骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

背景：近年来骨髓间充质干细胞在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域备受重视,得到广泛研究。 目的：对骨髓间充质干细胞的生物学特性、体外分离、培养及鉴定方法及其临床学的应用进行综述。 方法：应用计算机检索1995-01/2010-01 CNKI数据库相关文章,检索词为“骨髓间充质干细胞,分离,培养,鉴定”,并限定文章语言种类为中文。同时计算机检索1995-01/2010-01 PubMed数据库相关文章,检索词为“bone marrow mesenchymal stem cells,isolation,cultivation,identification”,并限定文章语言种类为“English”。共检索到文献68篇,最终纳入符合标准的文献30篇。 结果与结论：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类非造血干细胞,易于获得和分离培养,且具有多向分化及高度增殖的能力。目前研究发现它具有分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经细胞以及肝细胞等多种类型细胞的潜能,已经成为重要的组织工程种子细胞。     

成人骨髓间充质干细胞对造血干细胞体外增殖的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（MSC）对脐带血（CB）CD34^＋细胞体外增殖和造血重建能力的影响。方法取人骨髓单个核细胞贴壁培养．梭形细胞完全融合后传代，用流式细胞仪检测免疫表型；将CBCD34^＋细胞接种到MSC或其他培养液中．比较不同培养条件对造血干细胞扩增能力、集落形成能力及黏附分子表达的影响。结果在加入IL-3的培养体系中．在MSC和细胞因子作用下，CD34^＋细胞扩增7d和14d后，有核细胞（NC）、CD34^＋细胞和CDl33^＋细胞数，实验组均显著多于对照组。CD34＋细胞在未加入IL-3的培养体系中培养8d后，实验组NC、CD34^＋细胞、CD34^＋CD38-细胞和造血祖细胞集落扩增倍数均显著高于对照组。扩增后CD34^＋细胞的ALCAM、VLA-α4、VLA-α5、VLA-β1、HCAM、PECAM和LFA-1表达较扩增前无显著变化。结论MSC可为造血干细胞（HSC）体外扩增提供适宜的微环境，有助于CD34^＋细胞体外增殖并抑制HSC分化，保持其造血重建潜能和归巢能力。     

山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的分离培养山羊的问充质干细胞，并为其在骨组织工程研究中的应用奠定基础。方法应用常规的密度梯度离心法结合贴壁培养法从山羊骨髓中分离间充质干细胞，并通过观察分离培养细胞的形态，检测其表面的CD分子表达，以及RT—PCR和免疫组化病理染色方法证实成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能来对细胞进行鉴定。结果分离的细胞具有成纤维细胞样形态，第三代细胞的表面分子CD29和CD44阳性率为98．70％、99．54％，而CD62L和CD45阳性率为1．10％和0．73％。RT-PCR和免疫组化病理染色证实分离细胞具有成骨、成软骨、成脂肪多方向分化潜能。结论成功地分离培养山羊的骨髓间充质干细胞，使山羊间充质干细胞应用于骨组织工程的研究成为可能。     

骨髓间充质干细胞的相关迁移机制

背景：基于骨髓间充质干细胞的多向分化潜能,促使其迁移至损伤部位,可对患者的康复起到极大的促进作用。 目的：通过国内外相关文献的综合分析,探讨细胞因子和炎症因子促进骨髓间充质干细胞迁移的作用机制。 方法：由第一作者应用计算机检索CNKI、Pubmed相关文献,英文检索词“BMSCs,chemotactic factor,migration”,中文检索词为“骨髓间充质干细胞,细胞因子,迁移”,排除重复性研究,计算机初检到68篇文献,最终保留23篇进行归纳总结。 结果与结论：骨髓间充质干细胞具有强大的分化潜能,在临床疾病治疗中起到了巨大的辅助作用,同时鉴于该细胞取材简单、方便,易于体外培养,所以就其增殖、分化、迁移的研究实属国内外热点。相关细胞因子的干预,促使骨髓间充质干细胞的迁移加强,这就使得细胞因子对该细胞的促迁移研究极具价值。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低,体外培养难度较大。体外分离培养纯度高、活力强、生物特性均一的间充质干细胞,对组织工程及细胞的体内、体外实验显得至关重要。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,细胞周期分析,流式细胞仪检测细胞表面标记物,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 结果与结论：大鼠骨髓间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列的细胞集落,细胞生长旺盛,可连续稳定传代10代以上。生长曲线及细胞周期显示骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特征且生长活跃。第3代骨髓间充质干细胞CD44,CD90,CD105均呈阳性表达,而CD34,CD45呈阴性表达。成脂、成骨诱导后,油红O染色、碱性磷酸酶染色、von Kossa法染色和茜素红染色均呈阳性。全骨髓贴壁培养法操作简单,可大量分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。实验所用的全骨髓贴壁法法为组织工程提供充足的种子细胞来源具有重要的现实意义。     

