小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的：探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。 方法： 采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mRNA水平，检测其oct-4基因表达，并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞，基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结果： 小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形，细胞核大，胞质少；细胞增殖能力尚可；细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-；有oct-4基因表达；诱导分化后，可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结论： 成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

犬骨髓内皮祖细胞生物学特性及诱导分化

目的:探讨犬骨髓内皮祖细胞(EPCs)随培养时间延长其生物学特性变化及向内皮细胞(ECs)分化能力。方法:免疫微珠分选方法纯化犬骨髓CD14 细胞,EGM-MV2条件培养基培养,于不同时间检测EPCs的生物学特性;将存活至8周的EPCs以分化培养基(M199 20%胎牛血清 VEGF)诱导培养,检测ECs表面标志的表达。结果:早期EPCs为分选后8代之前的EPC,体积略小,类圆形,60%融合时呈串珠样排列,表达CD133、CD14;晚期EPCs由表达VE-cadherin、KDR、CD14的早期EPCs分化而来,形态为多边形,分泌活动明显加强,表达CD133、VE-cadherin、CD14和KDR;诱导分化细胞呈鹅卵石样外观,表达Ⅷ因子、CD31。结论:犬骨髓EPCs随培养时间呈现不同生物学特性,早期EPCs不稳定,晚期EPCs显示出更稳定的生物学特性,能够分化为ECs,是血管组织工程学研究良好的种子细胞。     

骨髓基质细胞的体外培养和向成骨及软骨分化的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞（BMSC）的成骨及软骨分化功能。方法 采用细胞静置贴壁培养法，体外培养了兔和儿童的BMSC，用传至2－3代兔BMSC和Ⅱ型胶原联合治疗兔膝关节软骨缺损，采用成骨诱导培养法研究儿童BMSC的成骨效应。结果 （1）Ⅱ型胶原和bFGF对兔BMSC的贴壁和生长是有效的。（2）用兔BMSC和Ⅱ型胶原治疗12周后，能使兔膝关节软骨缺损获得恢复，其软骨细胞分化明显；（3）用成骨诱导培养法，可使儿童BMSC骨钙素分泌水平比常规对照组升高8－10倍，并可见有典型的成骨化的黑色矿化细胞区。结论 骨髓基质细胞具有成骨和软骨分化功能。     

骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化

背景：研究表明,在体外提供肝细胞及成纤维细胞生长因子等多种因子可诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化,但对其诱导的最佳环境还处于摸索阶段。 目的：观察体外应用肝细胞生长因子和成纤维生长因子4等多种因子联合诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化能力。 方法：采用全骨髓贴壁培养法分离、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,培养第3代时用肝细胞生长因子、成纤维生长因子4、胰岛素铁硒传递蛋白及地塞米松等联合诱导其向肝样细胞的分化。于诱导7,14,21 d后观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白的mRNA表达;于诱导14,21 d行PAS糖原染色检测,并采用免疫细胞荧光法检测细胞白蛋白表达。 结果与结论：随着诱导时间的延长,骨髓间充质干细胞表现为肝细胞样,并呈集落生长,肝细胞特异性标志物逐渐出现和成熟。细胞诱导至7 d出现甲胎蛋白mRNA表达,14 d表达增高,21 d时表达下降;14 d时细胞角蛋白18、白蛋白 mRNA和糖原出现表达,并随时间延长表达逐渐增加。细胞诱导14 d时,胞浆白蛋白出现表达,至21 d时表达增强。证实骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维生长因子4等多种因子诱导作用下,具有强大的向肝细胞分化能力。     

乙醇诱导小鼠导致骨髓多能干细胞成脂分化

实验证明乙醇可引起股骨头内脂肪积聚,导致骨坏死,其作用机制尚不清楚。本研究旨在观察乙醇对骨髓多能干细胞（D1细胞）的直接作用,进一步阐明乙醇性骨坏死的发病机制。     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。 目的：探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。 方法：分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养) 72 h,其后换用普通培养基继续培养4周。 结果与结论：初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT 、desmin、α-sarcomeric actin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

