创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇

羽扇豆醇、桦木酸等羽扇豆型三萜化合物具有抗HIV、抗肿瘤等多种生物学活性,其中羽扇豆醇为这类化合物的基本前体。为了实现羽扇豆烷型三萜的异源发酵法生产,研究首先运用高通量同源重组法在酿酒酵母中进行萜类甲羟戊酸(MVA)途径的一步法调控,以提高三萜通用前体鲨烯的供给;在进一步工作中,拟南芥来源的羽扇豆醇合成酶基因(At LUP)被整入三萜底盘菌株中实现羽扇豆醇酵母人工细胞工厂的创建。结果表明该实验能一次完成MVA途径的7个基因的整合,组装总长度达到20kb,同时多倍化MVA途径能显著提高鲨烯产量约500倍,达到354.00 mg·L~(-1);At LUP基因在染色体上整合后获得的工程菌NK2-LUP在摇瓶中发酵能生产8.23 mg·L~(-1)羽扇豆醇。该研究可为在酵母中实施大规模生物合成途径组装提供技术支持,同时为进一步获高产羽扇豆烷型三萜的人工酵母细胞提供了重要基础。     

西洋参茎叶总皂苷制取人参皂苷Rh2的应用研究

西洋参原产于北美加拿大和美国东部,现国产西洋参已种植成功.卫生部已认定国产西洋参与西洋参通用.西洋参的药理作用与人参相似,但比人参作用缓和.     

RP-HPLC同时测定西洋参总皂苷转化产物中人参皂苷Rh1、Rg3和Rh2的含量

目的:采用高效液相色谱法同时测定两洋参总皂苷转化产物中人参皂苷Rh1、Rg3、Rh2含量.方法:采用welchromC18柱,(4.6 mm×250 mm,5μm),乙腈-水梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长:203 nm,柱温:30℃.结果:该方法测得人参皂苷Rh1、Rg3、Rh2分别在63.89-574.98μg/mL,78.50～706.51μg/mL,63.79～574.11μg/mL内,线性关系良好,r分别为0.999 4,0.999 9,0.999 9,且人参皂苷Rh1、Rg3、Rh2(n=6)平均回收率分别为101.70%(RSD=2.0%),98.70%(RSD=1.20%),97.57%(RSD=1.61%).结论:本法能将人参皂苷Rh1、Rg3、Rh2很好的分离,检测快速,结果准确可靠,重现性好.     

西洋参茎叶总皂苷制取人参皂苷Rh2的应用研究

西洋参原产于北美加拿大和美国东部，现国产西洋参已种植成功。卫生部已认定国产西洋参与西洋参通用。西洋参的药理作用与人参相似，但比人参作用缓和。人参皂苷-Rh2，具有诱导癌细胞分化逆转作用，对多种癌细胞的增殖具有直接抑制作用。但人参和西洋参中抗癌活性较强的单体皂苷含量甚少，1983年，日本学者     

人参皂苷Rh2 及其衍生物的研究进展

人参皂苷Rh2是红参中特征性成分之一,也是一种生物活性较高的稀有皂苷.近年来,人参皂苷Rh2的制备研究由酸水解法、碱水解法、合成法逐渐转到生物转化法,微生物及酶转化法以其独特优势成为制备人参皂苷Rh2的理想方法;人参皂苷Rh2及其衍生物的生物活性、药代动力学等也均有较多研究.本文对人参皂苷Rh2及其衍生物的制备、药理活性等方面进行综述,为该化合物深入研究开发提供参考.     

人参皂苷Rb1、Rg3、Rh2 抗肿瘤作用与机制概况

人参皂苷是中药人参抗肿瘤作用的主要成分,临床药理研究表明：人参皂苷Rb1 可以通过抑制P-gp 外排药物,增强细胞对药物的敏感性,降低肿瘤细胞多药耐药性,拮抗免疫功能的抑制和维持机体对肿瘤细胞的免疫功能;Rg3 则主要通过影响肿瘤细胞蛋白质表达、作用于细胞分裂来诱导肿瘤细胞凋亡,并能抑制肿瘤新血管生长;Rh2 通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡、控制肿瘤细胞转移来起到抗肿瘤作用,本文通过对人参皂苷Rb1、Rg3、Rh2 抗肿瘤作用及机制的阐述,为其临床应用开发提供理论依据。     