人脐血间充质干细胞移植修复骨髓造血损伤

文题释义：间充质干细胞：是一种多功能干细胞,由胚胎发育早期的中胚层发展而来,存在于人的各种组织、器官中,如骨、软骨、脂肪、外周血和肌肉等。骨髓组织中的间充质干细胞最多,但其在骨髓细胞中的比例仍很低,只有0.01%-1.00%,且年龄越大其含量越少,骨髓中的间充质干细胞分化能力也呈下降趋势。与骨髓相比,脐血中所含的间充质干细胞更加原始,因而有更强的增殖、分化能力。相较于骨髓间充质干细胞而言,人脐血间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、无伦理方面的限制,使得人脐血间充质干细胞成为再生医学中的另一重要来源。骨髓造血损伤动物模型：建立骨髓造血损伤动物模型的方法有很多,主要分为物理方法、化学方法及物理化学方法等。物理方法包括各种射线,如X射线等,化学方法主要指以环磷酰胺为代表的烷化剂类化疗药物,而物理化学方法也叫混合性方法,联合应用放射线和化疗药物建立动物模型。  摘要背景：大多数研究间充质干细胞体外培养对造血干细胞的增殖作用和骨髓间充质干细胞移植可降低辐照引起的造血细胞死亡,增加骨髓细胞存活,修复造血功能,而少有研究人脐血间充质干细胞移植对骨髓造血损伤的修复。目的：探讨人脐血间充质干细胞对骨髓造血微环境的修复情况。方法：选用雄性BALB/c小鼠随机分为3组,实验组和对照组小鼠进行总剂量为6 Gy的X射线全身照射,建立骨髓造血损伤模型,正常组为未经处理的正常小鼠。实验组小鼠照射当天经尾静脉输入CM-DiL标记的人脐血间充质干细胞5×10⁶/只(0.2 mL),对照组和正常组经尾静脉输入生理盐水0.2 mL,移植后第1,5,7,14,21天观察外周血血象恢复情况和骨髓造血微环境修复情况。结果与结论：①外周血常规：移植后第1,5,7天,实验组和对照组小鼠与正常组小鼠比较,白细胞、血小板、红细胞计数及血红蛋白浓度进行性下降,第7天下降最为明显,移植后第14天三系较前有所恢复,移植后第21天基本恢复正常,与实验组相比,对照组三系下降更为明显,移植后第14天实验组较对照组恢复快;②骨髓涂片情况：移植后第1,5,7,14天实验组及对照组小鼠骨髓出现造血功能抑制,以第7天最为明显,移植后第14天骨髓增生较前有所恢复,实验组优于对照组;移植后第21天实验组及对照组小鼠骨髓造血功能恢复,与正常组相比无差异;③骨髓病理切片情况：移植后第1,5,7,14天实验组及对照组小鼠骨髓出现造血功能抑制;移植后第14天实验组及对照组小鼠的骨髓造血功能较前开始恢复,实验组小鼠的骨髓增生情况优于对照组小鼠, 移植后第21天实验组及对照组小鼠骨髓增生情况与正常组比较无差异;④结果表明,人脐血间充质干细胞对骨髓造血功能恢复均有明显促进作用。ORCID: 0000-0002-7547-9664(高坤莉) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展

