SD大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损的实验研究

目的:探讨大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损的可行性。方法:采用第5代(P5)SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),经Hoeschst 33344(sigma)荧光杂料标记后,调配制成的1×106个／ml细胞浓度后与骨基质明胶(BMG)共同培养6 h,然后植入SD大鼠双侧胫骨的实验性骨缺损中(A组),同时作胫骨骨缺损单纯BMG植入(B组),无植入物(C组)两组对照。术后8周处死,取骨缺损区组织进行组织学观察,其中A组行荧光染料标记测定以确认骨缺损区的骨痂是否来源于MSCS。结果:①A组:胫骨骨缺损区可见大量新生不规则骨纤维组织、软骨及纤维骨痂填充,可见骨细胞、骨组织和骨小梁,已形成骨髓腔。②B组:胫骨骨缺损区可见大量纤维组织、少量新生不规则骨纤维组织及骨骼肌组织,伴有多核巨细胞和少量炎性细胞,缺损区边缘带有骨痂组织。③C组:胫骨骨缺损区可见大量纤维组织及骨骼肌组织填充生长,伴有多核巨细胞和少量炎性细胞,缺损区边缘带有少量骨痂组织。荧光染色鉴定确认胫骨骨缺损区的骨痂来源于MSCs。结论:大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损具有安全性、可行性及有效性。     

骨髓基质干细胞与骨基质明胶复合培养体内异位成骨的实验研究

目的：探讨骨髓基质干细胞(MSC)与骨基质明胶复合培养体内异位成骨的可行性。方法：将SD大鼠来源的MSC与同种异体的骨基质明胶复合培养后植入SD大鼠背部竖脊肌肌膜内，分别于术后不同的时间点处死大鼠，标本进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定及组织形态学观察：结果：实验组标本自术后第3周ALP活性起就表现出阳性，第4周MSC与骨基质明胶复合体内大量成骨。结论：MSC与骨基质明胶复合培养体内异位成骨完全可行的。     

不同接种密度骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨缺损

背景:在构建种子细胞与载体材料的复合体时,种子细胞的接种密度是影响复合体成骨能力的一个重要因素,目前关于种子细胞的接种密度认识尚不统一。目的:构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,观察构建复合体骨髓间充质干细胞的最适接种密度。方法:体外单层培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以不同的细胞密度将骨髓间充质干细胞接种到异种骨基质明胶上,构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体,通过扫描电子显微镜观察细胞在骨基质明胶中的黏附生长情况。制备SD大鼠双侧桡骨骨干5mm节段性骨缺损模型。随机分成4组,采用骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复骨缺损,所用的接种细胞密度分别为1×108L-1、5×108L-1、1×109L-1、5×109L-1。各组于第2,4,8,12周取材,通过大体观察大鼠的术肢活动情况,X射线放射学、组织学,免疫组织化学等检测方法,对骨缺损的修复情况进行评价。结果与结论:4种细胞密度与骨基质明胶复合培养24h,骨髓间充质干细胞在骨基质明胶上的黏附率随着细胞接种密度的增高而增高,当密度为1×109L-1时,黏附率最高为(76.00±2.94)%,继续增加细胞密度其黏附率反呈下降趋势。复合培养7d,扫描电子显微镜观察结果显示,材料上均有细胞黏附生长。X射线放射学评分显示,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P0.01);第4,8,12周1×109L-1组与5×109L-1组差异无显著性意义(P0.05),均高于其余两组(P0.01)。组织学评分结果表明,同一组别8,12周评分均高于2周评分(P0.01)。结果提示,在构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体时,骨髓间充质干细胞接种密度维持在1×109L-1最佳。     

骨基质明胶复合自体外周血干细胞修复骨缺损的安全性评价

背景：动物实验证实骨基质明胶移植后免疫排斥反应小,可在早期促进软骨及骨形成。 目的：观察骨基质明胶吸附自体外周血干细胞修复骨缺损的可行性。 方法：将节段性骨缺损病例患者按照自愿原则分2组治疗,一组将自体外周血干细胞/骨基质明胶充分嵌合于骨断端,另一组仅将骨基质明胶嵌合于骨断端,并行牢固内外固定。术后拍摄骨缺损部位正、侧位X射线片。 结果与结论：自体外周血干细胞/骨基质明胶组骨折端可见大量新生不规则骨纤维组织、软骨及纤维骨痂填充,可见骨细胞、骨组织和骨小梁,已形成骨髓腔。骨基质明胶组骨折端可见大量纤维组织、少量新生不规则骨纤维组织及骨骼肌组织,伴有多核巨细胞和少量炎性细胞,缺损区边缘带有骨痂组织。自体外周血干细胞/骨基质明胶组术后愈合时间较骨基质明胶组缩短(P < 0.05);治疗期间患者未见明显不良反应。说明自体外周血干细胞/骨基质明胶具有良好的生物相容性和可吸收性,在骨缺损愈合过程中起骨引导和骨诱导作用,效果优于单纯骨基质明胶移植。     

