重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响

目的 探讨重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated serotype 9,rAAV9)载体对小鼠心脏的转染效果及对心功能的影响.方法 16只昆明种小鼠经尾静脉将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-eGFP)转染入小鼠,于7、14、21、28 d留取标本,使用荧光显微镜观察eGFP在心肌、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达,Western blot法检测eGFP)的蛋白表达.另20只昆明种小鼠随机分为2组,每组10只,分别经尾静脉注射rAAV9-eGFP)和生理盐水,28 d后行心脏超声及血流动力学检查.结果 rAAV9-eGFP经尾静脉注射21 d时eGFP表达在心脏达到高峰,转染效率可达32%,在其他脏器表达量少或无表达.rAAV9-eGFP组较生理盐水组心功能差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9可通过外周静脉注射在心脏较高表达,且对心功能无不良影响.     

9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响

目的:研究含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的9型重组腺相关病毒(rAAV9)对大鼠心肌H9C2细胞的转染及对细胞生长的影响。方法:rAAV9-EGFP按转染复数(MOI)1×105、1×106、1×107转染H9C2细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察H9C2细胞中EGFP阳性表达情况,采用流式细胞仪检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染效率。观察转染后细胞生长形态,并用AlamarBlue法检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖影响。结果:转染后第1天,MOI=1×106、1×107组中EGFP开始表达;第2天,MOI=1×105组开始表达,各组EGFP表达强度随MOI值的增高而增强,同时EGFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强;转染后第4天达到高峰,此时流式细胞术检测rAAV9-EGFP对H9C2细胞的转染率分别为MOI=1×105组:(14.1±0.2)%、MOI=1×106组:(35.1±4.8)%、MOI=1×107组:(56.8±0.1)%。rAAV9-EGFP转染H9C2细胞后,细胞生长及形态正常,AlamarBlue法进一步检测表明转染组对H9C2细胞增殖无影响。结论:rAAV9-EGFP能够有效地转染H9C2细胞,且rAAV9-EGFP对H9C2细胞增殖无明显抑制。     

9型腺相关病毒转染乳鼠心肌细胞的可行性及安全性**☆

背景：9型腺相关病毒对心肌细胞具有更好的靶向转染,是目前研究基因治疗心脏疾病的理想载体。 目的：探索9型腺相关病毒体外转染乳鼠心肌细胞的可行性及对乳鼠心肌细胞的毒性评估。 方法：分离培养原代乳鼠心肌细胞,以携带荧光蛋白基因的9型腺相关病毒为载体,将分离纯化的乳鼠心肌细胞分为正常培养组、无病毒转染组、病毒转染组。 结果与结论：第1周细胞搏动频率及百分率正常培养组和病毒转染组与无病毒转染组比较,差异无显著性意义(P > 0.05),但正常培养组高于病毒转染组(P < 0.05);3周后各组比较,差异无显著性意义(P > 0.05)。经9型腺相关病毒转染的心肌细胞24 h开始有表达,4~6 d荧光最强,3组细胞72 h内不同时间点还原比率均接近于1.0。说明9型腺相关病毒能成功有效地转染乳鼠心肌细胞,对乳鼠心肌细胞无明显毒性作用。     