背景：骨髓间充质干细胞标记及示踪技术是干细胞移植治疗的研究热点之一。虽然近几年骨髓间充质干细胞标记及示踪技术有了很大进展,但仍存在很多问题有待进一步解决。 目的：对国内外骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的研究与进展作一综述。 方法：应用计算机检索CNKI和Foreign Medical Journal Service数据库中1982-01/2011-10关于骨髓间充质干细胞标记及示踪技术的文章,在标题和摘要中以“骨髓间充质干细胞;标记方法;示踪技术”或“bone marrow,labeling,Tracer”为检索词进行检索。最终选择29篇文献进行综述。 结果与结论：骨髓间充质干细胞的示踪技术众多,主要有同位素示踪法、抗原标记法、荧光蛋白标记法、荧光染料标记法、核磁共振对比增强剂标记法、Lac-Z基因标记法、Y染色体标记法。每一种方法都有其优缺点,选择的标记方法应具有特异性强、灵敏度高、对细胞或机体影响小、标记和检测方法简单易行、标记时间合适等特点。种子细胞的示踪技术仍需要进一步深入研究。     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的建立

目的建立培养小鼠骨髓间充质干细胞(none mesenchymal stem cells,BMSCs)的分离培养方法。方法采用全骨髓体外分离并采用差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠BMSCs,形态学观察细胞生长情况,流式细胞仪检测其表面抗原情况并观察其多项分化潜能。结果使用该方法纯化扩增的BMSCs形态均一,生长良好,表达CD29、CD44和Sca-1,不表达CD11b、CD45和CD34,并具有成骨成脂潜能。结论通过全骨髓贴壁法可以成功的分离培养出小鼠BMSCs。     

两个不同骨髓干细胞亚群体外成肝潜能的比较研究

目的研究与比较骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSCs)和间充质干细胞(mesen-chymalstemcells,MSCs)肝分化潜能。方法常规法分离培养大鼠骨髓MSCs。以Thy-1.1为标志,免疫磁珠法(magenicactivatedcellsorting,MACS)分离纯化HSCs。探寻MSCs、HSCs的诱导条件,从形态学、RT-PCR和免疫细胞化学法鉴定肝分化结果。结果MACS分选后Thy-1.1 细胞纯度94.20%,细胞活力99.62%。纤维状MSCs诱导后呈圆形,表达白蛋白及其mRNA,不表达甲胎球蛋白。诱导的HSCs为多角形,白蛋白表达逐渐减少,甲胎球蛋白表达逐渐增强。结论MACS方法能有效分选大鼠骨髓Thy-1.1 干细胞群。MSCs和HSCs二者具有不同的肝系分化潜能。MSCs在HGF/FGF-4的作用下表达成熟肝细胞的特异性基因,分化为成熟肝细胞样细胞;HSCs在HGF/FGF-1/FGF-2的作用下表达早期肝特异性基因,分化为肝干细胞样细胞。     

骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用

背景：在一定条件下骨髓间充质干细胞具有分化为成骨细胞、软骨细胞的特性,成为骨组织工程中研究最为深入的种子细胞。 目的：对骨髓间充质干细胞在骨缺损中的基础研究与临床应用进展作一综述。 方法：应用计算机检索CNKI和Pubmed数据库中1999年1月至2012年1月关于骨髓间充质干细胞应用于骨缺损治疗的文章,在标题和摘要中以“骨髓间充质干细胞,骨缺损”或“ Bone mesenchymal stem cells,bone defect”为检索词进行检索。选择文章内容与骨髓间充质干细胞治疗骨缺损有关者,同一领域文献则选择近期发表或发表在权威杂志文章。最终选择30篇文献进行综述。 结果与结论：骨髓间充质干细胞分离获取方法成熟,具有成骨细胞定向诱导分化能力,能有效地进行骨质缺损修复,尤其随着生物支架材料和基因工程技术的发展,骨髓间充质干细胞在骨缺损治疗中的应用必将更加广泛。     