振动应力刺激骨髓间充质干细胞修复兔骨缺损

背景：研究证实,力学因素可调控、诱导骨髓间充质干细胞定向分化为骨细胞,提高分化效率。 目的：观察振动应力刺激对兔骨缺损微环境中骨髓间充质干细胞移植修复肱骨骨缺损成骨分化能力的影响。 方法：24只兔按随机数字表法分为非振动单纯骨基质明胶组、非振动骨基质明胶+骨髓间充质干细胞复合植入组、振动骨基质明胶+骨髓间充质干细胞复合植入组,每组8只,建立兔肱骨骨缺损模型。振动组兔置于振动平台,以0.3 G的加速度,25 Hz,正弦波型,1次/d,30 min/次,持续4周施加振动刺激。 结果与结论：造模4周后,大体观察结果显示,振动组骨痂生长良好,组织学切片显示其新生骨量较多,可见大量成骨细胞,骨缺损与断端形成骨性连接;振动组Ⅰ型胶原蛋白、RUNX2 mRNA表达水平明显高于非振动组。提示振动应力刺激可促进骨缺损微环境中骨髓间充质干细胞的成骨分化能力,提高Ⅰ型胶原蛋白、RUNX2 mRNA表达水平,从而加速骨缺损修复的进程。     

骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨内生长以及成骨潜能

背景：纳米晶胶原基骨修复材料是根据仿生原理制备的纳米骨框架材料,其微结构和成分两方面都与天然骨有相似性 ,具有良好的生物相容性。 目的：研究兔骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养的结合程度,以及构建组织工程骨的可行性。 方法：分离兔骨髓间充质干细胞,体外培养、纯化,取第3代骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨修复材料体外复合培养,第3,7,20天后激光共聚焦和扫描电镜观察二者复合程度。 结果与结论：骨髓间充质干细胞和纳米晶胶原基骨修复材料复合良好,共聚焦显微镜和环境扫描电镜观察均可见细胞生长;纳米晶胶原基骨修复材料能够作为良好的支架,它能使骨髓间充质干细胞在其内稳定生长。提示骨髓间充质干细胞在纳米晶胶原基骨修复材料内能很好的生长,并且具有成骨潜能。     

骨形成骨白质成骨基质明胶复合修复骨缺损实验研究

根据诱导成骨理论，由动物群骨提取无排斥反应、诱导成骨作用强的骨形成蛋白质，与骨基质明胶复合修复２６只家兔桡骨缺损。通过Ｘ线和组织学方法检查结果表明，术后第４周，植骨区的纤维性骨痂中有成骨细胞形成；第８周，植骨区大片新骨形成；１２周植骨区基本为新生骨填充；１６周骨缺损修复过程基本完成。     

脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养关节腔内的成软骨活性

背景：将骨髓间充质干细胞附着到支架材料上再植入关节软骨缺损处,细胞不但不消失,而且可形成新的软骨。 目的：观察同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养在关节内的成软骨活性。 方法：在54只青紫蓝兔单侧膝关节制作关节软骨全层缺损模型,随机分组：实验组在缺损处植入自体骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物,对照组缺损处仅植入同种异体脱钙骨基质,空白对照组未植入任何物质。 结果与结论：植入后12周,实验组缺损处修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固;修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好,且实验组组织学评分优于对照组和空白对照组 (P < 0.01)。对照组缺损处修复组织呈纤维样,与周围软骨未结合,空白对照组缺损区无修复组织,两组均无Ⅱ型胶原染色阳性表达。表明同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养后植入膝关节可形成软骨样组织,有效修复关节软骨缺损。     

异种脱钙骨基质联合骨髓间充质干细胞植入豚鼠鼓泡腔增强成骨作用*

背景：目前在矫形外科和颅面重建中已有脱钙骨基质和骨髓间充质干细胞的相关应用,但用于乳突腔填塞尚缺乏研究。 目的：探寻异种脱钙骨基质和骨髓间充质干细胞联合植入乳突腔的成骨效能。 方法：全骨髓贴壁培养法分离近交系雌性豚鼠骨髓间充质干细胞,牛股骨头松质骨制备牛髂骨脱钙骨基质。20只豚鼠随机数字表法分为脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞联合植入鼓泡腔的实验组和取自体髂骨植入鼓泡腔的对照组。 结果与结论：植入1个月后两组的成骨量差异无显著性意义;植入后2个月实验组成骨量多于对照组,差异有显著性意义    (P < 0.05)。说明异种脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞联合植入乳突腔能有效促进乳突填塞后骨的形成。     

