piggyBac转座子和Tol2转座子介导基因长期表达能力的比较

目的比较piggyBac（PB）转座子和Tol2转座子介导基因整合到细胞基因组中并实现长期表达的能力,探索将转座子作为一种研究基因长期表达的工具。方法采用荧光蛋白和分泌型碱性磷酸酶（secretedalkalinephosphatase,SEAP）作为报告基因,利用PB转座子和Tol2转座子在CHO细胞和HEK293T细胞中进行细胞转染实验,在传代前和传代后的不同时间点持续监测报告基因表达量的变化情况。结果与不加转座酶的对照组相比,瞬时转染CHO细胞和HEK293T细胞后,PB转座子和Tol2转座子能促进携带的荧光蛋白和SEAP报告基因的表达,并且能够长期表达,PB转座子介导报告基因长期表达的效果优于T012转座子。结论PB转座子介导基因长期表达的能力强于Tol2转座子,PB转座子更适于研究基因的长期表达。     

Superfect 高效介导PDX-1基因在骨髓间质干细胞表达

目的：构建含有胰腺十二指肠同源框1(PDX-1)基因的真核表达载体，并提高重组载体在骨髓间质干细胞(MSCs)的表达效率，为骨髓MSCs作为糖尿病基因治疗的靶细胞奠定基础。 方法：RT-PCR体外扩增PDX-1 基因，双酶切后整合入相同双酶切的真核表达载体构建重组载体，对重组载体进行酶切分析和序列测定进行鉴定；利用Percoll 细胞分离液体外培养大鼠骨髓MSCs，流式细胞仪检测细胞周期后，Superfect 介导正确重组的载体转染骨髓 MSCs，检测转染效率和细胞存活率从而对转染条件进行优化；G418筛选阳性细胞后，RT-PCR 和Western blotting 检测PDX-1 基因在骨髓 MSCs 中的表达。 结果：重组载体双酶切分析和序列测定证实重组载体构建成功。流式细胞仪显示 85.9%的MSCs处于G₀/G₁期，提示骨髓MSCs具有强大的分化潜能；荧光显微镜下成功转染的细胞呈现全细胞绿色荧光，Superfect 介导的转染效率和细胞存活率与其绝对用量和孵育细胞的时间有关；RT-PCR显示转染后PDX-1基因在骨髓 MSCs表达，随转染时间延长，表达逐渐增强，与Western blotting结果一致。结论：成功构建了含有PDX-1 基因的真核表达载体；Superfect 能高效介导外源性基因在骨髓MSCs 中表达；转染外源性基因的MSCs可望成为一种理想的基因治疗的载体细胞。     

视网膜弱细胞瘤基因治疗的实验研究

观察外源性Ｒｂ基因在视网膜母细胞瘤移植瘤内的表达情况及其对ＲＢ移植瘤生长的影响,为进行ＲＢ体内基因治疗提供实验依据。方法建立裸鼠眼玻璃体腔ＲＢ移植瘤模型,构建Ｒｂ基因的逆转录病毒表达载体,用脂质体将Ｒｂ基因导入裸鼠ＲＢ移植瘤,免疫组织化学染色及流式细胞仪间接免疫荧光法检测Ｒｂ基因表达,裸鼠ＲＢ移植瘤生长的活体观察,分级,组织病理形态观察,结果脂质体Ｄｏｓｐｅｒ介导的Ｒｂ基因转染可在ＲＢ移植内表达至     

视网膜母细胞瘤基因治疗的实验研究

目的观察外源性Ｒｂ基因在视网膜母细胞瘤（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ,ＲＢ）移植瘤内的表达情况,及其对ＲＢ移植瘤生长的影响,为进行ＲＢ体内基因治疗提供实验依据。方法建立裸鼠眼玻璃体腔ＲＢ移植瘤模型,构建Ｒｂ基因的逆转录病毒表达载体,用脂质体将Ｒｂ基因导入裸鼠ＲＢ移植瘤,免疫组织化学染色及流式细胞仪间接免疫荧光法检测Ｒｂ基因表达,裸鼠ＲＢ移植瘤生长的活体观察、分级、组织病理形态观察。结果脂质体Ｄｏｓｐｅｒ介导的Ｒｂ基因转染可在ＲＢ移植瘤内表达至少７天,并部分抑制ＲＢ移植瘤的生长,抑制效果与Ｒｂ蛋白表达量、治疗时机有关。结论外源性Ｒｂ基因可在ＲＢ移植瘤内表达并部分抑制ＲＢ移植瘤的生长。     