人参皂苷Rh1的药理作用研究进展

人参皂苷Rh1为四环三萜达玛烷型皂苷,微量存在于人参、三七、西洋参等植物中,近年来的药理学研究表明,其在抗肿瘤、免疫调节等方面具有很好的生理活性。综述人参皂苷Rh1的药理作用,以期对人参皂苷Rh1的进一步开发研究提供参考。     

023人参皂苷Rh2的抗过敏活性

从红参中分离出Rg3，经人肠道菌转化，分离得到主要代谢物人参皂苷Rh2，研究其抗过敏活性。     

人参皂苷Rh2对人食管癌Eca-109细胞TFPI-2表达的影响

目的探讨人参皂苷Rh2对人食管癌Eca-109细胞组织因子途径抑制物2(TFPI-2)表达的影响。方法按人参皂苷Rh2不同浓度设置3个实验组(10,40,80 mg/L)和1个对照组,分别采用RT-PCR法检测细胞TFPI-2 mRNA表达水平、Western blot法检测TFPI-2蛋白表达水平以及Transwell小室法检测细胞的侵袭能力等。结果 10,40,80 mg/L人参皂苷Rh2均可抑制人食管癌细胞Eca-109的侵袭力并能上调TFPI-2 mRNA及蛋白的表达,且40,80 mg/L与对照组比较有显著性差异(P均<0.05)。结论人参皂苷Rh2具有上调人食管癌Eca-109细胞TFPI-2基因表达和抑制其侵袭力的作用。     

人参皂苷Rh2通过GATA-1诱导K562细胞红系分化作用的研究

目的 了解人参皂苷Rh2是否通过GATA-1蛋白诱导白血病细胞株K562的分化作用.方法 利用凝胶集落生成实验检测不同浓度人参皂苷Rh2对白血病细胞株K562的增殖抑制作用;采用免疫细胞化学法和Western-blot法检测不同浓度人参皂苷Rh2处理前后K562细胞株中GATA-1蛋白表达情况.结果 凝胶集落生成实验结果显示人参皂苷Rh2对K562细胞有明显的增殖抑制作用,且呈剂量依赖性;免疫细胞化学法和Western-blot法提示人参皂苷Rh2可诱导K562细胞内GATA-1表达,且呈剂量依赖性.结论 人参皂苷Rh2可显著抑制白血病细胞株K562的生长,其作用呈浓度依赖性;人参皂苷Rh2在体外可通过上调GATA-1蛋白表达诱导K562向红系细胞方向分化.     

构建酿酒酵母细胞工厂生产番茄红素

为构建高效生产番茄红素的酿酒酵母细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母中引入番茄红素生物合成途径基因Crt B和Crt I,获得能生产0.17 mg·L-1番茄红素的初始工程菌ZD-L-000。在此基础上,在工程菌ZD-L-000中分别过表达MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因t HMG1、萜类合成调控的转录因子编码基因upc2.1、二萜生物合成的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶与法呢基焦磷酸合酶编码基因BTS1-ERG20,以及来自嗜酸热硫化叶菌的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶编码基因Sa GGPS,考察这些基因过表达对番茄红素合成的影响,结果发现过表达upc2.1基因未能提高番茄红素的产量,但过表达t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS基因均能显著提高番茄红素的产量,分别为初始菌株的2.0,16.9和20.5倍。在进一步研究中,t HMG1、BTS1-EGR20和Sa GGPS等有效基因被一同整合入工程菌ZD-L-000,获得的高产菌株ZD-L-201中番茄红素的产量提高77.0倍,达到13.23 mg·L-1;在高密度-两相发酵体系中工程菌ZD-L-201的番茄红素产量能进一步提高到135.21 mg·L-1(提高10.2倍)。本研究获得的工程菌为微生物发酵法生产番茄红素提供了基础。     