低氧启动腺相关病毒载体的构建及高感染滴度质粒辅助重组腺相关病毒的获取

目的构建低氧启动重组腺相关病毒载体 ,优化重组AAV的条件 ,获取高感染滴度低氧启动重组腺相关病毒 ,为基因治疗缺血性脑血管病提供高效的特异性表达目的基因的载体。方法AAVHelperfree系统购自stratagene ,HEK293细胞购自中国协和医科大学细胞中心 ,XL -10 -GoldE.coli购自stratagene ,胎牛血清 ,细胞培养基DMEM、IMDM、MEM、Hepes均购自Gibco,PIRES -EGFP购自Clontech ,pGL3、荧光素酶检测系统、T4DNA连接酶购自Promega;BamHI等内切酶购自Takala。采用PCR和同尾酶的方法合成5拷贝HRE -CMV -mp,酶切连接构建荧光素酶低氧启动腺相关病毒载体 ;扩增提取病毒载体质粒、辅助质粒和Cap、Rep蛋白质粒 ;大量培养HEK293细胞 ;质粒磷酸钙共转染 ;转染48h收获病毒(氯彷 -PEG8000) ;测定生物滴度、物理滴度、电镜观察病毒和病毒蛋白电泳。测定低氧2 %和正常氧压下荧光素酶的效价。结果获取感染滴度2×1011的低氧启动腺相关病素 ,低氧6h荧光素酶表达量是正常氧压时的59倍。结论重组AAV病毒载体是通过对AAV病毒进行改造 ,将自身的编码基因去除 ,使其能装载治疗基因及表达元件而产生的。rAAV载体具有转染效率高、重复性强 ,不激活免疫反应 ,可重复应用 ,不诱导基因突变的优势。但腺相关病毒载体长期稳定表达目的基因     

CTLA4-Ig重组腺相关病毒载体的构建及转染表达效果

重组腺相关病毒 (recombinantadeno associatedvirus,rAAV)载体是目前基因治疗领域中倍受瞩目的载体之一。本研究通过构建CTLA4 Ig基因重组腺相关病毒载体 (rAAV CTLA4 Ig) ,研究其对大鼠转染的表达效果及规律。大肠杆菌Sure 2和 2 93细胞均由武汉同济医院心血管内科研究室提供 ;质粒pUF1 CTLA4 Ig、pXX2和pXX6由美国匹兹堡大学分子生物实验室XiaoX教授提供 ;近交系Lewis大鼠 ,2 0 0～ 2 5 0g,雄性 ,购自中国医学科学院实验动物研究所。仓鼠抗小鼠的CTLA4 Ig购自Pharm ingen公司 ,辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自Vec…     

重组人DcR3腺相关病毒的构建和表达

目的克隆人DcR3基因于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体pAAV-IRES-hrGFP中,以获得高感染滴度及纯度的重组人DcR3腺相关病毒,为将其用于感染移植肝,研究其对大鼠移植肝的保护作用打下基础。方法用基因重组的方法构建含全长人DcR3基因的重组腺相关病毒骨架质粒,利用脂质体法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞AAV-293细胞中,合成重组DcR3腺相关病毒,经PEG/氯仿纯化,用SDS-PAGE鉴定其纯度,扫描电镜观察病毒颗粒形态,倍比稀释法测定重组病毒的感染滴度。并用重组病毒感染COS-7细胞鉴定DcR3的表达。结果正确构建组装重组人DcR3腺相关病毒,纯化后病毒感染滴度为1.1×1010U/mL。在重组DcR3腺相关病毒感染的COS-7细胞上清液中检测到了DcR3的表达。结论成功构建了重组人DcR3腺相关病毒,为下一步研究DcR3对大鼠移植肝的保护作用打下基础。     

重组腺相关病毒对大鼠神经干细胞的体外转染及其对细胞生长的影响

目的 研究重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体对原代培养的神经干细胞（neural stemcells，Nsc）的体外转染及其对细胞增殖、分化和迁移能力的影响。方法 取新生24h内的Wistar大鼠的海马进行神经干细胞原代培养，用不同滴度的rAAV为载体，以增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因作为报告基因进行体外转染NSC，通过观察有绿色荧光的NSC的数量，测定rAAV对NSC的体外转染情况；用MTT法测定不同病毒滴度下rAAV对NSC增殖能力的影响，用免疫组化法鉴定NSC、神经元及神经胶质细胞，并在倒置荧光显微镜下直接测定细胞的迁移距离。结果 rAAV对NSC的体外转染效率随着病毒滴度的增加而提高，在转染后的第11天表达水平最高，用MOI为10^4、10^5、10^6的rAAV转染后第11天的转导率分别是9．81％、56．30％、64．67％；不同滴度rAAV转染NSC后不同时间点的MTT测定A值随着病毒滴度的增加而明显减小，差异均有统计学意义；但不同滴度rAAV转染NSC，其分化为神经元和神经胶质细胞的比率以及迁移的距离未见差异。结论 较高滴度（MOI为10^5和10^6）的rAAV可以在体外有效地转染神经干细胞，且不影响神经干细胞的分化和迁移能力，但对其增殖能力有明显抑制，并表现为病毒滴度依赖性。     

