mRNA,阻断特异基因的表达,介导高度序列特异性的基因沉默,导致细胞出现特定基因缺失的表型,此现象称为RNA干扰(RNA interference, RNAi),其中21～25nt大小的短双链RNA称为siRNA(small interfering RNA).siRNA与核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex. RISC).RISC通过碱基配对方式与靶mRNA结合,并在距离siRNA 3'端12个碱基的位置切割、降解靶mRNA.RNAi具有高效性和序列特异性,已经成为功基因组研究的有力工具,并且有可能在某些疾病如肿瘤等的基因治疗中发挥重要作用.     

小干扰RNA的设计及原理

RNA干扰技术在人类基因功能研究、药物靶点鉴定等方面备受青睐,并且具有潜在的临床应用价值。但只有设计合理的小干扰RNA (siRNA)才能高效、特异地抑制靶基因表达。本文总结了siRNA序列的一般特点以及设计siRNA的方法和相应原理,并介绍了如何利用实验手段,验证RNA干扰的有效性及特异性。从而促进RNA干扰技术的广泛开展。     

小干扰RNA在心肌细胞中对柯萨奇病毒B3复制的抑制作用研究

目的 通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用,评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性.方法 体外制备BALB/c乳鼠心肌细胞,利用脂质体和电穿孔转染方法转染siRNA后感染病毒,流式细胞术、中性红染色和病毒致细胞病变作用(CPE)保护实验评价转染效率和细胞生长状态,空斑形成减少实验、RT-PCR等方法检测抑制病毒程度.结果 通过在HeLa细胞上的筛选,针对病毒不同区域的siRNA呈现出不同的抗病毒作用,靶序列位于2B区的siRNA-3753能显著抑制柯萨奇病毒B3(CVB3)感染.在原代培养的心肌细胞中,转染siRNA-3753后同样显示出很好的抗病毒效果,心肌的搏动、心肌细胞的生长状况保持着较好的状态.而病毒对照和非特异性siRNA-non感染24 h后,细胞停止搏动,逐步变圆,皱缩死亡.测定培养上清和细胞内的病毒滴度,电转siRNA-3753对病毒抑制率可以达到98.1%,脂质体转染siRNA-3753对病毒抑制率为78.2%.电穿孔转染效率可以达到56.03%,脂质体为9.0%.结论 针对CVB3基因组2B区的siRNA在保护心肌细胞抵抗CVB3病毒感染实验中具有抑制病毒复制作用.     

用慢病毒载体介导的RNAi感染CB3细胞后抑制FLI-1的表达

 【摘要】目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)方法对小鼠红白血病细胞（CB3）中FLI-1（Friend leukemia integration-1,FLI-1）基因表达的抑制作用,以为后续实验提供有力的技术支持。方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况。RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达。结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/ml,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组（P<0.001）。结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达,为后续实验提供稳定的感染细胞载体。     

siRNA活性与mRNA二级结构关系的研究

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA起作用,特殊设计的siRNA能使靶基因发生特异性沉默,确定基因功能或沉默致病基因从而治疗疾病。在RNAi技术的应用中,通常采用的是19bp长度,正、反义链3′端各有2个不配对核苷酸的双链RNA(siRNA)。而合成siRNA模板的选择,即靶mRNA作用位点的选择对RNAi的作用效果的影响相当大,原因之一是因单链的mRNA存在二级结构。本研究试图从具体的实验结果出发,研究靶mRNA二级结构对siRNA活性的影响。     

RNA干扰技术在生物医学领域中的应用

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默过程。在这一过程中,dsRNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA(siRNA),siRNA与相关的蛋白结合成RNA诱导沉默复合体,这一复合体可识别并降解mRNA,导致基因沉默。它是一种比反义寡聚核苷酸技术更为有效的方法,具有更高的特异性,在生物医学领域有广阔的应用前景。文章就RNAi技术在功能基因组学、基因治疗(如人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、肿瘤)、神经性疾病及其药物设计等领域的实验及其应用研究及存在问题作一综述。     

siRNA构建及转运方法研究进展

RNA干扰是一种由双链RNA引发的转录后基因沉默过程,目前已尝试将其应用于疾病治疗.但是在RNA干扰的应用研究中,最大的障碍是如何将小干扰RNA(siRNA)有效、安全地转运到靶组织和细胞.对近年来有关siRNA转运方式的研究进行综述,为寻求更好地转运方法提供可靠的依据.     