saRNA调控NIS基因介导131I对肝癌HepG2细胞体外抑制作用的实验研究

目的 探索通过小激活RNA(saRNA)调控钠碘转运体(NIS)基因特异性表达介导肝癌核素显像和治疗的可行性,为RNA激活(RNAa)技术介导核素基因治疗肿瘤的应用提供实验依据.方法 saRNA的设计合成:通过基因BLAST比对,设计与合成三条针对NIS基因的saRNA序列;细胞转染:以LipofectaminTM 2000为saRNA载体,将saRNA转染到肝癌HepG2细胞后72h,采用Western blotting分析NIS蛋白的表达水平,筛选出RNAa效率最高的saRNA,并进一步分析saRNA转染后不同时相NIS的表达水平,以及saRNA浓度-NIS表达水平的浓度-效应关系;体外核素摄取实验:体外培养条件下,评价转染肝癌HepG2细胞对125I的摄取;细胞生长增殖抑制实验:体外培养条件下,评价131 I对转染肝癌细胞的生长抑制率.结果 saRNA可上调NIS基因表达水平,其中saRNA482序列上调NIS表达水平最高;saRNA上调NIS的峰值出现在转染后72h,NIS维持高表达水平在10d以上;且NIS上调水平随saRNA浓度增高而增高.体外培养条件下,转染细胞与未转染细胞的摄碘水平差别明显,其中最高者摄碘较对照细胞高出64倍.体外培养条件下,相对未转染组肝癌细胞,131I对转染组HepG2细胞的生长抑制率为60.7％.结论 本研究设计合成的靶向NIS基因的saRNA可上调肝癌细胞NIS的表达水平,增强肝癌细胞摄取放射性碘的能力,研究还证实,通过RNAa调控NIS基因表达可介导131I治疗肝癌的潜力.     

siRNA干扰CD73表达抑制人乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质的黏附

 目的： 探讨CD73对乳腺癌细胞MB-MDA-231与细胞外基质黏附的影响及其机制。方法： ① 构建CD73 siRNA表达载体，脂质体介导转染MB-MDA-231细胞。② 流式细胞仪检测瞬时转染效率，G418筛选稳定转染克隆。③ 半定量RT-PCR和Western blotting检测转染细胞 CD73 mRNA及蛋白表达。④ 细胞黏附实验检测MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制后与细胞外基质黏附力的改变。结果： ① CD73 siRNA表达载体转染MB-MDA-231可有效抑制CD73 mRNA表达(抑制效率=91.0%), P<0.01。② CD73 siRNA表达载体转染 MB-MDA-231可有效抑制CD73蛋白表达(抑制效率=79.3%), P<0.01。③ 干扰MB-MDA-231细胞CD73表达可显著抑制细胞与细胞外基质的黏附（P<0.01）。结论： ① CD73siRNA表达载体可有效干扰MB-MDA-231细胞CD73基因表达。② MB-MDA-231细胞CD73基因表达抑制可显著降低细胞与细胞外基质的黏附。     

视网膜母细胞瘤基因对人骨肉瘤细胞株OS732的影响

目的 观察外源性N端截短的视网膜母细胞瘤（Rb)基因对骨肉瘤细胞株OS732的生长和细胞间缝隙连接信息通讯能力的影响。方法 构建N端截短的长度为1.65kb Rb基因的真核表达质粒,并用DOTAP将其导入骨肉瘤细胞株OS732。应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）和Northern blot检测Rb基因的表达;用细胞计数,流式细胞仪分析和软琼脂克隆形成试验观察OS732细胞的生成状况;用半定量RT－PCR法和罗氏黄荧光传输法检测细胞间缝隙连接信息通讯的能力。结果 转染N端截短的Rb基因后,OS732细胞内可检测到内源性和外源性Rb基因的mRNA表达。OS732细胞的形态发生改变,其生长速度减慢,软琼脂形成集落能力降低,细胞周期阻滞于G0－G1期;缝隙连接蛋白基因Gonnexin43的表达和细胞信息通讯能力增强。结论 N端截短的Rb基因可抑制骨肉瘤细胞株OS732的恶性生长表型以及增强细胞间信息通讯能力。     

逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人红白血病细胞中的表达

目的：探讨逆转录病毒载体介导人类G6PD基因在人白血病细胞中的表达。方法：构建G6PD cDNA的逆转录病毒表达载体pLG6PDSN,转染包装细胞PA317，病毒上清感染人红白血病细胞K562，以PCR方法检测病毒载体是否整合于细胞基因组，定量法测定G6PD表达。t检验比较转染组与对照组间的表达差异。结果：酶切鉴定表明，G6PD cDNA准确插入pLXSN相应位点，载体构建成功。转染后PCR扩增NeoR基因，证明细胞DNA整合有逆转录病毒载体。转染组与对照组酶活性测定差异有显著性（P＜0．01）。结论：本试验所构建的重组载体pLG6PDSN为严重G6PD缺陷症的基因治疗提供了表达载体。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

背景：基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。 目的：探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。 方法：从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞,采用构建的慢病毒载体(LV)将空载体(LV-eGFP)或骨形态发生蛋白2基因(LV-eGFP-BMP2)转染至内皮祖细胞,通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌,Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达,比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。 结果与结论：慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较,转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加(P < 0.01),迁移和增殖能力无明显改变(P > 0.05),肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低(P < 0.05)。结果表明慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞,转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白,增强对炎性损伤的抗凋亡能力,对迁移能力和增殖活性无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

外源性Rb基因对U937细胞泡沫化过程中载脂蛋白B的影响

目的：研究Rb基因在U937细胞泡沫化过程中对细胞内载脂蛋白B含量的影响，初步探讨Rb基因在泡沫细胞形成过程中的作用。 方法： 采用氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）孵育U937细胞，以及Ox-LDL孵育同时导入外源性Rb基因转染U937细胞，分别于处理0 h、12 h、24 h收集细胞，半定量RT-PCR与流式细胞术检测Rb mRNA和蛋白的表达，流式细胞术检测细胞内载脂蛋白B的含量。平行实验重复3次，进行统计学方差分析。 结果： 氧化型低密度脂蛋白孵育U937细胞泡沫化过程中，12 h、24 h Rb基因的表达显著低于对照组0 h（P<0.05）；细胞内载脂蛋白B含量则显著高于对照组0 h（P<0.05）。而U937细胞在导入外源性Rb基因后，12 h、24 h细胞内的Rb基因的表达显著高于对照组0 h（P<0.05）；细胞内载脂蛋白B含量则显著低于对照组0 h（P<0.05）。 结论： 外源性Rb基因的导入可以下调细胞内载脂蛋白B的含量，表明Rb基因可能与单核细胞源性泡沫细胞形成有关，可能是影响泡沫细胞形成的相关基因的敏感候选基因之一。     

人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞后的细胞增殖

背景：利用重组腺病毒载体转染外源性基因到组织工程骨的种子细胞是骨缺损基因治疗研究的热点。 目的：用人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体转染人骨髓基质干细胞,以探讨基因转染对人骨髓基质干细胞增殖的影响。 方法：将Ad-hBMP2-IRES-hFGF2转染至人骨髓基质干细胞中,荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR方法观察人骨形态发生蛋白2 cNDA和人成纤维细胞生长因子2 cNDA在人骨髓基质干细胞中的转录情况,Wester blot 方法检测人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2蛋白表达情况,锥虫蓝测定细胞活力,流式细胞仪分析其对细胞增殖的影响。 结果与结论：转染后人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达,细胞活力无明显变化,流式细胞仪分析细胞周期中增殖细胞比例明显增加。说明该双基因可高效转染人骨髓基质干细胞,且促进细胞增殖。     

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。     

Retinoblastoma protein prevents staurosporine-induced cell death in a retinoblastoma-defective human glioma cell line.

OBJECTIVE: To investigate the mechanism of staurosporine-induced glioma cell death and cell cycle arrest using adenovirus-mediated gene transfection, as well as the function of retinoblastoma (Rb) and genetic instability induced by staurosporine. METHODS: Cell cycle regulation, cell death and nuclear abnormalities induced by staurosporine were examined using an adenovirus vector expressing Rb, p16 or p21 genes in human glioma cell lines. RESULTS: The Rb-defective SF-539 cell line was resistant to staurosporine compared with cell lines expressing intact Rb. SF-539 glioma cells exposed to staurosporine became multinucleated and then died. Multinucleation was prevented in SF-539 cells transfected with the Rb gene, thus decreasing the death rate of these cells. CONCLUSIONS: These results imply that enforced Rb expression protects cells from genomic instability induced by staurosporine regardless of its upstream molecular effects.     

脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法

目的：提高脂质体介导的细胞转染效率.方法：在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测.结果：流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率（26%、24%和40%）高于传统法转染的细胞（16%、16%和18%）.改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%.在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短.结论：改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在最短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株.