aFGF重组腺相关病毒转染内皮祖细胞

目的研究含分泌型人酸性成纤维细胞生长因子(sp-haFGF)基因的重组腺相关病毒(rAAV)感染内皮祖细胞(EPCs)的可行性。方法用PCR法将FGF-4的信号序列与原始的aFGF基因连接,形成sp-haFGF基因。将此目的基因克隆到AAV载体质粒pAAV-IRES-hrGFP中,并与包装质粒(pAAV-RC)和辅助质粒(pHelper)共转染HEK293细胞,获得编码sp-haFGF的重组腺相关病毒。用浓缩的病毒感染体外培养的EPC,荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白情况,并用RT-PCR和W estern b lot方法鉴定sp-haFGF在EPC中的表达。结果获得含有sp-haFGF的重组腺相关病毒,将其感染EPC后,约20%~30%的细胞出现绿色荧光。用RT-PCR法从被感染细胞中扩增出一条长约560 bp的基因条带,通过W estern b lot检测到被感染细胞中haFGF蛋白的表达。结论编码sp-haFGF的重组腺相关病毒能够有效地感染EPC,并在EPC中表达haFGF,为进一步研究转基因的内皮祖细胞移植促血管新生奠定基础。     

基因治疗中的腺相关病毒载体

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是基因治疗中最有希望的载体之一，它具有非致病性，对宿主免疫原性弱及广泛的细胞和组织亲嗜性等优点。本文综述了AAV在基因治疗中的最新研究进展，着重探讨了修饰AAv以改变它的亲嗜性及使用不同的启动子来进一步促进AAV在基因治疗中的应用。     

重组FoxP3腺相关病毒转染小鼠CD4+CD25 -T细胞的实验研究

目的：研究FoxP3（Forkhead Box P3）基因在小鼠T细胞的表达情况，以及重组FoxP3腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）对小鼠CD4^＋CD25^-T细胞功能的影响。方法：采用实时定量PCR检测CD4^＋CD25^-T细胞和CD4^＋CD25^-T细胞FoxP3 mRNA表达情况，利用基因重组技术构建FoxP3腺相关病毒载体，体外转染CD4^＋CD25^-T细胞，通过细胞增殖试验观察转染CD4^＋CD25^-T细胞功能变化。结果：CD4^＋CD25^-T细胞较CD4^＋CD25^-T相比高水平表达FoxP3基因mRNA，重组FoxP3腺相关病毒转染后的CD4^＋CD25^-T细胞对CD3单抗的刺激呈低反应性，并且能抑制新鲜分离CD4^＋CD25^-T细胞的增殖。结论：FoxP3基因转染的CD4^＋CD25^-T细胞在体外具有抑制T细胞活化增殖的功能。     

表达胰高血糖素样肽1重组腺伴随病毒载体的构建

背景：胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)在人体内半衰期过短限制了其应用。 目的：构建可表达GLP-1的重组腺伴随病毒。 方法：将NT4-GLP-1融合基因插入腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV中,构建pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒。采用磷酸钙共沉淀法将辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140及pSSHG/NT4-GLP-1转染至293细胞系,用其感染Hela细胞。 结果与结论：重组质粒pSSHG/NT4-GLP-1经限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定可见342 bp的目的片段,说明NT4-GLP-1融合基因已经成功重组于腺伴随病毒包装质粒pSSHG-CMV内。免疫细胞化学结果显示,转染pSSHG/NT4-GLP-1重组腺伴随病毒包装质粒的Hela细胞内有大量棕黄色颗粒,阳性率达到70%以上,说明NT4-GLP-1重组腺伴随病毒在细胞中可以表达GLP-1。     

Fiber-modified recombinant adenoviral constructs encoding hepatitis C virus proteins induce potent HCV-specific T cell response