体外构建组织工程骨-软骨复合组织

背景：设计一体化、具有过渡结构的双层支架材料,复合软骨细胞、骨髓间充质细胞,有利于新生的骨与软骨组织之间形成良好界面。 目的：模仿自然骨-软骨基质构建复合支架,以软骨细胞和骨髓间充质干细胞为种子细胞,体外观察复合组织的成软骨及成骨能力。 方法：制备明胶-硫酸软骨素-透明质酸及明胶-陶瓷化骨多孔复合支架,构建自然骨-软骨基质复合支架,复合兔软骨细胞与骨髓间充质干细胞,分未成骨诱导与成骨诱导两组培养,并进行MTT、糖胺多糖含量、碱性磷酸酶活性检测,以及苏木精-伊红染色检测。 结果与结论：未成骨诱导与成骨诱导两组骨髓间充质干细胞增殖及糖胺多糖含量差异无显著性意义。未成骨诱导组碱性磷酸酶活性缓慢上升,成骨诱导组诱导后碱性磷酸酶活性迅速上升,14 d时达到稳定状态。两组苏木精-伊红染色结果无明显区别,均已形成含有双层组织的类似骨-软骨样组织,其间可见未降解支架形态,但由于基质形成不完善及支架未完全降解,此种结构不成熟,细胞分布不均匀,支架内部可见散在无细胞区域。证实采用两种细胞与双层结构的支架经体外分层复合能够形成组织工程骨软骨复合组织。     

Osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells on the collagen/silk fibroin bi-template-induced biomimetic bone substitutes

Biomimetic bone substitutes of collagen-silk fibroin/hydroxyapatite (COL-SF/HA) were synthesized via a bi-template-induced coassembly strategy. Collagen-hydroxyapatite (COL-HA) and silk fibroin-hydroxyapatite (SF-HA) served as controls were prepared with similar method. The osteogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) seeded onto the resulting materials was evaluated both in vitro and in vivo. The results suggested that the bi-template-induced biomimetic substitutes were able to support the growth and proliferation of BMSCs. We further demonstrated that BMSCs were stimulated to differentiate into the osteoblast cell lineage by evaluating several specific osteogenic markers including staining of alkaline phosphate (ALP) and calcium nodular and expression of osteogenic genes of osteocalcin (OCN) and osteonectin (ONN). The rat femoral defect model was used to assess the aforementioned biomimetic bone substitutes combined with BMSCs in vivo. Histological analysis indicated that the bi-template material exhibited good biocompatibility and strong ability of the new bone formation in comparison with the control of single-template material in vivo. ? 2012 Wiley Periodicals, Inc. J Biomed Mater Res Part A: 100A:2929-2938, 2012.     

聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架复合骨髓间充质干细胞修复兔骨缺损**△

背景：骨髓间充质干细胞具有向多种间质细胞谱系分化的能力,且支架材料的性能对骨缺损的修复有重要影响。 目的：观察聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架复合骨髓间充质干细胞治疗骨缺损。 方法：对骨缺损模型兔分别采用空白植入、髂后上棘自体松质骨移植、聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架移植和复合了骨髓间充质干细胞的聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架移植修复缺损部位。 结果与结论：至移植12周,移植复合了骨髓间充质干细胞的聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架的实验兔的缺损处有骨组织生成,支架材料降解,已完成缺损修复,其修复情况接近松质骨组;髂后上棘自体松质骨移植的实验兔的缺损修复完好,新形成的骨组织较规则;只植入聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维多孔支架的实验兔有少量骨组织形成,材料部分降解;空白植入的实验兔缺损处无新生骨组织生成,主要由纤维结缔组织填充。说明新型的生物支架材料聚左旋乳酸/壳聚糖纳米纤维三维多孔支架与来源于新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞复合培养后,植入同种异体兔股骨髁缺损处,使骨缺损的修复速度加快,表现为较好的体内诱导成骨的作用。     

