神经干细胞移植治疗视网膜缺血再灌注损伤的研究进展

视网膜缺血再灌注损伤尚无理想的治疗手段。神经干细胞是具有自我更新、多向分化潜能的细胞群,能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着干细胞研究技术的不断发展,通过体外培养神经干细胞,移植整合入视网膜各层并定向诱导分化为目的细胞,有望重建视网膜功能。     

PGRN在室管膜下区神经干细胞及其细胞分化中的表达

目的探讨颗粒蛋白前体(PGRN)在室管膜下区(SVZ)神经干细胞及分化细胞中的表达和意义。方法体外原代培养新生大鼠SVZ神经干细胞,免疫荧光细胞化学法检测PGRN在神经干细胞及其分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达。结果成功培养新生大鼠SVZ神经干细胞,神经干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。神经干细胞及其分化的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞均表达PGRN。结论 SVZ神经干细胞及分化细胞均表达,提示PGRN可能参与神经干细胞的分化过程。     

大鼠脑的神经干细胞的体外培养、增殖和分化

采用无血清培养基分离和培养大鼠脑的神经干细胞,并通过免疫荧光细胞化学技术进行细胞自我更新能力、巢蛋白表达和多向分化潜能的鉴定。鉴定结果表明,所分离培养的细胞为大鼠神经干细胞,具有神经干细胞的特征,并可在体外大量增殖和较长期培养,可经诱导分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞,是进行诱导分化的良好细胞模型。本文讨论了神经干细胞传代培养中应予以注意的问题和对策。     

脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化

目的：从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化。方法：利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞；采用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记新生细胞，免疫细胞化学单标或双标染色技术，检测神经上皮干细胞蛋白（nestin）和分化后特异性神经细胞抗原的表达；用纹状体组织提取液，诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化。结果：从胚胎大鼠脊髓神经管 中分离的细胞可以连续传代，表达nestin，它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；与对照组3％相比，纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12％分化成为多巴胺能神经元。结论：分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能（multipotent)，是增殖能力很强的神经干细胞；这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元，提示其可以为神经移植提供材料。     

大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞分化特性比较

体外分离大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞,经培养传代后,撤除生长因子(bFGF和EGF)并给予 1%胎牛血清促其自然分化,然后比较两者的分化规律,以及传代次数对分化的影响。结果发现:在完全相同的培养条件下,来源于脑和脊髓的神经干细胞均可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,但两者分化为神经元的能力均随细胞体外传代次数的增加而显著下降 (P<0. 05);此外,脑来源的神经干细胞分化为神经元的能力远高于脊髓来源的神经干细胞 (P<0. 01)。提示,来自中枢神经系统不同部位的神经干细胞在分化潜力上存在差别,体外传代会影响神经干细胞的分化能力。     

胎儿海马神经干细胞的体外培养及神经元前体细胞的纯化

目的　从人胎儿海马分离培养具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞 ,并从中纯化神经元前体细胞。　方法　利用无血清培养从胚胎 4个月的胎儿海马区分离细胞 ,并在体外连续传代培养 ;采用免疫荧光细胞化学技术检测神经上皮干细胞蛋白 (nestin)的表达、经BrdU孵育后的BrdU表达 ;比较两种诱导分化方法所获得的神经元和胶质细胞的比例差异 ;利用单细胞克隆技术纯化神经元前体细胞。　结果　分离的细胞具有连续克隆能力 ,在体外培养了 16个月 ,传了 4 3代 ;细胞冻存、复苏后仍保持干细胞特性 ;培养的细胞呈Nestin阳性 ,在BrdU孵育后呈BrdU阳性 ,诱导分化后的细胞能够表达Tubulin、NeuN或GFAP ;利用无血清诱导所得到的分化细胞中神经元的比例约占 80 % ,而血清诱导的分化细胞中胶质细胞的比例则大于 90 %。利用单细胞克隆技术可从神经球中纯化的细胞表达Nestin ,并且全部分化成神经元。　结论　从胎儿海马区分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能 ,属于神经干细胞 ,从中可纯化出神经元前体细胞     