BACKGROUND:In the past, the culture and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro were mostly reported in the adult or animal rather than in children. OBJECTIVE:To explore the ability of bone marrow mesenchymal stem cells from children differentiating into neural stem cells and nerve cells. METHODS:Bone marrow mesenchymal stem cells from children were isolated and cultured, and passage 12 cells were cultured in the pre-induction medium (DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and 1 mmol/L β-mercapto ethanol) and induction medium (DMEM containing 2% dimethyl sulfoxide and 150 μmol/L butylated hydroxyanisole). Expression of nestin and β-tublin III was detected using immunocytochemistry method at 30 minutes and 7 days after induction, while RT-PCR was used to detect nestin mRNA expression at 0, 5.5, 6 days after induction. RESULTS AND CONCLUSION: After combined induction, the cells shrank from round shape to tapered, polygonal or oval shape, and cell processes extended gradually and became filament-like shape. Interconnected cells formed a network at 6 days after combined induction. The expression of nestin antigen was positive at 30 minutes after induction, while the expression of β-tublin was positive at 7 days. RT-PCR findings showed that positive expression of nestin mRNA was detected at 5.5 hours of induction, and then disappeared at 6 days. These findings show that the combined use of dimethyl sulfoxide and butylated hydroxyanisole can induce bone marrow mesenchymal stem cells from children to differentiate into neural stem cells and nerve cells in vitro.     

川芎嗪诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的用川芎嗪(ligustrazin hydrochloride)在体外定向诱导SD青年鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，rMSCs)分化为神经元样细胞。方法用低糖DMEM冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，接种在塑料培养瓶中。经体外扩增、纯化，选用第5代后的骨髓间质干细胞进行诱导分化。用10μg／LbFcF预诱导24h，更换成含川芎嗪的无血清培养基DMEM诱导间质干细胞分化为神经元样细胞。用免疫组织化学SABC法鉴定神经丝蛋白(NF—M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果第5代间质干细胞形态达到均一，呈梭形。用川芎嗪诱导15min到3h，间质干细胞胞体逐渐增大，并伸出细长突起形似神经元样细胞。免疫组织化学显示NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43表达阳性，而GFAP阴性。对照组上述染色均为阴性。结论川芎嗪可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

骨髓干／祖细胞的非血细胞分化

骨髓干 祖细胞除能重建受体的造血功能外 ,还可分化为肝细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、血管内上皮细胞、神经细胞等多种重要的机体功能细胞 ,是极佳的干 祖细胞工程靶细胞和基因治疗的载体细胞 ,具有极大的应用潜力     

成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞

目的通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞,体外定向诱导分化为血管内皮样细胞,探讨为组织工程血管的构建提供种子细胞的可能性。方法收集骨髓血,提取单个核细胞进行体外培养扩增,用含10μg/L VEGF培养液诱导细胞,利用免疫组织化学、流式细胞仪技术、电镜技术、放射免疫技术鉴定和观察细胞特性。结果分析了5个标本,每个标本体外扩增10代可获细胞数为8×1010个左右;诱导14 d后细胞VWF强阳性表达,接近汇合的细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态,透射电镜显示胞质内可见大量吞饮小泡,细胞接种在细胞外基质凝胶(ECM-gel)中可形成毛细血管样结构,细胞上清液中6-酮-前列素F1α含量为(29.939±19.935)μg/(109.L)。结论实验结果提示利用本实验方法,可以获得足够量较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞,间充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞。     

小鼠骨髓来源内皮祖细胞体外诱导培养及分化特征

目的: 研究小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)的体外培养方法及体外分化特征。方法: 采用梯度离心法分离小鼠骨髓单个核细胞并进行诱导培养,用流式细胞术和免疫细胞化学对细胞表型特征进行检测,分别采用MTT和Transwell方法对其增殖、迁移能力进行检测。结果: 体外培养4 d至14 d,CD133、SCA-1及CD117的表达率分别从11.05%、29.32%及16.45 %降至2.29%、7.82%及3.92%;而VEGFR-2、CD31、VE-cadherin、eNOS及vWF的表达率分别从12.21%、8.43%、18.27%、7.11%及32.61%增加至62.13%、32.96%、67.73%、27.89%及82.16%;吞噬acLDL和结合UEA-I的细胞从57.18%增加至86.70%。在0 μg/L至80 μg/L VEGF浓度梯度下,细胞增殖率和迁移率分别增加58.03%和33.83%。结论: EGM-2内皮培养基可稳定培养小鼠骨髓来源EPCs,培养过程中其干细胞标志物表达逐渐降低,而内皮细胞标志物表达及特性不断增加,VEGF可显著促进其增殖和迁移。     