小干扰RNA与壳聚糖复合纳米粒制备及基因沉默性能研究

小干扰RNA引发的RNA干扰过程在沉默靶基因表达方面表现出高特异性和高效性,有望成为癌症和流感、肝炎等病毒感染疾病治疗的有效药物,但缺少安全高效的载体系统是其发挥强大功能的主要障碍。本研究以天然阳离子壳聚糖为载体材料,利用聚电解质静电作用,直接复合沉默绿色荧光蛋白的siRNA(siRNA-eGFP),制备出siRNA复合率83%~94%、尺寸90~180 nm、Zeta电位10~30 mV的稳定纳米粒,细胞活性保持率达80%,绿色荧光蛋白基因沉默效率近80%。     

SiRNA对丙型肝炎病毒5''非翻译区的干扰作用实验研究

目的研究多种siRNA对丙型肝炎病毒（HCV）5’非翻译区（5＇-UTR）的干扰作用。方法以绿色荧光蛋白基因（GFP）为报告基因，构建HCV5’UTR与GFP核酸序列连接的表达载体：pcDNA—HCV-5’UTR—GFP。设计针对HCV5’UTR区3段小干扰RNA（siRNA），siRNA与表达质pcDNA—HCV-5’UTR—GFP共转染HepG2细胞中，采用荧光显微镜观测细胞内荧光强度改变，并且用流式细胞术量化分析细胞荧光强度变化，评价多种siRNA对HCV基因表达的作用。结果成功构建含HCV5’UTR区的绿色荧光蛋白基因，siRNA能特异性地抑制绿色荧光蛋白基因的表达，siRNAA、siRNAB和siRNAC的抑制率分别为68．4％、72．6％、75．6％；siRNA＋siRNAB、siRNB＋siRNAC和siRNA＋siRNAc的抑制率分别为91．8％、87．2％、92．4％；siRNA＋siRNAB＋siRNAC的抑制率最高，为95．7％。结论多种siRNA对HCV5’UTR区具有干扰作用，组合使用效果更好。     

抗结缔组织生长因子特异性小干扰RNA的设计、合成及筛选

目的 设计和合成针对抗肝纤维化关键基因抗结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的特异性小干扰RNA(siRNA),并筛选高效的CTGF siRNA抗肝纤维化序列.方法 参照siRNA设计原则,应用RNA在线设计软件,设计3段RNA干扰候选序列,分别转染正常干细胞株(...     

RNAi抑制XJ-160病毒复制的研究

目的通过建立RNA干扰(RNA interference，RNAi)抑制XJ-160病毒复制的模型，在序列特异性、位置效应和量效关系等方面，探讨RNAi对XJ-160病毒复制的影响，为进一步研究RNAi的抗病毒作用和机制奠定基础。方法按照siRNA(short interferencing RNA)的设计要求合成XJ-160病毒特异siRNA，脂质体法转染BHK-21细胞后感染XJ-160病毒，通过测定病毒滴度、蛋白表达量及XJ-160病毒：RNA合成研究siRNA对XJ-160病毒复制的抑制。结果成功建立了RNAi抑制XJ-160病毒复制的模型，探讨了RNAi抑制该病毒复制作用的特点。结论外源导入的siRNA能够抑制XJ-160病毒的复制，并且这种抑制作用具有明显的序列特异性、位置效应和存在量效关系等特点；siRNA是通过降解病毒RNA实现抑制病毒复制作用的。