创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产广藿香醇

广藿香醇是存在于中药广藿香挥发油中的一种重要倍半萜类化合物,被认为是广藿香油药理功效和香味的主要贡献成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。目前,全球广藿香醇及其混合精油需求量大,传统植提法存在浪费土地,污染环境等诸多问题,因而亟需一种新的方法高效、低成本的生产广藿香醇。为了拓宽广藿香醇的生产方式,实现在酿酒酵母中异源生产广藿香醇,该研究首先将来源于广藿香Pogostemon cablin的广藿香醇合酶(PS)基因进行密码子优化后置于诱导型强启动子GAL1下,转入萜类底盘菌YTT-T5,成功获得可发酵生产(4.0±0.3)mg·L^-1广藿香醇的工程菌PS00。为了提高转化率,采用了蛋白质融合手段将丹参来源的SmFPS基因与PS基因进行融合,广藿香醇摇瓶产量提高25倍,达(100.9±7.4)mg·L^-1。在此基础上,进一步优化融合基因的拷贝数,广藿香醇的产量提升了90%,达到(191.1±32.7)mg·L^-1。最终通过发酵工艺优化,该菌在精确发酵体系中广藿香醇产量能达到2.1 g·L^-1,...     

人参皂苷Rh2对小鼠移植瘤生长及对细胞间连接黏附分子表达的影响

目的：观察人参皂苷Rh2对小鼠移植瘤生长及其对细胞间连接黏附分子（JAM）在癌组织表达的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法：昆明种小鼠40只，前肢皮下接种S180小鼠癌性腹水0．2mL，成瘤后随机分为2组，实验组给予人参皂苷Rh2（20mg&#183;kg^-1）灌服，2mL／只；对照组给予等量生理盐水，6周后取材。用免疫组化法观察JAM-1，JAM-2在癌细胞、淋巴管及血管的表达。结果：对照组JAM-1阳性表达的肿瘤细胞吸光度（A）549．90，实验组340．55，P〈0．05；JAM-2阳性表达弱。对照组JAM-1和JAM-2阳性表达的血管数密度分别为2．33和1．34，实验组分别为1．09和0．9。对照组JAM-1和JAM-2阳性表达的淋巴管数密度分别为2．23和1．88，实验组分别为0．99和0．79；两组间的差异均为P〈0．05。结论：人参皂苷Rh2通过下调JAM在肿瘤细胞的表达，抑制肿瘤组织血管及淋巴管的生成，进而抑制肿瘤生长。     

齐墩果酸酵母细胞工厂的合成途径与发酵工艺优化

目的：通过遗传改造和发酵工艺优化等方法进一步提高齐墩果酸酿酒酵母细胞工厂的生产能力。方法：利用多片段基因同源重组法,增加齐墩果酸酿酒酵母工程菌BY-OA中甘草β-香树脂合酶（GgbAS）,蒺藜苜蓿齐墩果酸合成酶（MtOAS）和拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1（AtCPR1）等基因的拷贝数;并通过优化YPD发酵液中初糖浓度的方式提高齐墩果酸的产量。结果：增加工程菌BY-OA中GgbAS,MtOAS和AtCPR1基因的拷贝数能显著提高工程菌中目标产物的产量,获得的工程菌BY-2OA在初始葡萄糖浓度为20 g·L^-1的YPD培养基中发酵7 d后β-香树脂和齐墩果酸分别达到136.5 mg·L^-1（提高54%）和92.5 mg·L^-1（提高30%）,当初糖浓度提高到40 g·L^-1时,齐墩果酸产量能达到165.7 mg·L^-1。结论：新获得的工程菌BY-2OA生产齐墩果酸的能力显著提高,为发酵法生产齐墩果酸奠定了基础。     

基于转录组测序分析人参皂苷Rh2抗宫颈癌的潜在作用机制

目的 研究人参皂苷Rh2抗宫颈癌潜在作用机制。方法 采用CCK-8法检测人参皂苷Rh2处理后的细胞活力。采用转录组测序技术检测对照组及人参皂苷Rh2处理组样本生物学重复的有效性、筛选差异表达基因、探寻人参皂苷Rh2抗宫颈癌相关的靶基因和信号通路。qPCR验证转录组数据可靠性。采用分光光度法检测Caspase 1/4酶活性。通过TUNEL染色检测人参皂苷Rh2诱导宫颈癌细胞死亡的形式。结果 人参皂苷Rh2的IC₅₀值为45μmol/L。各组测序样本生物学重复相似度高。GO和KEGG分析结果揭示人参皂苷Rh2主要参与免疫系统进程、细胞增殖、转录调节活性等功能以及细胞焦亡相关NOD样受体信号通路。qPCR验证显示细胞焦亡相关差异表达基因的表达趋势与转录组数据一致。人参皂苷Rh2干预后HeLa细胞的Caspase 1/4酶活性增加,细胞焦亡水平明显升高。结论 人参皂苷Rh2可能通过激活NOD样受体信号通路中的GSDMD、Caspase 1、Caspase 4、NLRP3、IL-1β基因表达诱导细胞焦亡发挥抗宫颈癌作用。     