胚胎大鼠脊髓神经干细胞的培养及鉴定

为了探讨胚胎大鼠脊髓神经管神经干细胞体外培养、鉴定的方法,本实验在解剖显微镜下机械性分离11.5 d的胚胎大鼠脊髓神经管,并制备细胞悬液,无血清培养基培养。应用免疫荧光染色方法对原代和传代细胞进行巢蛋白(nestin)鉴定;加入胎牛血清诱导其分化后分别行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)鉴定。结果显示:11.5 d胚胎大鼠脊髓神经管来源的神经干细胞经连续传代培养可形成较多克隆球,呈nestin免疫阳性;加入胎牛血清可诱导其分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。本实验结果提示,利用E11.5的胚胎大鼠脊髓神经管可成功培养出大量稳定增殖并有多向分化潜能的神经干细胞,可用于进一步的研究。     

质粒重编程诱导多潜能干细胞及定向分化神经干细胞

目的 　探讨游离质粒载体重编程诱导小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)为非整合型诱导多潜能干细胞,并在体外定向分化为神经干细胞(neural stem cells, NSCs), 为神经干细胞移植治疗神经损伤提供稳定、安全的细胞来源。 方法　使用电转仪将质粒pEP4-EO2S-ET2K转入小鼠MEFs, 经诱导培养重编程为诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs), iPSCs在不同诱导培养基中经2次悬浮及贴壁培养分化为NSCs,在体内及体外实验鉴定iPSCs多向分化潜能特性及NSCs特性。 结果　体内外实验显示iPSCs具有与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)相似的多向分化潜能, 且不整合外源性基因。iPSCs进一步分化的NSCs其相关标志基因表达与野生型NSCs相近,且较iPSCs显著增加,免疫荧光显示NSCs高表达NSC标志物 NESTIN及PAX6,在体外存活能分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞。 结论　游离质粒能重编程诱导非整合型iPSCs, 并定向分化为神经干细胞及神经元, 是神经损伤修复的理想种子细胞。     

Jagged1蛋白抑制神经干细胞向神经元分化的实验

目的：研究Jagged1蛋白对神经干细胞分化的影响。方法：分离小鼠胚胎脑神经干细胞,用Jagged1蛋白、Jagged1蛋白 γ泌肽酶体外诱导神经干细胞分化,观察分化后神经元所占的比例。结果：分离的细胞能持续增殖,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;在Jagged1蛋白的影响下,分化后神经元数量明显减少;γ泌肽酶抑制剂能阻断Jagged1蛋白的诱导作用。结论：培养的细胞为神经干细胞,并表达Notch受体;Jagged1蛋白能抑制干细胞向神经元分化,这种分化作用是通过Notch受体实现的。     

海人酸对神经干细胞增殖及分化的影响

背景：神经干细胞对脑组织的修复作用非常有限,约80%新增殖的内源性神经干细胞在6周内死亡,仅0.2%的细胞继续增殖、分化,参与修复。 目的：分析不同剂量海人酸在对神经干细胞增殖及分化的影响。 方法：体外分离并培养新生Wistar大鼠神经干细胞,将神经干细胞分为空白对照组和加入不同浓度梯度的海人酸组,通过免疫组化法和免疫荧光法进行鉴定,MTT比色法测定海人酸对神经干细胞分化的影响,计算分化后神经元和星形胶质细胞比例。 结果与结论：海人酸组贴壁的神经球分化速度较空白对照组快,在同一时间点进行观察,神经细胞的迁移距离较未处理组远。分化5 d后,海人酸组所分化的细胞中,星状细胞较空白对照组多,而神经元样细胞相对较少,培养的细胞具有自我更新和向神经元﹑少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能。兴奋性氨基酸海人酸可使部分神经干细胞死亡,但可促进幸存的神经干细胞增殖及分化,并诱导其向星形胶质细胞分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

新生鼠基底前脑神经干细胞的分离和培养

目的　探讨基底前脑神经干细胞的增殖及多向分化潜能。方法　利用无血清培养技术 ,加表皮生长因子 (EGF)和碱性成纤维生长因子 (FGF 2 )刺激生长 ,在体外进行神经干细胞的克隆培养和血清诱导分化 ;采用免疫组化研究神经干细胞的增殖特性及多向分化潜能 ,并用 5 溴 2 脱氧尿苷 (BrdU)标记证实其增殖能力。结果　从新生鼠基底前脑成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续增殖能力 ,可以传代培养 ,表达神经上皮干细胞蛋白抗原 ,可以分化成神经元和胶质细胞 ;BrdU标记结果阳性。结论　新生鼠基底前脑存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞     

Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells

Neurons and glia are important targets of human embryonic stem cell research promising a renewable source of these differentiated cells for biomedical research and regenerative medicine. Neurons and glia are derived, in vivo from the neuroepithelium of the neural tube. Concomitant to development along the anterior to posterior axis, gradients of morphogens across the dorsal and ventral axis of the neural tube establish positional codes that generate distinct progenitor domains and ultimately specify subtype identity. The neural rosette is the developmental signature of neuroprogenitors in cultures of differentiating embryonic stem cells; rosettes are radial arrangements of columnar cells that express many of the proteins expressed in neuroepithelial cells in the neural tube. In addition to similar morphology, neuroprogenitors within neural rosettes differentiate into the main classes of progeny of neuroepithelial cells in vivo: neurons, oligodendrocytes, and astrocytes. Despite these similarities, important differences exist and the extent to which neural rosettes can model neurogenesis in vivo is not yet clear. Here, the authors review the recent studies on the development and differentiation of neural rosettes from human embryonic stem cells. The authors focus on efforts to generate motor neurons and oligodendrocytes in vitro as representative of the challenges to obtaining the progeny of a single progenitor domain with in vitro methods. Opportunities for further progress are discussed.     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

新生大鼠海马源性神经干细胞的分离培养及其向胆碱能神经元定向诱导分化研究(英文)

本研究目的是从新生SD大鼠海马分离、培养神经干细胞并诱导其向胆碱能神经元方向分化。利用含b FGF(20ng/ml)和B27的无血清DMEM/F12培养基培养新生SD大鼠海马分离的具有自我更新和多向分化能力的细胞群,用免疫细胞化学技术检测巢蛋白(nestin),并于分化后分别检查特异性成熟神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞的标记抗原β微管蛋白(Tuj1 )、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(Galc)的表达;用鸡胚骨骼肌提取液,诱导神经干细胞向胆碱能神经元方向分化。结果显示:从海马分离的细胞群具有自我更新能力,表达nestin,分化成熟后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;与对照组3. 9%相比,鸡胚骨骼肌提取液可以诱导这些细胞中的9. 6%分化成为胆碱能神经元。提示分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;在加有鸡胚骨骼肌提取液的培养基诱导下,能向胆碱能神经元方向分化。     

Astrocyte-derived factors instruct differentiation of embryonic stem cells into neurons

Pluripotent embryonic stem (ES) cells may differentiate into neurons in vitro. This is valuable in the study of neurogenesis and in the generation of donor cells for neuronal transplantation. Here we show that astrocyte-derived factors instruct mouse and primate ES cells to differentiate into neurons. Cultured in astrocyte-conditioned medium (ACM) under free-floating conditions, within 4 days, colonies of undifferentiated mouse ES cells give rise to floating spheres of concentric stratiform structure with a periphery of neural stem cells, which are termed Neural Stem Spheres. Culturing the spheres on an adhesive substrate in ACM promotes neurogenesis, and cells in the spheres differentiate into neurons within 5 days, including dopaminergic neurons. In contrast, neither astrocytes nor oligodendrocytes are formed. The procedure developed for mouse ES cells can be applied to monkey ES cells. This neurogenesis pathway provides a new insight into mechanisms of specification of cell fates in early development and also provides a simple procedure for fast and efficient generation of a vast number of neural stem cells and neurons.     

bFGF和EGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

目的：观察碱性成纤维生长因子（bFGF）和表皮生长因子（EGF）对体外培养胚胎神经管神经干细胞生长和分化的影响。方法：从孕12天大鼠胚胎神经管分离神经干细胞，进行原代培养，分为bFGF组、EGF组、bFGF＋EGF组及对照组：培养过程中观察干细胞的生长，培养2小时做nestin染色鉴定神经干细胞，培养第5天用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶（NSE）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。结果：取材细胞大部分为nestin免疫阳性细胞；各实验组均可促进培养细胞的生长和分 化。免疫组化中，EGF使神经干细胞增殖成团，增加GFAP的表达（P＜0．01）；bFGF能明显增加NSE及GFAP的表达（P＜0．01）；两种因子联合应用，神经元和神经胶质细胞均比对照组增多（P＜0．01）。结论：EGF和bFGF两类生长因子均能促进胚胎神经干细胞的生长，在分化方面，EGF倾向于诱导干细胞增并向着胶质细胞分化，bFGF则诱导干细胞分 成更多的神经元。