骨髓间质细胞中组织定向干细胞的鉴定

目的:验证骨髓中存在组织定向干细胞(TCSCs),为心血管组织工程提供理想的种子细胞来源。方法:采用SDF-1α梯度趋化从骨髓中分离CXCR4阳性细胞,免疫细胞化学法检测CXCR4与PDGFR-β表达,流式细胞仪检测PDGFR-β阳性细胞,从而确定平滑肌祖细胞(SMPCs)的比例;从骨髓分离培养内皮祖细胞(EPCs),免疫细胞化学和流式细胞仪检测FLK-1、CD34、CXCR4与vWF的表达情况。结果:SDF-1α趋化分离出的细胞几乎都为CXCR4阳性,其中4·67%的细胞呈PDGFR-β阳性;EPCs形态圆形或近三角形贴壁生长,原代细胞CXCR4、VEGFR-2、CD34明显阳性,传代细胞vWF阳性。结论:在骨髓基质细胞中存在SMPCs和EPCs等TCSCs。     

年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能

目的:诱导年轻与年老小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)融合,探讨融合后年轻BMSCs对年老BM-SCs功能的影响。方法:年轻(2-3月龄)及年老(18-24月龄)C57BL/6小鼠BMSCs在红色荧光染料PKH26标记后分别与年轻及年老绿色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠BMSCs通过聚乙烯二醇(PEG1500)诱导,建立细胞融合模型。通过流式细胞仪鉴定细胞融合率和细胞表面特异性抗原的表达。免疫荧光显微镜观察融合细胞形态及细胞核特性。通过细胞计数比较5组细胞(年轻组Y,年老组O,年轻融合组Y-Y,年轻年老融合组Y-O,年老融合组O-O)在2d、4d、6d、8d的细胞增殖能力。诱导细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化,比较5组细胞的分化能力。结果:通过PEG诱导,可获得30.45%±4.13%的融合细胞,3组不同年龄融合组的细胞融合率无显著差异。融和细胞表达间充质干细胞表面特异性抗原CD44、Sca-1,而不表达造血干细胞表面特异性抗原CD34、CD117、CD31、CD45。在2d、4d、6d、8d,Y-O组细胞数量增加百分率比O-O组均显著增高。代表成骨细胞分化能力强弱的茜素红染色阳性率和代表脂肪细胞分化能力强弱的油红O染色阳性率,Y-O组比O-O组均显著增高,具体数值分别为:(25.46%±1.52%)vs(13.85%±1.69%),P0.01;(12.99%±2.61%)vs(6.03%±1.71%),P0.05。结论:年轻BMSCs可通过细胞融合改善年老BMSCs增殖及分化功能。     

Biology of human bone marrow stem cells

The bone marrow is constituted of two separate and distinct stem cells. The hematopoietic stem cells (HSC) are responsible for the production and maintenance of all the mature blood cells. The mesenchymal stem cells constituted the bone marrow stroma. In this report we review our current understanding on both stem cell populations. We also discuss the recent unexpected degree of differentiation plasticity that have been reported recently and the impacts these new discoveries may have in stem cell therapy.     

Biology of human bone marrow stem cells

Abstract. The bone marrow is constituted of two separate and distinct stem cells. The hematopoietic stem cells (HSC) are responsible for the production and maintenance of all the mature blood cells. The mesenchymal stem cells constituted the bone marrow stroma. In this report we review our current understanding on both stem cell populations. We also discuss the recent unexpected degree of differentiation plasticity that have been reported recently and the impacts these new discoveries may have in stem cell therapy.     

Human bone marrow native mesenchymal stem cells

The adult bone marrow (BM) has been generally considered to be composed of hematopoietic tissue and the associated supporting stroma. There is accumulating evidence that a subset of multipotential cells exists within the latter compartment, commonly referred to as mesenchymal stem cells (MSCs). These cells can be easily expanded ex vivo and induced to differentiate into skeletal connective tissues, thereby emerging as attractive candidates for various therapeutic applications. Despite the extensive in vitro characterization of MSCs, at present, little is known about their in vivo properties or anatomical location. Here we review the efficacy of the different surface markers used to isolate BM MSCs and highlight current data suggesting that BM MSCs in situ are associated with vascular sinus walls and probably belong to the family of vascular smooth muscle cells.     