自体红骨髓构建非细胞型组织工程化骨修复骨缺损**

背景：细胞型组织工程化骨修复骨缺损的效果良好,但存在操作复杂,容易污染及花费时间长等不足,不利于临床应用。 目的：观察自体红骨髓构建的非细胞型组织工程化骨修复大段骨缺损的成骨效果。 方法：在27只家兔一侧桡骨制作2 cm大段骨缺损模型后,随机分3组,分别植入自体红骨髓+重组人胰岛素样生长因子1/珊瑚羟基磷灰石非细胞型组织工程化骨、自体红骨髓/珊瑚羟基磷灰石复合人工骨材料、珊瑚羟基磷灰石/重组人胰岛素样生长因子1复合人工骨材料。 结果与结论：植入后4,8,12周,从植入物内部血管化程度、骨小梁数量、成熟骨结构形成及植入物的降解分析比较,自体红骨髓+重组人胰岛素样生长因子1/珊瑚羟基磷灰石非细胞型组织工程化骨组成骨能力及材料降解明显优于其他两组  (P < 0.05)。表明自体红骨髓构建的非细胞型组织工程化骨具有较高的成骨活性,修复大段骨缺损有显著效果。关键词：自体红骨髓;组织工程骨;重组人胰岛素样生长因子1;珊瑚羟基磷灰石;骨缺损;骨移植;扫描电镜 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.21.005     

纤维蛋白胶复合重组人骨形态发生蛋白2微球对犬骨髓基质细胞增殖与分化的影响

背景：前期实验证实聚乳酸-聚乙醇酸微球/纤维蛋白胶能作为重组人骨形态发生蛋白2的良好可注射性缓释载体。 目的：观察可注射性骨形态发生蛋白缓释体系对犬骨髓基质细胞增殖与分化的影响。 方法：采用复乳-溶剂挥发法制备重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物载药微球,然后将微球与纤维蛋白胶复合制备出重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/纤维蛋白胶复合材料,采用细胞培养及组织化学等方法观察微球对犬骨髓基质细胞的增殖与分化的影响。 结果与结论：重组人骨形态发生蛋白2/聚乳酸-聚乙醇酸共聚物/纤维蛋白胶微球对骨髓基质细胞的增殖无明显影响,但对细胞的分化功能有明显的促进作用。说明纤维蛋白胶复合重组人骨形态发生蛋白2微球能够提高骨髓基质细胞的体外成骨能力,可作为骨形态发生蛋白的良好载体。     

Bone tissue engineering using bone marrow stromal cells and an injectable sodium alginate/gelatin scaffold

To investigate the potential application of bone marrow stromal cells (BMSCs) and an injectable sodium alginate/gelatin scaffold for bone tissue engineering (BTE). The phenotype of osteogenic BMSCs was examined by mineralized nodules formation and type I collagen expression. Cell proliferation was evaluated by MTT assay. The biocompatibility of scaffold and osteogenic cells were examined by hematoxylin and eosin (H&E) staining. Ectopic bone formation as well as closure of rabbit calvarial critical-sized defects following scaffold-cell implantation were analyzed by histological examination and computed tomography (CT) scanning. Spindle-shaped osteogenic cells of high purity were derived from BMSCs. The osteogenic cells and sodium alginate/gelatin (2:3) scaffold presented fine biocompatibility following cross-linking with 0.6% of CaCl(2). After implantation, the scaffold-cell construct promoted both ectopic bone formation and bone healing in the rabbit calvarial critical-sized defect model. Our data demonstrated that the sodium alginate/gelatin scaffold could be a suitable biomaterial for bone engineering, and the scaffold-osteogenic cells construct is a promising alternative approach for the bone healing process.     

骨髓间充质干细胞与仿生纳米壳聚糖-胶原复合物修复大鼠胫骨缺损的实验研究

目的： 4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞离体培养后与仿生纳米壳聚糖-胶原（nano chitosan-sodium collagen, nano-CS-COL）形成复合支架，植入SD大鼠胫骨缺损处, 比较修复节段性胫骨缺损的效果, 初步探讨治疗骨缺损的组织工程学方法。方法: 4周龄SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 离体培养、纯化、鉴定、扩增后在等同于细胞培养的条件下与nano-CS-COL复合培养, 制成MSCs/nano-CS-COL复合物并经电镜扫描证实复合物有细胞生长。制成同种异体SD大鼠胫骨干5mm节段性动物模型, MSCs/nano-CS-COL复合物通过手术移植入动物模型胫骨缺损处, 通过大体观察、X线放射学、组织学对比实验组与对照组、空白组骨缺损修复情况。结果: 术后6、12周实验组与实验对照组放射学检查评价新骨生成有显著差异(P<0.05) 。术后组织学检查新骨生成速度、生成量均有显著差异。实验组标本与正常组基本一致。空白对照组不能自行修复骨缺损, 最后缺损由纤维组织充填。结论: BMSCs是骨组织工程中适宜的种子细胞。Nano-CS-COL复合支架能够与SD大鼠骨髓间充质干细胞体外复合培养, 移植入异体SD大鼠后未见明显免疫排斥反应, 是可以选择的细胞载体。MSCs/nano-CS-COL复合物植入修复鼠胫骨缺损能够加速新骨形成, 修复效果明显优于单纯CS植入组。     