Hepatitis C virus (HCV)-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) play an important role in HCV clearance. The frequency of HCV-specific T(CD8) in peripheral blood of HCV-infected donors is very low and HCV cannot be cultivated for reinfection of antigen presenting cells, making it difficult to detect T(CD8) of broad HCV specificities from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We have developed a recombinant adenoviral system that efficiently reactivates and expands HCV-specific CTLs from PBMCs of HCV-infected donors. Replication-incompetent adenoviruses expressing individual HCV proteins (core and NS3) were produced and PBMCs from HCV-infected donors were transduced with these recombinant adeno-HCV constructs to stimulate HCV-specific CTL populations. T cells expanded from adeno-HCV stimulated cultures were potent producers of HCV-specific IFN-gamma and TNF-alpha and efficiently lysed target cells pulsed with HCV peptides. These constructs could stimulate T(CD8) directed towards multiple HCV peptides while preserving the determinant hierarchy. This approach therefore overcomes some of the shortcomings of the selective expansion of CTLs with peptide-based vaccine strategies. These findings provide an effective approach for the expansion of HCV-specific CTLs from PBMCs of HCV-infected patients and have potential for immunotherapeutic/vaccine development.     

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒的构建

目的：构建柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。方法：用RT-PCR技术，从柯萨奇B4病毒中钓取非结构蛋白P2C cDNA片段，克隆入PUCan-T载体，转化大肠杆菌DH5α，构建重组质粒。结果：以柯萨奇B4病毒的总RNA为模板，扩增出987bp大小的片段，克隆入PUCan-T载体，用BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定，与非结构蛋白P2C的PCR扩增产物片段大小一致。结论：成功地构建了柯萨奇B4病毒非结构蛋白P2C重组质粒。     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

PEG-modulated column chromatography for purification of recombinant adeno-associated virus serotype 9

Column chromatography has been described for purification of recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) serotypes 1, 2, 5, 6 and 8. Some of these purification processes have been used in manufacturing pre-clinical grade and clinical grade rAAV vectors. Recently, recombinant AAV9 has been reported to be highly efficient in transducing cardiac muscle in animal models. Systemic or cardiac gene delivery and other applications may require large quantities of rAAV9 vectors, thus a scalable method supporting large scale purification of rAAV9 is needed for clinical development. However, column chromatography-based purification has not been reported to date for rAAV9. This study reports a polyethylene glycol (PEG) modulated chromatography process for purification of AAV9 vectors. Inclusion of PEG in chromatography buffers modulated rAAV9 elution profiles in a manner that resulted in significantly improved resin binding capacity, vector purity and yield. PEG-modulated methods were developed and optimized for hydroxyapatite and ion exchange chromatography, and shown to result in vectors of high purity and functional activity.     

新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

Study on the construction of recombinant plasmid coexpressing newcastle disease virus F protein and chicken IL-2

Study on the construction of recombinant plasmid coexpressing newcastle disease virus F protein and chicken IL-2     

新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.     

新城疫病毒HN基因真核细胞定位表达的重组质粒的构建

目的 构建定位表达于细胞不同部位的新城疫病毒HN(hemagglutinin-neuraminidase)基因.方法 应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以新城疫病毒D90株RNA为模板,分别扩增出含有HN基因全长和不含终止子的HN基因片段,将克隆的HN基因片段经双酶切后定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,经过定向插入组织凝血酶原激活物(tPA)的前导序列和/或A型流感病毒血凝素(HA)基因跨膜区(TM)片段进行修饰分别构建胞浆型、跨模型和分泌型DNA质粒.结果 所有重组质粒经酶切和测序鉴定插入正确.经过体外转染真核细胞,间接免疫荧光和SDS-PAGE蛋白质电泳检测,证明构建的新城疫病毒HN基因定位表达于真核细胞的胞浆、胞膜和细胞外.结论 成功构建了定位DOI:10.3760/cma.j.issn.1673-4394.2009.04.003作者单位:150040,哈尔滨医科大学附属肿瘤医院内科(隋红,李乐静,白玉贤);150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪病研究室(李曦,张永欣,肖晶,符芳)通信作者:李曦,E-mail:lx2005@126.com表达于细胞不同部位的HN蛋白的DNA质粒即胞浆型、跨模型和分泌型.