三种不同年龄人骨髓间充质干细胞的生物学性状

目的：比较老年人、成人和胎儿骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学性状,为选择抗砷细胞的种子细胞提供实验依据。方法：取老年人、成人和胎儿骨髓MSCs,在α-MEM培养液中进行骨髓MSCs培养,测定生长曲线、细胞贴壁率及NaAsO2对骨髓MSCs的细胞毒作用。结果：老年人、成人和胎儿骨髓MSCs在细胞形态、生长特性等方面是相似的,胎儿骨髓MSCs的扩增潜能明显强于成人和老年人骨髓MSCs,对NaAsO2的耐受性也较成人和老年人骨髓MSCs高。结论：从老年人、成人及胎儿骨髓中可分离培养出骨髓MSCs,在体外保持有效扩增能力。胎儿骨髓MSCs较成人和老年人骨髓MSCs更原始,具有更大的体外扩增潜能,可做为抗砷细胞的种子细胞。     

致敏小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及多向分化功能的测定

目的：评价异基因脾细胞输注致敏的小鼠骨髓源性间充质干细胞(MSCs)的体外培养生长能力及其多向分化功能。方法：应用贴壁培养法体外培养间充质干细胞,流式检测其表面标志以及检测其成骨、成脂和成肌多向分化状况;结果：致敏小鼠骨髓源性MSCs与非致敏小鼠骨髓源性MSCs比较,形态学无差异且均表达CD29+、CD105+、CD44+和Sca-1+ ;CD34-、CD11b-;同时在相应的诱导条件下具有向成骨、成脂、成肌多向分化的能力。结论：异基因脾细胞输注致敏的小鼠,其骨髓源性MSCs的形态学和功能与正常小鼠的MSCs比较评估未见异常。     

An electromagnetic compressive force by cell exciter stimulates chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

In this study, we present a biological micro-electromechanical system and its application to the chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs). Actuated by an electromagnetic force, the micro cell exciter was designed to deliver a cyclic compressive load (CCL) with various magnitudes. Two major parts in the system are an actuator and a cartridge-type chamber. The former has a permanent magnet and coil, and the latter is equipped with 7 sample dishes and 7 metal caps. Mixed with a 2.4% alginate solution, the alginate/MSC layers were positioned in the sample dishes; the caps contained chondrogenic defined medium without transforming growth factor-beta (TGF-beta). Once powered, the actuator coil-derived electromagnetic force pulled the metal caps down, compressing the samples. The cyclic load was given at 1-Hz frequency for 10 min twice a day. Samples in the dishes without a cap served as a control. The samples were analyzed at 3, 5, and 7 days after stimulation for cell viability, biochemical assays, histologic features, immunohistochemistry, and gene expression of the chondrogenic markers. Applied to the alginate/MSC layer, the CCL system enhanced the synthesis of cartilage-specific matrix proteins and the chondrogenic markers, such as aggrecan, type II collagen, and Sox9. We found that the micromechanically exerted CCL by the cell exciter was very effective in enhancing the chondrogenic differentiation of MSCs, even without using exogenous TGF-beta.     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞体外培养分化及鉴定

目的：探索大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞（EPCs）的培养、诱导分化及鉴定方法。方法：冲洗大鼠骨髓腔,梯度密度离心法获得单个核细胞,内皮细胞培养液EGM-2MV培养,通过细胞形态,免疫组化和免疫荧光检测CD34、VEGFR-2、vWF,CD133,摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,超微结构及染色体核型分析进行鉴定。结果：新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,大小不一;48h后部分细胞开始贴壁,呈梭形、纺锤形或不规则形;4～8d呈细胞集落或线状排列;9～11d接近融合,呈典型鹅卵石样外观。贴壁细胞CD34、CD31、VEGFR-2、vWF、CD133均表达阳性并呈动态变化,能够摄取Dil-ac-LDL和结合FITC-Lectin-UEA-1,透射电镜见特征性Weible-Palade小体,能稳定保持二倍体核型。结论：本实验初步建立了一套大鼠骨髓血管内皮祖细胞分离、培养、诱导分化及鉴定方法体系。     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景：实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达。 目的：通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响。 方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组。分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察。 结果与结论：空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色。诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P< 0.05)。提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用。虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距。     

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景：自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。 目的：观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。 结果与结论：分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P < 0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。