Ectopic bone regeneration by human bone marrow mononucleated cells, undifferentiated and osteogenically differentiated bone marrow mesenchymal stem cells in beta-tricalcium phosphate scaffolds

Tissue engineering approaches using the combination of porous ceramics and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a promising bone substitute for repairing large bone defects. Nevertheless, optimal conditions for constructing tissue-engineered bone have yet to be determined. It remains unclear if transplantation of predifferentiated BMSCs is superior to undifferentiated BMSCs or freshly isolated bone marrow mononucleated cells (BMNCs) in terms of new bone formation in vivo. The aim of this study was to investigate the effect of in vitro osteogenic differentiation (β-glycerophosphate, dexamethasone, and l-ascorbic acid) of human BMSCs on the capability to form tissue-engineered bone in unloaded conditions after subcutaneous implantation in nude mice. After isolation from human bone marrow aspirates, BMNCs were divided into three parts: one part was seeded onto porous beta-tricalcium phosphate ceramics immediately and transplanted in a heterotopic nude mice model; two parts were expanded in vitro to passage 2 before cell seeding and in vivo transplantation, either under osteogenic conditions or not. Animals were sacrificed for micro-CT and histological evaluation at 4, 8, 12, 16, and 20 weeks postimplantation. The results showed that BMSCs differentiated into osteo-progenitor cells after induction, as evidenced by the altered cell morphology and elevated alkaline phosphatase activity and calcium deposition, but their clonogenicity, proliferating rate, and seeding efficacy were not significantly affected by osteogenic differentiation, compared with undifferentiated cells. Extensive new bone formed in the pores of all the scaffolds seeded with predifferentiated BMSCs at 4 weeks after implantation, and maintained for 20 weeks. On the contrary, scaffolds containing undifferentiated BMSCs revealed limited bone formation only in 1 out of 6 cases at 8 weeks, and maintained for 4 weeks. For scaffolds with BMNCs, woven bone was observed sporadically only in one case at 8 weeks. Overall, this study suggests that ectopic osteogenesis of cell/scaffold composites is more dependent on the in vitro expansion condition, and osteo-differentiated BMSCs hold the highest potential concerning in vivo bone regeneration.     

丝素蛋白复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨修复节段性骨缺损的实验研究

目的 探讨丝素蛋白材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化骨组织修复兔桡骨的节段性骨缺损的可行性.方法 分离培养兔骨髓间充质干细胞,与丝素蛋白膜材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况.将24只新西兰大白兔制成桡骨中段1.5cm长的骨缺损模型,随机分为3组:实验组(植入细胞材料复合物)、对照组(单纯植入丝素蛋白材料)、空白组(不植入修复材料).术后2,4,8,12周分别行大体观察、组织学观察和X线观察,比较3组骨缺损修复的情况.结果 骨髓间充质干细胞在丝素蛋白膜材料上生长情况良好.术后2,4,8,12周放射学检查新骨生成以及组织学检查新骨生成情况,实验组均优于对照组,空白组各时点均无新骨形成.结论 丝素蛋白材料与骨髓间充质干细胞体外复合培养构建的组织工程化骨能够修复兔桡骨缺损,可以作为组织工程骨的支架材料的全新来源. Abstract： Objective To investigate the possibility of adopting the silk fibroin biomaterial as the scaf-fold for bone marrow mesechymal stem cells(BMSCs) in the repair of rabbit radial defects. Methods BMSCs were isolated and co-cultured with the silk fibroin biomaterial in vitro. The growth condition of these cells on the scaffold was observed under electronic microscope. Bone defect models were made by removing 15 mm length of midshaft radial bone in 24 New Zealand rabbits. Animals were randomly devided into the experimental group in which the BMSCs seeded silk fibroin scaffold were transplanted, control group in which simple silk fibroin bioma-terial scaffold was adopted and blank group in which rabbits were left untreated. The repair of the defects was observed at 2, 4, 8, 12 weeks after operation, respectively. Results The rabbits BMSCs grew well on the material and the animals treated with grafts exhibited new bone formation. Result from experimental group was apparently superior to that of the control group at 2, 4, 8, 12 we