酶解制备人参皂苷Rg2、Rh1、F1

常规化学方法如化学合成法、温和酸水解法、碱裂解法，应用于人参次要皂苷成分和皂苷代谢物的制备，不可避免地会产生异构、水解、羟基化等副反应。曾报道由人参主要皂苷成分G-Re和G-Rg1，通过青霉属(Penicillium)获得的乳糖酶粗制剂高产率制备次要皂苷成分G-Rh1(产率超过90％)。本次首次从     

人参皂苷Rh2对食管癌细胞Eca-109细胞周期的影响

目的:探讨人参皂苷Rh2(ginenoside-Rh2,GS-Rh2)对人食管癌细胞Eca-109生长抑制及细胞周期的影响.方法:应用MTT法测定GS-Rh2对细胞的生长抑制作用,HE染色后光镜观察细胞形态变化,应用免疫细胞化学和Western blot检测细胞周期调控因子cyclinE,CDK2(cyclin-dependent kinase 2),p21WAF1基因蛋白表达,采用半定量RT-PCR检测基因mRNA表达.结果:GS-Rh2对Eca-109细胞生长有抑制作用,并呈剂量、时间依赖性.20μg·mL-1GS-Rh2作用1 d后细胞达到半数抑制,作用3 d的Eca-109细胞较对照细胞数目明显减少,细胞形态向正常细胞方向逆转.细胞周期分析显示,随着GS-Rh2药物剂量的增加,G0/G1期细胞数逐渐增加,S和G2/M期细胞数逐渐减少,10μg·mL-1和20μg·mL-1 GS-Rh2处理组和对照组比较有显著性差异.20μg·mL-1SS-Rh2处理细胞后,随着作用时间延长,cyclinE和CDK2蛋白及其mRNA表达水平逐渐增高,而p21WAF1蛋白及其mRNA表达水平逐渐降低.结论:GS-Rh2可以将人食管癌细胞Eca-109阻滞于G0/G1期,诱导肿瘤细胞分化,并且通过影响细胞周期调控因子cy-clinE,CDK2,p21WAF1基因的表达抑制食管癌细胞的增殖.     

HPLC法测定西洋参茎叶总皂苷降解物中20（S）-人参皂苷Rh2的含量

20(S)-人参皂苷Rh2对多种癌细胞具有较强的抑制作用,且能使癌细胞在其增殖过程中产生一种诱导作用,诱导癌细胞逆转为正常细胞.但20(S)-人参皂苷Rh2在自然界存在甚少,红参中仅为十万分之一.为了获得大量20(S)-人参皂苷Rh2,一般采用总皂苷提纯,制备二醇组皂苷,再进行降解制备20(S)-人参皂苷Rh2.本文采用HPLC法测定西洋参降解物中20(S)-人参皂苷Rh2的含量,取得满意结果.     

人参皂苷Rg3及其代谢产物在大鼠体内组织分布研究

目的:建立人参皂苷Rg3和其代谢产物人参皂苷Rh2在大鼠各组织中的含量测定方法,探讨它们在大鼠各组织中的分布情况。方法:采用交叉给药设计,应用高效液相色谱法测定Wistar大鼠单次单剂量灌胃人参皂苷Rg3(50 mg/kg)后的各组织中人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2的浓度,从而计算出其在大鼠各组织中分布情况。结果:灌胃给予人参皂苷Rg3后,人参皂苷Rg3在大鼠各脏器中均能检出人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2,但是除了肝脏外,人参皂苷Rh2在各组织中的含量明显低于人参皂苷Rg3。结论:人参皂苷Rg3口服灌胃后,人参皂苷Rg3和人参皂苷Rh2均分布于大鼠各组织中,而肝脏和胃是人参皂苷Rg3主要代谢器官。