Reimmigration of bone marrow stem cells in rats

One limb (crus) or all four limbs in rats were irradiated with x-rays in a dose of 1500 R, sufficient to inactivate bone marrow, and 3, 24 h, or 6 days later the rest of the body was irradiated in doses of 800 or 900 R, the previously irradiated region being screened. The percentage of rats which survived was the same as when the unirradiated limbs were screened. It was suggested that stem cells migrate from the unirradiated bone marrow into its irradiated part (the crus), in which they survive and are able to migrate again (reimmigrate) in the case of subsequent irradiation of the rats in a lethal dose with screening of the limb. Rats differ from mice in the greater severity of their intestinal syndrome, which depends only to a small extent on migration of stem cells. It is therefore best to judge the effectiveness of stem cell migration chiefly on the basis of survival of the animals during the period of bone marrow death. It can be concluded from analysis of the mortality of the rats in this period that their survival, based on reimmigration after screening of one limb, with a three-hour interval between irradiations, is only half that of mice. Reimmigration of stem cells thus takes place in the rats just as in mice, but it plays a significant role in rats only if the volume of previously irradiated and subsequently screened bone marrow is greater or if the time interval between irradiations is longer.Central Roentgeno-Radiologic Scientific-Research Institute, Ministry of Health of the USSR, Leningrad. (Presented by Academician of the Academy of Medical Sciences of the USSR V. N. Chernigovskii.) Translated from Byulleten' Éksperimental'noi Biologii i Meditsiny, Vol. 87, No. 6, pp. 589–591, June, 1979.     

Effect of cytostatics on bone marrow stem cells

Morphological composition of the bone marrow, content of hemopoietic precursors, intensity of their proliferation and differentiation, and the size of mesenchymal precursor pool were studied in experiments on CBA/CaLac mice with myelosuppression induced by adriamycin, cyclophosphamide, or 5-fluorouracil in the maximum tolerated doses. The dynamics of changes in the content of granulomonocyte precursors in the bone marrow after cytostatic treatment was similar to that of erythroid precursors. Changes in the content of stromal mechanocytes were specific for each cytostatic. Different character of the reaction of the hemopoietic and mesenchymal stem cells to the test cytostatics was demonstrated.__________This revised version was published online in July 2005 with the addition of the issue title and article categoryTranslated from Kletochnye Tekhnologii v Biologii i Meditsine, Vol. 1, No. 1, pp. 20–24, January, 2005     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化

背景：以骨髓间充质干细胞构建组织工程气管尚缺乏理想的特异性表面标志物,对其鉴定主要依赖细胞形态学、细胞表型及诱导分化的功能进行分析。 目的：体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞,观察在特定条件下向气管软骨细胞分化的潜能。 方法：无菌环境取兔骨髓,经全骨髓贴壁筛选法分离培养细胞至第2代,流式细胞术鉴定第1、第2代细胞表面抗原CD44、CD45的表达。无菌环境取气管,经酶消化法分离培养气管软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞蛋白聚糖的合成。在使用转化生长因子β1的基础上,将骨髓间充质干细胞与气管软骨细胞通过Transwell小室非接触式共培养,倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色鉴定蛋白聚糖的合成,荧光实时定量PCR鉴定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA的表达。 结果与结论：分离、培养的细胞呈长梭形、不规则形聚集生长,传代后细胞生长速度明显增快,呈鱼群状聚集生长。第1代有96.97%的细胞表达CD44、13.72%的细胞表达CD45,第2代有99.11%的细胞表达CD44、8.54%的细胞表达CD45。气管软骨细胞甲苯胺蓝染色阳性。在诱导后,骨髓间充质干细胞形态逐渐由长梭形变为三角形或不规则形,表达软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖 mRNA基因,甲苯胺蓝染色示阳性。结果表明全骨髓贴壁筛选法可成功分离培养骨髓间充质干细胞,第2代纯度较高,且在特定诱导条件下具有分化为气管软骨细胞的潜能。